用变性和非变性溶液从肉和鱼中提取肌肉蛋白的方法

摘要

本研究的目的是测试两种提取方法，包括对来自不同物种的肉类和鱼类的肌肉的肌原纤维蛋白的提取和分离不同离子强度的解决方案。从肉类样品最长胸外科牛肉和羊肉的肌肉，胸大肌鸡的肌肉，并从单一的鱼背白肌（鳎SOLEA），欧洲鳕鱼（欧洲无须鳕），鲈鱼（粗养）进行了分析。使用导致了高分子量蛋白如肌球蛋白重链的一个主要非变性提取液中的提取方法，α辅肌动蛋白，和结;相反，变性方法提供的蛋白质和片段的低分子量为肌动蛋白，肌钙蛋白T，原肌球蛋白，和肌球蛋白轻链1和2克的蛋白质为最肉类和鱼类样本良好的蛋白质提取性。的非变性提取方法表明导致省时省力并在尽量减少使用有毒和污染剂的几个优点。

1.介绍

根据在骨骼肌中的位置和溶解性，肌肉蛋白被分为肌浆蛋白、间质蛋白和肌原纤维蛋白三类。肌原纤维蛋白是骨骼肌的主要成分，约占总蛋白的50%，主要由肌球蛋白和肌动蛋白组成，参与肌肉收缩。由于其结构和本地化[1]，肌原纤维蛋白需要变性条件下，例如，高离子强度溶液中被溶解和萃取[2]。位于肌纤维肌浆内的肌浆蛋白被认为可溶于水或低离子强度的溶液，而基质蛋白，如胶原蛋白和弹性蛋白，据报道在高盐溶液中不溶[3]。

蛋白质组学技术已被广泛应用于分离，鉴定，并在动物食品鉴定蛋白质[4，五]。样品制备和提取都在电泳分析获得可靠的结果[最关键的步骤6]。肌肉蛋白质的提取方法的选择对于获得具有高蛋白质浓度和游离的盐和其它干扰因素，如脂质样品，这可能与电泳分析干扰是必不可少的。对于肌原纤维蛋白提取最常用的程序涉及变性含有脲，硫脲，还原剂（DTT，β-巯基乙醇），洗涤剂（SDS，十二烷基硫酸钠）溶液，和盐[7，8]。然而，必须考虑的是，使用这些试剂被认为是有毒的，高污染和需要适当的处置程序。陈等人。[9]报道从骨骼肌提取和肌原纤维蛋白的溶解使用水或低离子强度的介质。据我们所知，没有研究可在变性和非变性的解决方案的抽提能力的比较。在这种考虑的光，本研究的目的是提供两种方法来提取和肌原纤维蛋白，包括带有在肉类和鱼类的肌肉不同离子强度的溶液的分离之间的比较。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

在实验中使用的所有试剂均为分析纯。氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，脲，硫脲，二硫苏糖醇，胆酰胺丙基二甲基羟基丙磺酸盐（CHAPS），IGEPAL？CA-630 NP 40，甘油，和三购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，MO，美国）购买。丙烯酰胺，双丙烯酰胺，过硫酸铵（APS），N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED），十二烷基硫酸钠（SDS），三（羟甲基） - 氨基甲烷，甘氨酸，溴酚蓝，β巯基乙醇，和考马斯亮蓝G-250购自Bio-Rad实验室（大力神，CA）购买。

Phosphate buffer (pH 7, 0.003 M), KCl phosphate buffer (pH 7.5), and Tris-HCl (pH 8, 20 mM) were freshly prepared. Ultrapure water was obtained in the laboratory using a Water Purification System Barnstead™ Pacific TII (ThermoFisher Scientific, USA).

2.2。样品采集和准备

从肉类样品最长胸外科牛肉和羊肉的肌肉;胸大肌鸡的肌肉;和背鱼的白肌从鞋底（鳎SOLEA），欧洲鳕鱼（欧洲无须鳕），鲈鱼（粗养）从当地市场购买，并在冷藏条件下立即转移到实验室。对于每一个物种，共15只动物被列入实验。脂肪和结缔组织从肉样品取出，而骨头，体重秤和脂肪是从鱼类样品丢弃。所有新鲜的样品进行精细之前蛋白提取切碎。

2.3。蛋白质提取方法

来自不同物种肌肉的蛋白质级分的提取的流程图进行分析显示于图1。基于不同溶解度的肉和鱼的蛋白质进行分级。Samples were homogenized with 0.03 M phosphate buffer (pH 7) containing a protease inhibitors cocktail (P2714, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) on ice for 2 min using an Ultra-Turrax T18 basic (IKA, Wilmington, Germany). The homogenate was centrifuged at 8,000 ×(Eppendorf 5810R, Eppendorf AG, Hamburg, Germany) for 20 min at 4°C. After centrifugation, the supernatant (sarcoplasmic proteins) was discarded, and the extraction of myofibrillar proteins were obtained as follows.

两种不同的提取方法，使用变性和非变性的解决方案，肌原纤维蛋白进行。肌原纤维蛋白与非变性溶液提取基于由Hashimoto等人报道的方法。[10] with the modifications reported as follows: the pellet recovered was resuspended in 10 volumes of KCl phosphate buffer pH 7.5 (0.45 M KCl, 15.6 mM Na₂HPO₄，3。五 mM KH₂PO₄)和涡流2分钟。涡流步骤是为了优化球团的均匀化和防止形成成熟的络合物。以5000倍的速度离心2次(Eppendorf 5810R, Eppendorf AG, Germany) for 15 min at 4°C. After centrifugation, the supernatant containing the myofibrillar proteins was recovered, aliquoted, and frozen at −80°C.

为了比较，使用变性溶液如诺等人的提取肌原纤维蛋白。[11]。Briefly, the pellet was resuspended in a solution (8.3 M urea, 2 M thiourea, 64 mM dithiothreitol (DTT), CHAPS 2% (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate), IGEPAL 2%, glycerol 10%, and 20 mM Tris-HCl, pH 8) and incubated overnight at 4°C in an orbital shaker. Subsequently, samples were centrifuged at 15,000 ×(Eppendorf 5810R, Eppendorf AG, Germany) for 20 min at 10°C. After centrifugation, the supernatant containing myofibrillar proteins was recovered, aliquoted, and frozen at −80°C until further protein analysis to avoid calpain protease activation.

对于每个种类，用不同的方法获得的肌原纤维的所有提取物使用Bradford蛋白测定（Bio-Rad实验室，赫拉克勒斯，CA）进行定量。Absorbance was measured at 580 nm by the spectrophotometric assay (Power Wave XS, Biotek, UK), with a bovine serum albumin (BSA; >98% pure, Sigma-Aldrich) standard curve.

2.4。SDS-PAGE分析

通过变性或非变性方法得到的各物种的肌原纤维15级的萃取物合并，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳在梯度凝胶8-18％[11]。凝胶装了50个μ使用Protean II xi垂直平板凝胶单元(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)运行。考马斯亮蓝G-250用于观察感兴趣的条带。凝胶被置于乙酸和甲醇的水溶液中(分别为10% v/v和7% v/v)，由ChemiDoc EQ系统(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)获得。使用quantity One软件(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)确定每个频带的相对数量为车道上所定义频带信号强度的百分比。通过与精密度加蛋白标准-宽范围(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)的比较来鉴定蛋白质的分子量。

2.5。统计分析

蛋白浓度和电泳数据采用SAS统计软件的GLM程序进行分析[12]。研究了提取方法对牛肉、羊肉、鸡肉、比目鱼、鳕鱼和鲈鱼肌肉蛋白肌原纤维组分的影响。当发现有显著差异时(at ）学生T-测试是用来定位装置之间显著差异。

3。结果与讨论

3.1。蛋白质可浸提

溶解度是蛋白质可提取的指标;的确，一个溶解蛋白可以很容易地提取到从肌纤维或肌原纤维[溶液9]。肌原纤维蛋白的提取量使用变性和非变性牛肉，羊肉，鸡肉，鞋底，欧洲鳕鱼，鲈鱼解决方案图报2。没有差异的牛肉，欧洲鳕鱼和鲈鱼的蛋白质萃取发现当不同的提取方法进行了测试，证明导致成功的蛋白提取作为变性提取方法，它非变性提取方法。通过反复离心施加的物理力损坏肌原纤维蛋白部分地允许肌原纤维蛋白的在水中的溶解的结构。

与此相反，在变性溶液的提取能力似乎是羊肉，鸡肉，和鞋底更高效与羊肉和鸡肉和比非变性溶液鞋底高约10％的约30％提取肌原纤维蛋白的量。已知的是，蛋白质从骨骼肌提取是由提取的参数的影响，由组织结构一个复杂的现象，并且通过事后肌肉的转变期间发生的变化[13]。通过在羊肉，鸡肉，和鞋底样品变性溶液肌原纤维蛋白的更大的萃取性可能是由于肌肉的类型和结构[14]，这表明溶解的动力可能是种属特异性。

3.2。肌纤维分数

用变性和非变性肉类和鱼类的解决方案中提取的肌原纤维部分的光密度分布和SDS-PAGE被显示在图3和4， 分别。通过与良好定义的频带的电泳轮廓和不存在的任何污染物（例如，脂质）作为既表现出提取方法提供肌原纤维蛋白的适当的分离和衍生的片段。In meat samples, the main protein bands identified in the range of molecular weights from 250 to 10 kDa were myosin heavy chain (MHC),α辅肌动蛋白（α-act），结蛋白，肌动蛋白（ACT），肌钙蛋白T（TNT），原肌球蛋白（TPM），肌球蛋白轻链1（MLC1），肌钙蛋白C（TNC），和肌球蛋白轻链2（MLC2）。相反，鱼的样本进行电泳分布图显示没有肌钙蛋白复杂的。However, all species analyzed showed protein fragments in the molecular weight ranging from 180 to 110 kDa, from 95 to 55 kDa, from 51 to 47 kDa, from 40 to 38 kDa, from 33 to 23 kDa, from 21 to 18 kDa, and from 14 to 10 kDa and bands at 39 and 16 kDa.

SDS-PAGE的光密度分布显示，以在非变性曲线使用32导致了更复杂的简档中提取频带和片段（30，32的数量而言的变性溶液中，并且比26，图27和28分的频带的肉样品和35，29，和30比31，26，并且在鱼样品的非变性轮廓28个频带）而采用非变性溶液的揭示对于大多数肌原纤维蛋白的主要强度进行分析。

使用非变性和变性肉类和鱼类的解决方案图报告中提取的主要肌原纤维蛋白的百分比五和6， 分别。与非变性溶液萃取所有样品显示MHC的最高值（牛肉，羊肉，鸡肉，鞋底，和欧洲的鳕鱼;在鲈鱼),α辅肌动蛋白（羊肉;牛肉、鸡肉和鳎目鱼;欧洲鳕鱼），和结（在牛肉;在鲈鱼;羊肉，而不是在欧洲鳕鱼检测）。

已知的是，肌球蛋白主要有助于肌肉的拉伸强度，而α辅肌动蛋白和肌间线蛋白是负责维护的肌动蛋白在Z磁盘长丝[结构和机械完整性细胞骨架蛋白15]。在任何情况下，无论所有这些蛋白质的相对数量减少是由于蛋白质水解、变性或两者的结合，desmin也被认为是一些鱼类新鲜度的标志[16]。在本研究中，使用具有低离子强度的溶液中，在非变性提取方法，导致这些蛋白质具有高分子量的主要提取。

盐溶法中溶液的pH值似乎有利于蛋白质的提取。因此，Chen等人[2] reported a greater solubilization of myosin using a 0.6 M KCl solution pH 6.0 due to myosin filament dissociation induced by low ionic strength of the buffer solution. The reduction of salt content in the nondenaturing solution could have led to a modification of the physiological conditions of protein due to change of pH improving the solubility of proteins with high molecular weight.

The use of denaturing solutions led to a major extractability of myofibrillar proteins with low molecular weight (under 45 kDa) as actin (在羊肉、欧洲鳕鱼和鲈鱼中，肌钙蛋白T (牛肉，羊肉，鸡肉，鳕鱼欧洲和鲈鱼），原肌球蛋白（牛肉和羊肉;欧洲鳕鱼和鲈鱼），MLC1（牛肉和羊肉和鸡肉），和MLC2（在羊肉和鲈鱼;牛肉，鸡肉，和鞋底）的蛋白质。在鱼类样本的MLC1的两种提取方法之间没有发现显著差异。

这些结果可能是由于该化合物，例如脲，硫脲，CHAPS，和变性溶液的DTT。已知的是，尿素是一种离液剂，在氢键的断裂效率，通过破坏氨基酸残基[之间非共价和离子的联系使蛋白质变性17]。硫脲确实可以打破疏水相互作用，从而增加膜蛋白的溶解[18]。之前的学习 [19，20]报道，尿素和硫脲表现出优异的增溶能力的组合，并大幅提高蛋白质的提取。此外，CHAPS和DTT影响蛋白质溶解，因为它防止疏水性相互作用和促进二硫键通过聚集或沉淀[避免缺乏蛋白质的再氧化21]。在萃取溶液中的变性的化合物的存在导致增加与低分子量大概肌原纤维蛋白的提取的由于在蛋白质分子大小，构象，和间和分子内键的差异，从而导致更多的灵敏度的提取强度变性方法。

4.结论

非变性和变性提取方法均能有效地溶解主要肌肉蛋白。蛋白质组学分析显示，所有分析样本均有良好的蛋白分离，条带清晰，无任何污染。采用非变性溶液的提取方法主要提取高分子量的肌原纤维蛋白;相反，对于大多数肉和鱼样品，变性方法提供了较好的蛋白质和低分子量片段的可提取性。

的非变性提取方法表明几个优点，例如容易进行，创伤小，和最小的使用有毒，污染剂。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

利益冲突

作者宣称，有感兴趣的关于这篇文章的发表任何冲突。

致谢

在项目中“提高肉嫩通过生态友好型战略”：这项工作是由福贾大学（丰迪每PROGETTI迪Ricerca迪雅典耀FPRA）的支持。

参考

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