利用重组Sox2蛋白进行细胞重编程

摘要

诱导多能干细胞(iPS)细胞代表了一个有吸引力的选择，用于细胞替代疗法和疾病建模的患者特异性多能细胞。要想在临床上有意义，需要产生安全的iPS细胞，不表现出由重编程转基因的病毒整合引起的永久性基因修饰。最近，各种实验策略被用于完成iPS细胞的无转基因衍生，包括使用非整合病毒、episomal表达，或通过位点特异性重组酶或转座酶重编程后切除转基因。诱导重编程因子的一个直接方法是直接传递合成的mRNA或生物活性蛋白。我们之前报道了Oct4 (Oct4- tat)和Sox2 (Sox2- tat)的细胞渗透版本的产生，并表明Oct4- tat具有重编程能力，即它可以替代Oct4编码病毒。在这里，我们探索了增强Sox2-TAT蛋白稳定和功能传递到体细胞的条件。我们发现，在血清替代或低血清补充的培养基中，富含脂质的白蛋白可以稳定细胞渗透的Sox2蛋白。采用优化的蛋白传递条件，我们证明了Sox2- tat蛋白可以替代病毒Sox2。Sox2-piPS细胞表达多能性相关标记，并分化到所有三个胚层。

1.介绍

多能细胞是再生医学中的细胞修复和基础生物医学研究中的疾病建模的最具吸引力的来源，因为它们能够分化成成人生物体的每一种细胞类型。直到最近，早期胚胎发育阶段是多能细胞的主要来源，因此，这些细胞被指定为胚胎干细胞(ES)细胞。如今，从体细胞中人工提取多能干细胞变得越来越重要。诱导多能干细胞(iPS)是通过逆转录病毒诱导四种转录因子Oct4、Sox2、Klf-4和c-Myc在体细胞中的异位表达而产生的[1］．人类iPS细胞代表了一个有吸引力的选择，为衍生多能的患者特异性细胞，因为它们的生成不需要胚胎。然而，为了产生临床有用的人类iPS细胞，必须解决关键的安全问题。在小鼠细胞中发现病毒重编程协议后不久[1]及其对人类细胞的适应能力[2，3.]，如肿瘤发生[4变得明显。

由于肿瘤形成的原因被归结为逆转录病毒载体的随机整合和重编程后转基因的持续表达，因此我们探索了优化方案，以避免外源DNA永久整合到基因组中。一种策略是利用DNA重组酶切除重编程转基因[5，6或转座酶[7- - - - - -10］．iPS衍生后，通过第二轮重组酶/转座酶激活可以删除转基因。然而，需要进一步费力和繁琐的遗传方法来识别和确认无转基因iPS克隆。另一种策略是利用不与宿主基因组整合的侵袭性较小的基因载体。重复质粒转染已被用于诱导iPS，尽管效率非常低[11］．据报道，具有高转染效率和长异位表达的缺乏细菌DNA的微圆载体也被重编程[12］．此外，利用病毒的转导不会将其基因组整合到宿主细胞中，如腺病毒[13]或仙台病毒[14)应用。小分子能够转移到细胞中并干扰关键信号通路，已经被识别出来，它们要么增强了重编程的过程[15，16]或替换[15，17]单一病毒因素（有关综述，请参见[18])。合成mRNA的重复转染[19- - - - - -21]或直接递送重编程蛋白[22，23]表示直接但技术上具有挑战性的方法，以实现非遗传性IPS推导。

蛋白质转导技术已被用于通过所谓的细胞穿透肽（CPPs）或蛋白质转导结构域（PTDs）修饰多种生物活性蛋白质，将其直接输送到哺乳动物细胞中。这些相对较小的肽在与货物分子连接时赋予细胞通透性（有关综述，请参阅[24- - - - - -26])。一种高度碱性的CPP人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) Tat (transactivator of transcription)蛋白常用于细胞递送(Tat) [25- - - - - -28］．PTDs已被用于生成在细胞分化中起主要作用的各种转录因子的细胞穿透版本，包括HoxB4 [27], Pdx1 [28], sci [29], Nkx2.2 [30.]，以及Notch-ICD [31］．我们之前报道了重编程因子Oct4和Sox2的细胞渗透版本的来源[22］．Oct4- tat和Sox2- tat被证明与DNA特异性结合，如Nanog启动子中的Oct4/Sox2组合元件，两种蛋白在直接递送到ES细胞后补偿rnai诱导的功能损失[22］．此外，通过使用Sox2- tat，已经证明Sox2通过促进滋养外胚层谱系的建立，在着床前小鼠胚胎中具有重要的功能[32］．Zhou等使用了来自重组因子的融合蛋白衍生物大肠杆菌用于小鼠类es细胞的衍生，尽管效率非常低[23］．Kim等人报道了使用转染HEK293细胞的细胞提取物对人类新生成纤维细胞进行重编程[33］．最近报道使用ES细胞提取物在小鼠成纤维细胞中诱导多能性[34需要探索它是否能适应人类细胞。总之，从人成年细胞生成蛋白诱导iPS细胞的健壮、标准化和高效的方案仍然需要开发。

进一步优化用于细胞重编程的蛋白转导，在很大程度上取决于克服与蛋白转导相关的一个主要瓶颈:重组因子在细胞培养条件下的稳定性。我们最近建立了优化的Oct4-TAT稳定条件，并证明了重组Oct4-TAT对oct4编码病毒的有效替代[36］．在这里，我们探索了增强Sox2-TAT蛋白稳定和转运到体细胞的条件。我们发现，在血清替代或低血清补充的培养基中，富含脂质的白蛋白可以稳定细胞渗透的Sox2蛋白。利用这些条件进行蛋白传递，我们证明了Sox2- tat蛋白能够替代病毒Sox2。

2。材料和方法

2．1．蛋白表达与纯化

psame - sox2nth表达质粒[22变成了大肠杆菌BL21 (DE3)金菌株(Stratagene, La Jolla, USA)， 30℃热休克，30℃在SOC培养基中培养1小时。转化菌接种于含50 mg/mL卡苄西林的LB培养基中，30℃，140 rpm摇瓶过夜。为了表达蛋白，将过夜的培养物制成颗粒，重悬在新鲜TB培养基(极好的肉汤)/50 mg/mL氨苄西林，0.5%葡萄糖中，37℃，110 rpm摇晃，直到OD600为1.5。最终浓度为0.5 mM的IPTG诱导蛋白表达。离心收集细胞，细胞球置于−20℃保存。

为了纯化his标记蛋白，将细胞微球解冻并重悬在20 mL裂解缓冲液(50 mM Na)中₂HPO₄， 5 mM Tris, pH 7.8, 500 mM NaCl, 10 mM咪唑)每1 L的表达培养。使用1 mg/mL溶菌酶(Sigma, Deisenhofen，德国)，10-15 U/mL苯并酶(Novagen, Darmstadt，德国)和超声裂解细胞。离心(17 200 g, 20分钟)后，清除的裂解液与Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen, Hilden, Germany) (1 mL浆为1 L细菌表达培养物)在4℃旋转孵育1 h。将浆液装入柱中，用8柱体积的洗涤液(50 mM Na)进行洗涤₂HPO₄， 5 mM Tris, pH 7.8, 500 mM NaCl, 80 mM咪唑)。用3柱体积的洗脱缓冲液(50 mM Na)洗脱Sox2-TAT蛋白₂HPO₄， 5 mM Tris, pH 7.8, 500 mM NaCl, 250 mM咪唑)。

2．2.转导培养基的制备

用7.5%的血清替代物补充Sox2 TAT洗脱液部分，并在4°C下过夜对DMEM F12进行透析。第二天将细胞培养补充物添加到透析部分，最终浓度为2%FCS，2.5%Albumax II（200 mg/mL），7.5%血清置换，1%ITS，0.1 mM非必需氨基酸，1 丙酮酸钠，2 mM L-谷氨酰胺，0.5 嗯β- MercapToethanol和1000 U / ml LIF。将混合物在37℃下在水浴中预处理1小时，并通过离心（2500g）以离心（5分钟）和无菌过滤清零。

2．3.细胞培养

Oct4-GiP mef (38]在含10% FCS、0.1 mM非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨酰胺的高糖DMEM (Invitrogen)中培养。mef在70-80%的浓度下进行胰蛋白酶化，然后重新播种到包有明胶的组织培养皿上。对于重编程试验，mef最多用于第4代。

在DMEM F12 (Invitrogen)中添加2% FCS, 2.5% Albumax II (200 mg/mL)， 7.5%血清替代，1% ITS, 0.1 mM非必需氨基酸，1 mM丙酮酸钠，2 mM l -谷氨酰胺，0.5 mMβ- MercapToethanol和1000 U / ml LIF。细胞每3天分裂并在灭活的饲养细胞上培养。

2.4.逆转录病毒感染和iPS诱导

从ADDGENE中获得pMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2(阳性对照)、pMXs-c-Myc和pMXs-Klf4质粒。如前所述，逆转录病毒是由E包装细胞系产生的[39］．接种目标细胞每孔的细胞在六孔板中。转染24小时后，收集包含病毒的上清液，用0.45过滤μm醋酸纤维素过滤器。对于替代实验和阴性对照，OCT4，KLF4和C-MYC在相等的股份中混合，并补充含有聚苯（Millipore）的终浓度为4 μg / ml。阳性对照另外含有PMXS-SOX2病毒，并治疗相似。将Oct4-GIP MEF细胞与病毒孵育16小时。在除去含病毒上清液后开始蛋白转导实验。5天后，将细胞分裂到辐照饲养细胞上。11天后，用4％PFA固定细胞并通过荧光显微镜分析。出于产生稳定的IPS细胞系，在指定条件下培养重编程测定21天。随后，挑选菌落并单烯烃膨胀。

2.5。体外分化

通过胰蛋白酶收获细胞并转移到细菌培养皿中。然后，在不含LIF的ES培养基中培养3天。随后将衍生的胚状体转移到明胶包覆的组织培养皿中，再孵育3天。为了检测所有三个胚层特异性的关键标记的表达，免疫染色与抗β-3微管蛋白(TUJ1)、平滑肌肌动蛋白(SMA)-甲胎蛋白(AFP)。

2.6。rt - pcr

按照制造商的说明使用RNAeasy试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)提取总RNA。随后，1的逆转录μ使用IScript cDNA合成试剂盒（Bio-rad）进行每个样品的G RNA。为了检测病毒转基因表达，使用以下引物对：Oct4TGforw: CCCCACTTCACCACACTCTAC,Oct4TGrev: TTTATCGTCGACCACTGTGC,Klf4TGforw: AGGCACTACCGCAAACACAC,Klf4TGrev: TTTATCGTCGACCACTGTGC,Sox2TGforw:GCCCAGTAGACTGCACATGG，Sox2TGrev: CCCCCTTTTTCTGGAGACTA,c-MycTGforw: CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC,c-MycTGrev: TTTGTACAAGAAAGCTGGGT。

为了检测内源性Oct4、Sox2和Nanog，使用了以下引物对：Oct4forw: TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC,Oct4rev: TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC,Sox2for: TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA,Sox2rev: TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA,Nanogfor: CAGGTGTTTGAGGGTAGCTC,Nanogrev:CGGTTCATGTACAGTC。

pcr程序:95°C 2分钟，95°C 30秒，60°C 30秒，72°C 1分钟，72°C 10分钟。步骤2-4重复35次。

结果

３．１．重编程Sox2融合蛋白的纯化

我们以前已经证明，重组Sox2可以从大肠杆菌作为tat修饰的细胞渗透版本，指定为Sox2-TAT [22］．特别是，该融合蛋白包含一个额外的外源性核定位序列(NLS)、一个穿透细胞的肽TAT和一个用于单步纯化的羧基末端组氨酸标签(图)1(一))．Sox2-TAT被证明能特异性与DNA结合，并补偿rnai诱导的ES细胞活性损失[22]及植入前胚胎[32];然而，它重新编程体细胞的能力还没有被评估。为了研究Sox2-TAT的重编程活性，我们决定将纯化的重组Sox2-TAT与编码Oct4、Klf4和c-Myc的逆转录病毒结合，将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)转化为iPS细胞(图)1 (b))．将sox2 - tat转化的细菌裂解并进行镍亲和层析。使用his特异性抗体对纯化部分进行免疫印迹，发现Sox2-TAT在细菌中高度表达，尽管大多数重组蛋白仍然存在于不溶部分(图)1 (d))．然而，在上清液中估计有20%的蛋白质溶解并可检测到，这就足以进行进一步的纯化。ni亲和层析得到含sox2 - tat的部分，纯度约为70%(图)1 (c))．

３.２．确定稳定Sox2-TAT蛋白的最佳条件

重组蛋白在细胞培养条件下的溶解性差和稳定性有限是蛋白质转导技术应用的重要障碍。一方面，血清成分稳定细胞培养基中的重组蛋白，但另一方面，已知它们抑制可转导蛋白与细胞的相互作用，从而减少细胞摄取。在一些实验设置中，这可以通过在无血清培养基中应用可转导蛋白来克服。我们采用不同的细胞培养条件来评估Sox2-TAT的稳定性。在无血清培养基中，Sox2-TAT在1小时内几乎完全沉淀(图)2(一个))．血清成分已被证明对重组蛋白的稳定性有积极的影响[36，40]因此，我们的目标是通过补充FCS、血清替代物等来稳定蛋白质[35]和富含脂质的白蛋白组分（Albumax）。添加5%FCS或2.5%Albumax对培养基中的Sox2 TAT显示出强烈的稳定作用，而Sox2 TAT在存在7.5%SR的情况下表现出显著的降低。低FCS（2%）与7.5%SR的组合导致稳定，与高FCS补充（5%）相当（图5%）2(一个))．

接下来，我们开始分析稳定补充剂在多大程度上干扰了蛋白质转导过程。为此，我们使用了一种完善的转导读出系统，该系统基于DNA重组酶Cre的细胞渗透版本[40］．该蛋白转导系统的一个主要特点是，细胞内蛋白传递的效率可以通过Cre重组酶报告试验可靠地量化。我们使用CV1-5B Cre报告细胞系[37明确地表达了β-半乳糖苷酶。使用这个读出系统，我们测试了FCS和SR对传导效率的影响(图2（b）)．2 μ在添加5% fcs的培养基中，TAT-Cre的M可诱导约35%的细胞发生重组，而在添加15% sr的培养基中，超过90%的细胞靶标发生重组μTAT-Cre的M显示了类似的相关性:约20%的重组在FCS存在和70%与SR(图2（b）)这些数据表明，与SR相比，FCS对蛋白质转导表现出强烈的抑制作用。基于这些结果，我们利用Sox2-TAT建立了iPS衍生的优化转导协议。我们决定采用两步方案来优化蛋白质稳定性和转导能力。在第一步中，用7.5%SR补充洗脱液部分，并针对DMEM/F12进行透析。之后，透析部分补充FCS（2%）和Albumax（2.5%）。与SR和FCS相比，优化培养基在透析期间和细胞培养条件下的蛋白质稳定能力分别在相同范围内。

3.3.用细胞渗透性Sox2融合蛋白重新编程OKC感染细胞

然后利用优化的培养基条件评估Sox2-TAT的重编程活性。为此，我们使用了经典的四因子病毒重编程范式的修改，旨在用Sox2-TAT蛋白替换sox2编码的病毒(图)3（a）)．我们转染oct4 - gip转基因mef [38通过Oct4启动子的重新激活，使基于gfp的重编程监测成为可能，病毒编码Oct-4、Klf4和c-Myc (OKC)。将okc - mef在含200 nM和400 nM Sox2-TAT的培养基中培养5 d。在整个重编程过程中，我们每天更换蛋白补充培养基，以确保重组重编程因子的持续递送。第5天，细胞被分离到新鲜的饲养细胞上，在正常培养基中培养或进一步暴露于含sox2 - tat的培养基中5天(图)3（a）)．首先，9天后出现ips样结构，形成明确的gfp阳性菌落(图)3（b）)．不含Sox2-TAT蛋白的Oct4、Klf4和c-Myc三因子的病毒转导未产生任何gfp阳性菌落(图)3（b）).GFP⁺在第16天对菌落进行定量。我们计算了8个GFP⁺在含有400 nM Sox2-TAT处理的细胞的孔中培养5天。用Sox2-TAT延长孵育至第10天，并没有导致菌落数量的显著增加。相反，由于Sox2应用程序需要严格的时间窗口，菌落数量最终略有下降。200 nM Sox2-TAT处理5天和10天产生1个绿色荧光蛋白⁺分别为殖民地(图3（c）)，说明Sox2-TAT浓度是一个限制因素。我们的目的是进一步提高Sox2-TAT的浓度，无论是透析对含甘油的浓度缓冲液或超滤;然而，超过400 nM后，该蛋白在培养基中强烈沉淀并干扰细胞生长(数据未显示)。

3．4．sox2 - pip细胞表现多能性

分离并扩增了两个sox2蛋白iPS菌种，分别获得了Sox2-piPS-1和Sox2-piPS-2细胞系。两者都能增殖至少20代，并维持其Oct4启动子驱动的GFP活性。此外，多能性相关的细胞表面标记SSEA-1染色呈阳性(图)4（a）)．使SOX2-PIPS-1和SOX2-PIPS-2进行PCR分析，以评估转基因集成。该分析显示，两条线都携带综合病毒转基因，但没有外源性SOx2（图4（b）)转基因沉默是iPS成功衍生的主要标志。因此，我们应用RT-PCR分析来检测转基因重编程因子以及内源性干细胞因子的转录本。所分析的两个克隆均未检测到转基因Oct4、Sox2、Klf4或c-Myc（图4 (c))．与此相反，内源性Oct4、Sox2和Nanog的mRNA含量与ES对照细胞一样丰富，表明外源因子完全沉默，内源性茎干网格重新激活。最后，我们试图通过自发分化成胚状体(EBs)来确定Sox2-piPS-2的多能状态。将5日龄EBs培养皿放置，通过染色分析特定胚层标记物的外观β-3微管蛋白(TUJ1)、平滑肌肌动蛋白(SMA)α-feto-protein(法新社)(图5).根据该分析，Sox2-piPS-2细胞分化为所有三个胚层，显示出无限制的体外分化潜能。

4.讨论

在本研究中，我们详细说明了将细胞 - Permant Sox2-Tat蛋白递送到哺乳动物细胞中的优化方案。在细胞培养条件下SOx2-TAT的稳定性差是SOX2蛋白转导的主要瓶颈。分析媒体补充剂，SR和FCS对SOX2-TAT的稳定作用。发现FCS稳定SOX2-TAT，而重组蛋白在无蛋白质介质中迅速沉淀。我们使用CRE蛋白转导系统[40]以定量方式评估媒体补充SR，FCS和Albumax对蛋白质转导的影响。结果证明，SR对细胞递送没有有害影响，而FCS强烈降低了细胞摄取。因此，就蛋白质递送而言，在FCS上优选SR的补充。然而，由于与ES和IPS细胞成纤维细胞相反，不耐受SR，因此我们使用7.5％Sr和2％Fcs的混合物。这些媒体条件代表了蛋白质诱导的成纤维细胞重编程期间培养的最佳折衷。

利用这些优化的条件，我们证明在okc病毒诱导成纤维细胞多能性过程中，Sox2-TAT能够替代sox2编码的病毒。可以产生稳定的Sox2-piPS细胞系，表现出ES细胞的主要特征，如多能性相关标记表达和充分分化潜能体外．我们发现SOx2-PIPS细胞的增殖不依赖于通过RT-PCR分析判断的OKC转基因的连续表达。值得注意的是，从第5天到第10天的200nm SOx2-tat转导导致诱导一个GFP⁺菌落(数据未显示)，而从第1天到第5天处理没有产生任何菌落，尽管使用相同浓度的蛋白质。这一观察结果是否暗示了Sox2在重编程过程中具有特定的时间依赖性，还是随机变异的结果，仍有待研究。总的来说，Sox2-piPS衍生的效率至少比我们之前报道的Oct4-piPS细胞的生成低一个数量级[36］．从这一观察中，我们得出结论，尽管我们提供了原理证明数据，但重组Sox2- tat具有重编程能力，充分将具有生物学活性的Sox2蛋白交付到右侧细胞间隔是蛋白质诱导iPS来源的瓶颈。

需要进一步调查来实现人类成人细胞的稳健重编程，例如采用重组蛋白的成纤维细胞或角蛋白细胞。需要确定优化的表达和纯化方案，例如，通过在变性条件下纯化来利用重组SOX2-TAT的不溶性分数。此外，包括真核细胞的替代表达宿主可能增强可溶性天然SOx2-TAT蛋白的衍生。SOX2蛋白转导可能不仅可以用于因因素IPS细胞的衍生而是通过提供工具来精确确定SOX2诱导的持续时间和剂量的重编程机制来分析重编程机制。

致谢

作者感谢干细胞工程小组的所有成员对本论文的支持、宝贵的讨论和批判性阅读。他们感谢Nicole Russ和Kathrin Vogt提供的出色技术援助。这项工作得到了德意志联邦基金会DFG（ED79/1-2）的资助德国教育和研究部BMBF（01 GN 0813）和德国达姆施塔特默克公司KGaA。

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