SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 549846年 10.1155 / 2012/549846 549846年 研究文章 细胞重新编程采用重组Sox2蛋白质 他们的 马克 Munst 伯纳德 Mielke 斯蒂芬妮 Edenhofer 弗兰克 朋友 Rajarshi 干细胞工程集团 重建神经生物学研究所 大学Bonn-Life &大脑中枢和Hertie基金会 西格蒙德·弗洛伊德Straße 25 d - 53105波恩 德国 uni-bonn.de 2012年 29日 5 2012年 2012年 01 12 2011年 23 01 2012年 2012年 版权©2012马克他们et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

诱导多能干细胞(iPS)细胞代表一个有吸引力的选择特定的多能细胞的细胞替代疗法的推导以及疾病建模。成为临床意义,安全需要生成“诱导多能性”细胞表现出没有永久的基因改造所引起的病毒重组转基因产品的集成。最近,各种实验策略被应用来完成transgene-free派生的“诱导多能性”细胞,包括使用nonintegrating病毒,游离表达式,或切除后的转基因通过特定站点或者转座酶的可重新编程。诱导重组因子一个简单的方法是直接交付信使rna合成或生物活性的蛋白质。我们以前报道的一代cell-permeant版本Oct4 (Oct4-TAT)和Sox2 (Sox2-TAT)蛋白质和显示Oct4-TAT reprogramming-competent,也就是说,它可以代替Oct4-encoding病毒。在这里,我们探讨条件增强Sox2-TAT蛋白质稳定和功能交付成体细胞。我们表明,cell-permeant Sox2蛋白质可以稳定lipid-rich血清中白蛋白补充替代或low-serum-supplemented媒体。采用优化蛋白质条件交货,我们证明Sox2-TAT蛋白质能够替代病毒Sox2。Sox2-piPS细胞表达pluripotency-associated标记和分化成三个胚芽层。

 1。介绍

多能细胞代表最有吸引力的来源细胞修复再生医学和疾病建模基本生物医学研究,因为他们有能力分化成成年有机体的每一个细胞类型。直到最近,早期胚胎的发展阶段代表多能细胞的主要来源,因此,这些细胞被指定为胚胎干细胞(ES)细胞。如今,多能干细胞的人工推导体细胞变得越来越重要。诱导多能干细胞(iPS)细胞最初由逆转录病毒诱导异位表达的四个转录因子Oct4 Sox2, Klf-4,原癌基因的体细胞( 1]。人类“诱导多能性”细胞代表一个有吸引力的选择的推导多能针对病人的细胞不需要胚胎的一代。然而,至关重要的安全问题必须解决为了产生临床上有用的人类“诱导多能性”细胞。很快的识别病毒重组协议在老鼠的细胞( 1)及其适应人类细胞( 2, 3],不必要的副作用,如肿瘤发生[ 4变得明显。

自肿瘤形成的原因归结为随机整合重组逆转录病毒载体和持续的转基因的表达后,优化的协议进行了探讨绕过永久的外源DNA整合到基因组。一个策略包括切除重组转基因DNA可采用( 5, 6)或转座酶( 7- - - - - - 10]。iPS推导后,转基因可以删除第二轮重组酶/转座酶激活。然而,还需要进一步的费力和繁琐的遗传方法来识别和确认transgene-free iPS克隆。另外一个策略是利用侵害不整合到宿主基因组的基因载体。重复的质粒转染已被用于iPS感应虽然效率很低( 11]。Minicircle向量缺乏细菌的DNA,从而使高转染效率和长异位表达也报道称,重组( 12]。此外,病毒转导用人不他们的基因组整合到宿主细胞,如腺病毒( 13)或仙台病毒( 14)应用。小分子能够把进入细胞和干扰关键信号通路已确定,要么提高重组的过程( 15, 16)或更换( 15, 17(审查,请参阅[]单一病毒因素 18])。合成mRNA的重复转染( 19- - - - - - 21[]或直接交付编码蛋白质 22, 23)代表了一种简单但技术挑战性的方法实现nongenetic iPS推导。

蛋白质转导技术已经被用于直接提供大量的生物活性蛋白在哺乳动物细胞通过修改他们所谓cell-penetrating肽(cpp)或蛋白质转导域(输配电)。这些相对较小的多肽赋予细胞渗透性当货物有关分子(审查,请参阅[ 24- - - - - - 26])。一个高度基本CPP来自 人类免疫缺陷病毒1型(hiv - 1)乙(反式激活因子的转录)蛋白质通常是申请手机交付(乙) 25- - - - - - 28]。输配电一直用于生成cell-penetrating版本的不同转录因子,细胞分化中扮演主要的角色包括HoxB4 [ 27],Pdx1 [ 28],sci [ 29日],Nkx2.2 [ 30.],Notch-ICD [ 31日]。我们之前报道的推导cell-permeant版本的重组因子Oct4和Sox2 22]。Oct4-TAT结合DNA和Sox2-TAT被证明如Oct4 Nanog启动子/ Sox2组合元素,和两个蛋白质补偿RNAi-induced损失函数后直接交付到胚胎干细胞( 22]。此外,雇佣Sox2-TAT,证明Sox2在胚胎植入前的一个基本函数老鼠胚胎通过促进建立滋养外胚层血统( 32]。周等人的重组因子融合蛋白衍生品使用 大肠杆菌推导的老鼠精原细胞,尽管效率很低( 23]。金等人报道细胞提取物的使用对人类新生儿的重组成纤维细胞转染HEK293细胞( 33]。最近报道利用ES细胞提取物在小鼠成纤维细胞(诱导多能性 34)需要探索是否可以适应人类细胞。总之,一个健壮的、标准化和有效协议的生成protein-induced iPS细胞从成人细胞仍有待开发。

进一步优化蛋白质转导细胞重新编程很大程度上取决于克服的一个主要瓶颈与蛋白质转导:细胞培养条件下重组的稳定因素。我们最近建立了优化Oct4-TAT稳定条件,证明了有效的替代Oct4-encoding病毒重组Oct4-TAT [ 36]。在这里,我们探讨条件增强Sox2-TAT蛋白质稳定和交付成体细胞。我们表明,cell-permeant Sox2蛋白质可以稳定lipid-rich血清中白蛋白补充替代或low-serum-supplemented媒体。使用这些蛋白质条件交货,我们证明Sox2-TAT蛋白质能够替代病毒Sox2。

 2。材料和方法 2.1。蛋白表达和纯化

pSESAME-Sox2NTH表达质粒( 22]变成了 大肠杆菌BL21 (DE3)黄金应变(美国拉霍亚Stratagene)热休克在30°C和孵化1 h SOC中30°C。在一夜之间改变细菌接种30°C用颤抖的在磅140 rpm中含有50毫克/毫升羧苄青霉素。蛋白表达,一夜之间文化在新的结核病是球状的,resuspended介质(很棒的肉汤)氨苄西林/ 50毫克/毫升、0.5%葡萄糖和孵化37°C用颤抖的在110 rpm,直到一个OD600 1.5实现。蛋白表达是由IPTG诱导最终浓度为0.5毫米。细胞被离心收获,和细胞颗粒被储存在−20°C。

His-tagged蛋白质的纯化细胞颗粒被解冻,resuspended 20毫升裂解缓冲(50毫米Na2HPO45毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.8,500毫米氯化钠,10毫米咪唑)/ 1 L的表达文化。细胞被应用细胞溶解1毫克/毫升溶菌酶(σ,Deisenhofen,德国),10 - 15 U /毫升Benzonase (Novagen,达姆施塔特,德国)和声波降解法。离心后(17 200 g, 20分钟),清除溶解产物是孵化Ni-NTA琼脂糖珠(试剂盒、希尔登,德国)(1毫升的水泥浆1 L细菌表达的文化)1 h和旋转在4°C。泥浆被包装成列和洗8列缓冲区(50毫米Na洗卷2HPO4三、5毫米,pH值7.8,氯化钠500毫米和80毫米咪唑)。Sox2-TAT蛋白质筛选了3列的洗脱缓冲(50毫米Na2HPO4三、5毫米,pH值7.8,氯化钠500毫米和250毫米咪唑)。

 2.2。制备转导媒体

Sox2-TAT洗出液部分补充7.5%血清替代和透析DMEM F12 /晚上4°C。第二天细胞培养补充剂被添加到透析分数FCS的最终浓度2%,2.5% Albumax II(200毫克/毫升),7.5%血清替代,其1%,0.1毫米不重要的氨基酸,1毫米丙酮酸钠,2毫米谷酰胺,0.5毫米 β巯基乙醇和1000 U /毫升生活。混合物的先决条件是在水浴1 h在37°C和通过离心(5分钟在2500 g)和无菌过滤。

 2.3。细胞培养

Oct4-GiP mef ( 38)是培养high-glucose DMEM(英杰公司)与10% FCS, 0.1毫米不重要的氨基酸,谷酰胺1毫米丙酮酸钠,2毫米。mef使胰蛋白酶化在70 - 80%对组织文化的融合然后盘子涂上一层凝胶。重新化验,mef最多被用来通过4。

制在DMEM培养F12 FCS(表达载体)补充2%,2.5% Albumax II(200毫克/毫升),7.5%血清替代,其1%,0.1毫米不重要的氨基酸,1毫米丙酮酸钠,2毫米谷酰胺,0.5毫米 β巯基乙醇和1000 U /毫升生活。每3天细胞分裂和灭活馈线上培养的细胞。

 2.4。逆转录病毒感染和iPS归纳

质粒的pMXs-Oct3/4 pMXs-Sox2(积极的控制),pMXs-c-Myc pMXs-Klf4从ADDGENE获得。逆转录病毒是由平台生成E包装细胞系如前所述[ 39]。靶细胞被播种 10 × 10 4 细胞每在six-well盘子。转染24小时后,组成病毒收集和过滤的上层清液0.45 μ醋酸纤维素滤光片。替换实验和消极的控制,Oct4、Klf4,原癌基因混合等于股票和补充聚凝胺(微孔)的最终浓度4 μ克/毫升。积极控制另外包含pMXs-Sox2病毒和治疗。Oct4-GiP MEF细胞与病毒16小时孵化。蛋白质转导实验开始后上层清液“(分泌物)颗粒被删除。5天后,细胞分裂到辐照馈线细胞。11天后,细胞被固定为4% PFA和分析了荧光显微镜。为了生成稳定的诱导多能干细胞,重组化验是在指定的条件下培养21天。随后,殖民地和扩展单克隆。

 2.5。在体外分化

细胞被胰蛋白酶化收获和转移到细菌培养皿中。接下来,生长在ES细胞中缺乏生活3天。派生的拟胚体被转移到gelatine-coated组织菜之后和孵化3天。为了检测键标记表达特定的所有三个胚芽层,与抗体免疫染色 β3-tubulin (TUJ1),平滑肌肌动蛋白(SMA), α 胎蛋白(法新社)进行。

 2.6。rt - pcr

总RNA提取使用RNAeasy工具包(试剂盒、希尔登,德国)后,制造商的指示。随后,逆转录的1 μg RNA每个样本都使用了iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad)。为了检测病毒转基因表达,以下引物配对使用:

Oct4TGforw: CCCCACTTCACCACACTCTAC,

Oct4TGrev: TTTATCGTCGACCACTGTGC,

Klf4TGforw: AGGCACTACCGCAAACACAC,

Klf4TGrev: TTTATCGTCGACCACTGTGC,

Sox2TGforw: GCCCAGTAGACTGCACATGG,

Sox2TGrev: CCCCCTTTTTCTGGAGACTA,

c-MycTGforw: CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC,

c-MycTGrev: TTTGTACAAGAAAGCTGGGT。

的检测内源性Oct4、Sox2 Nanog,以下引物配对使用:

Oct4forw: TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC,

Oct4rev: TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC,

Sox2for: TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA,

Sox2rev: TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA,

Nanogfor: CAGGTGTTTGAGGGTAGCTC,

Nanogrev: CGGTTCATCATGGTACAGTC。

PCR-program: 95°C 2分钟,95°C 30秒、60°C 30秒,72°C 1分钟,72°C 10分钟。重复2 - 4步,35倍。

 3所示。结果 3.1。从细菌净化Reprogramming-Competent Sox2融合蛋白

我们曾表明,重组Sox2可以净化 大肠杆菌作为一个TAT-modified cell-permeant版本,指定Sox2-TAT [ 22]。特别是,这种融合蛋白包含一个额外的外生核本地化序列(NLS), cell-penetrating肽答,carboxy-terminal Histidine-tag单步净化(图 1(一))。Sox2-TAT被证明特别结合DNA和RNAi-induced损失的补偿活动在胚胎干细胞( 22和胚胎植入前的胚胎 32];然而,它的功能重组体细胞没有评估。为了研究Sox2-TAT的重组活动,我们决定将纯化重组Sox2-TAT一起逆转录病毒编码Oct4、Klf4,原癌基因小鼠胚胎成纤维细胞(mef)转换成“诱导多能性”细胞(图 1 (b))。Sox2-TAT-transformed细菌细胞溶解,受到Ni-affinity色谱法。免疫印迹的净化分数使用他的抗体显示Sox2-TAT高度表达细菌虽然大部分重组蛋白仍在不溶性分数(图 1 (d))。然而,估计有20%的蛋白质可溶性和上层清液中检测到被证明是足够的进一步净化。从Ni-affinity洗脱色谱柱产生Sox2-TAT-containing分数70%纯度(图 1 (c))。

Sox2-TAT重组融合蛋白的纯化和重编程设置。(一)重组cell-permeant Sox2融合蛋白( 22)由长篇Sox2蛋白和一个carboxy-terminally融合序列标签组成的核本地化序列(NLS), cell-penetrating肽答,histidine-tag(代替单步净化。(b)表达和纯化过程的示意图表示,在这项研究中使用的编程设置。在表达 大肠杆菌,Sox2-TAT-containing细胞溶解产物受到亲和柱层析法采用Ni-NTA树脂。纯化重组Sox2-TAT蛋白质筛选了列及其重组能力评估结合逆转录病毒编码Oct4、Klf-4,原癌基因。(c, d)生化分析Sox2-TAT净化 大肠杆菌。下面的分数受到SDS - page分析:原油溶解产物(CL)、标记(M),颗粒(P),上层清液(SN),主要材料(英尺),清洗缓冲(W),和洗脱馏分(E), SDS凝胶染色使用Coomassie (c)或用于制备免疫印迹使用anti-Sox2-specific抗体(d)。

 3.2。定义最优条件稳定Sox2-TAT蛋白质

可怜的溶解度和有限的重组蛋白在细胞培养条件下的稳定性代表蛋白质转导技术的应用的重要障碍。一方面,血清成分稳定重组蛋白在细胞培养基,但另一方面,已知抑制transducible蛋白质与细胞的相互作用和减少细胞吸收。在一些实验设置,这可以通过应用transducible克服采用无血清蛋白质的媒体。我们评估Sox2-TAT采用各种细胞培养条件的稳定性。在无血清的媒体,Sox2-TAT沉淀几乎完全在1小时内(图 2(一个))。血清组件已被证明重组蛋白的稳定性上执行一个积极的影响( 36, 40]。因此,我们旨在稳定的蛋白质补充剂FCS、血清替代( 35],lipid-rich白蛋白分数(Albumax)。补充与FCS 5%或2.5% Albumax强劲稳定影响Sox2-TAT文化媒体,而老Sox2-TAT表现出主要的存在减少7.5%的组合低FCS(2%)与7.5% SR导致一个稳定与高FCS补充(5%)(图 2(一个))。

媒体补充效果的稳定性cell-permeant Sox2-TAT融合蛋白和蛋白质效率交付。(一)媒体补充Sox2-TAT稳定的能力。胎牛血清(FCS)、Albumax和血清替代(SR)被添加到洗出液比例和随后透析DMEM-F12媒体。描绘的anti-Sox2-immunoblots透析分数(D)和稳定性试验的样本被(1 h) 1小时和6小时后(6小时),分别。(b)的影响,FCS、SR、转导效率两者的结合。蛋白质转导效率分析量化后的重组细胞的细胞渗透的Cre-protein (TAT-Cre)到CV1-5B Cre记者细胞系。细胞治疗与不同浓度的TAT-Cre (0.25 μm - 2 μ米)在媒体传导补充与血清替代15%,5% FCS,老或混合物的FCS 2%和7.5%确定重组活动,细胞被固定和染色 β牛乳糖48小时后活动。Cre蛋白质转导和量化Cre记者重组的细胞如前所述执行( 35]。

接下来,我们开始着手分析,一定程度上稳定补充剂干扰蛋白质转导过程。目标,我们使用了一种行之有效的转导读出系统基于cell-permeant版本的DNA重组酶Cre [ 40]。这种蛋白质转导系统的一个主要特点是细胞内蛋白质的效率交付可靠的可以量化的Cre重组酶记者分析。我们使用了CV1-5B Cre记者细胞系( 37),具体表达 βCre-mediated重组后牛乳糖。使用这个读出系统,我们测试了FCS的影响和SR转导效率(图 2 (b))。2 μM 5% FCS-supplemented媒体诱导重组的TAT-Cre大约35%的细胞,而超过90%的细胞重组在老中含有15%的应用目标1 μM TAT-Cre显示相似的相关性:约20%复合的FCS与SR(图和70% 2 (b))。这些数据表明,FCS与SR展品的抑制蛋白质转导。基于这些结果,我们建立了一个优化的转导iPS推导用人Sox2-TAT的协议。我们决定运用两步协议优化、蛋白质稳定性和传导能力。在第一步中,洗出液部分补充7.5% SR和透析DMEM / F12。后来,透析分数与FCS(2%)和补充Albumax (2.5%)。优化媒介显示蛋白质透析期间稳定能力和细胞培养条件下相同的范围比SR和FCS,分别。

 3.3。重组OKC-Infected细胞Cell-Permeant Sox2融合蛋白

然后,我们评估的重组活动Sox2-TAT采用优化的媒体环境。古典的,我们使用一个修改四因子病毒重新编程范式,旨在取代Sox2-encoding病毒Sox2-TAT蛋白质(图 3(一个))。我们转染Oct4-GiP-transgenic mef ( 38),这使GFP-based监测重组Oct4启动子的激活,对Oct-4病毒编码,Klf4,原癌基因(俄)。OKC-MEFs最初的五天中包含200 nM和400 nM Sox2-TAT。在整个重组过程中,我们改变了protein-supplemented媒体每天以确保持续交付的重组重编程因子。镀在第五天,细胞分裂到新支线细胞和培养正常的媒体或进一步暴露Sox2-TAT-containing媒体(图5天 3(一个))。首先,iPS-like结构出现9天后,形成明确的GFP-positive殖民地(图 3 (b))。Oct4病毒转导的三个因素,没有Sox2-TAT Klf4,原癌基因蛋白没有产生任何GFP-positive殖民地(图 3 (b))。绿色荧光蛋白+殖民地量化在16天。我们计算八GFP+殖民地井包含细胞治疗400海里Sox2-TAT 5天。长期孵化Sox2-TAT直到第十天没有导致蜂群数量的显著增加。相反,殖民地的数量稍微减少最终由于严格的时间窗口Sox2所需的应用程序。200纳米的应用Sox2-TAT五和十天了没有,只有一个“绿色荧光蛋白”+分别为殖民地(图 3 (c)),表明Sox2-TAT浓度是一个限制因素。我们旨在进一步提高Sox2-TAT浓度通过透析对glycerol-containing浓度缓冲或超滤;然而,超出400海里,强烈的蛋白质沉淀在文化媒体和干扰细胞生长(数据未显示)。

重组mef使用cell-permeant Sox2-TAT蛋白质。(一)示意图表示时间轴的改变设置。Oct4-GiP mef感染了病毒编码Oct4、Klf4,原癌基因(俄)天0。从第一天开始后感染(p)、细胞孵化Sox2-TAT 5和10天,分别改变Sox2-TAT-supplemented媒体日常。(b)代表细胞转导的照片与200 nM Sox2-TAT蛋白(右面板)显示相衬和GFP通道(嵌入)14天皮。OKC-infected细胞治疗中只作为控制(左面板)。比例尺= 100 μm。(c)的量化GFP-positive殖民地在16天皮。OKC-infected细胞(−)以及SOKC-infected细胞(+)作为控制。

 3.4。Sox2-piPS细胞具有多能性

两个Sox2-protein iPS殖民地被孤立和扩大作进一步鉴定,分别产生Sox2-piPS-1和Sox2-piPS-2细胞株。都可能经历了至少20的段落,他们保持Oct4 promoter-driven GFP的活动。此外,他们积极彩色SSEA-1 pluripotency-associated细胞表面标志(图 4(一))。Sox2-piPS-1和Sox2-piPS-2受到PCR分析,以评估转基因集成。这一分析显示,两行携带病毒转基因产品集成,但没有外生Sox2(图 4 (b))。转基因沉默代表着成功的iPS推导的主要标志。因此,我们应用rt - pcr分析检测转基因重组因子的成绩单以及具备干细胞内源性因素。两个克隆分析展览没有检测到转基因Oct4、Sox2 Klf4或原癌基因(图 4 (c))。内源性Oct4的信使rna, Sox2 Nanog,相比之下,发现了ES控制细胞丰富,表明完全沉默具备干细胞外生因素和内生网格的重新激活。最后,我们要确认的多能状态Sox2-piPS-2通过自发分化成胚状体的身体(EBs)。5天的外表镀旧EBs和分析特定标记染色对胚芽层 β3-tubulin (TUJ1),平滑肌肌动蛋白(SMA), α-feto-protein(法新社)(图 5)。根据这一分析,Sox2-piPS-2细胞分化成三个胚芽层,展示了一个不受限制的 在体外分化的潜能。

细胞和分子特性的iPS克隆Sox2蛋白质转导到OKC-MEFs派生而来。(a)的照片孤立细胞系Sox2-piPS-1(上层行)和Sox2-piPS-2(低行)展示brightfield (BF),染色对pluripotency-associated SSEA-1和本地GFP荧光标志。Sox2-piPS-1细胞系是无性生殖隔离400海里Sox2-TAT治疗从1到5天,和Sox2-piPS-2源自200海里条件(5到10天)比例尺= 100 μm。(b)的PCR分析基因组DNA基因组整合Oct4示威,Klf4转基因。正如所料,没有检测到转基因Sox2 Sox2-piPS克隆排除污染的可能性。(c) rt - pcr分析表明转基因沉默Sox2-piPS细胞。特定的引物转基因Oct4、Sox2 Klf4,原癌基因。此外,我们分析了内生Oct4、Sox2 Nanog记录。RNA准备从被感染(正)和未受感染的mef以及胚胎干细胞作为控制。

在体外Sox2-piPS细胞的分化。自发分化Sox2-piPS细胞被染色 β 3-tubulin (TUJ1外胚层)平滑肌肌动蛋白(SMA、中胚层) α内胚层胎蛋白(法新社)表示。DAPI co-staining执行在每一个条件。

 4所示。讨论

在这项研究中,我们阐述了一个优化的协议cell-permeant Sox2-TAT蛋白在哺乳动物细胞。细胞培养条件下稳定性差的Sox2-TAT代表Sox2蛋白转导的主要瓶颈。媒体补充Albumax、SR和FCS Sox2-TAT稳定的影响进行了分析。FCS稳定Sox2-TAT被发现,而迅速重组蛋白在媒体无蛋白沉淀。我们使用Cre蛋白质转导系统[ 40评估媒体老补充剂的影响,FCS, Albumax蛋白质转导以定量的方式。原来老对细胞没有有害影响交付,而FCS强烈降低了细胞吸收。因此,补充蛋白质的交付,在FCS SR是首选。然而,由于与ES老和iPS细胞成纤维细胞不容忍我们使用7.5% SR和2% FCS的混合物。这些媒体环境代表一个最佳妥协在protein-induced重组成纤维细胞的培养。

运用这些优化的条件下,我们证明Sox2-TAT能够代替Sox2-encoding病毒在OKC-viral诱导成纤维细胞的多能性。稳定Sox2-piPS细胞系可以表现出胚胎干细胞的主要特征如pluripotency-associated标记表达式和完整的分化潜能 在体外。我们发现Sox2-piPS扩散细胞不依赖于俄转基因的连续表达式根据rt - pcr分析。值得注意的是,200海里的转导Sox2-TAT从第五天到第十天导致一个GFP的感应+殖民地(数据未显示),而治疗从1到5天没有产生任何殖民地,尽管使用相同的蛋白质浓度。这个结果是否暗示了一个特定的时间依赖性Sox2在重组过程中或者是随机变异的结果还有待调查。一般来说,Sox2-piPS推导的效率至少一个数量级低比我们之前报道的一代Oct4-piPS细胞( 36]。从这个观察,我们得出这样的结论:尽管我们提供概念验证数据,重组Sox2-TAT reprogramming-competent,足够的蛋白质生物活性Sox2在合适的细胞室代表一个瓶颈protein-induced iPS推导。

还需要进一步的调查来实现健壮的重组成人细胞如成纤维细胞或角化细胞采用重组蛋白。需要优化表达和纯化协议建立,例如,利用重组Sox2-TAT的不溶性分数在变性条件下净化。此外,替代表达宿主包括真核细胞可能提高可溶性本机Sox2-TAT蛋白质的来源。Sox2蛋白质转导可能不仅是工具性的推导factor-free iPS细胞,也为分析重组机制通过提供一个工具来精确地确定Sox2感应的持续时间和剂量。

 确认

作者感谢干细胞工程集团的所有成员的支持和宝贵的论文的讨论和批判阅读。他们感谢妮可拉斯和凯瑟琳沃格特优秀的技术援助。这项工作是支持由德意志Forschungsgemeinschaft DFG (ED79/1-2),德国的教育和研究,BMBF(0813年01 GN),和默克公司,达姆施塔特,德国。

 高桥 K。 实验: 年代。 诱导多能干细胞在小鼠胚胎和成年纤维母细胞文化定义的因素 细胞 2006年 126年 4 663年 676年 2 - s2.0 - 33747195353 10.1016 / j.cell.2006.07.024 高桥 K。 田边 K。 Ohnuki M。 成田机场 M。 Ichisaka T。 但在 K。 实验: 年代。 人类成纤维细胞诱导多能干细胞从成人因素定义 细胞 2007年 131年 5 861年 872年 2 - s2.0 - 36248966518 10.1016 / j.cell.2007.11.019 余 J。 Vodyanik m·A。 Smuga-Otto K。 Antosiewicz-Bourget J。 飘羽:失忆天使 j·L。 田 年代。 聂 J。 Jonsdottir g。 Ruotti V。 斯图尔特 R。 Slukvin 我我。 汤姆森 j . A。 诱导多功能干细胞来源于人类体细胞 科学 2007年 318年 5858年 1917年 1920年 2 - s2.0 - 36749043230 10.1126 / science.1151526 Okita K。 Ichisaka T。 实验: 年代。 代的细胞系诱导多能干细胞 自然 2007年 448年 7151年 313年 317年 2 - s2.0 - 34249880066 10.1038 / nature05934 Soldner F。 Hockemeyer D。 胡子 C。 高 Q。 贝尔 g·W。 库克 e . G。 Hargus G。 咖啡 一个。 库珀 O。 Mitalipova M。 Isacson O。 Jaenisch R。 帕金森病patient-derived诱导多能干细胞的病毒重组因子 细胞 2009年 136年 5 964年 977年 2 - s2.0 - 61349100729 10.1016 / j.cell.2009.02.013 大梁 c。 大梁 a·G。 Longmire t。 Christodoulou C。 托马斯。 D D。 Gostissa M。 Alt f·W。 墨菲 g . J。 Kotton d . N。 Mostoslavsky G。 切除重组转基因提高生成“诱导多能性”细胞的分化潜能与单个可割取的向量 干细胞 2010年 28 1 64年 74年 2 - s2.0 - 75349095926 10.1002 / stem.255 个性 K。 Norrby K。 天竺鼠 一个。 Mileikovsky M。 穆赫辛尼经常 P。 Woltjen K。 无病毒诱导多能性和随后切除重组因子 自然 2009年 458年 7239年 771年 775年 2 - s2.0 - 64749111225 10.1038 / nature07864 Yusa K。 Rad R。 武田 J。 布拉德利 一个。 代的老鼠transgene-free诱导多功能干细胞piggyBac转座子 自然方法 2009年 6 5 363年 369年 2 - s2.0 - 65449154892 10.1038 / nmeth.1323 Woltjen K。 迈克尔 i . P。 穆赫辛尼经常 P。 德赛 R。 Mileikovsky M。 Hamalainen R。 整流罩 R。 王 W。 刘 P。 Gertsenstein M。 个性 K。 唱 h·K。 伊 一个。 PiggyBac换位重组成纤维细胞诱导多能干细胞 自然 2009年 458年 7239年 766年 770年 2 - s2.0 - 64749083939 10.1038 / nature07863 VandenDriessche T。 Ivics Z。 Izsvak Z。 Chuah m·K。 新兴潜在的转座子基因疗法和一代的诱导多能干细胞 血 2009年 114年 8 1461年 1468年 2 - s2.0 - 70349356638 10.1182 / - 2009 - 04 - 210427血 Okita K。 中川昭一 M。 Hyenjong H。 Ichisaka T。 实验: 年代。 代的老鼠没有病毒载体诱导多能干细胞 科学 2008年 322年 5903年 949年 953年 2 - s2.0 - 55849117368 10.1126 / science.1164270 贾 F。 威尔逊 k·D。 唱ydF4y2Ba N。 古普塔 d . M。 黄 M。 李 Z。 帕内塔 n . J。 陈 z Y。 罗宾斯 r . C。 凯 m·A。 Longaker m . T。 吴 j . C。 一个病毒的minicircle向量推导人类“诱导多能性”细胞 自然方法 2010年 7 3 197年 199年 2 - s2.0 - 77649275936 10.1038 / nmeth.1426 Stadtfeld M。 Nagaya M。 Utikal J。 堰 G。 Hochedlinger K。 诱导多能干细胞生成没有病毒整合 科学 2008年 322年 5903年 945年 949年 2 - s2.0 - 55849115999 10.1126 / science.1162494 Fusaki N。 禁止 H。 他 一个。 火箭 K。 长谷川 M。 有效使用向量transgene-free人类诱导多能干细胞基于仙台病毒、RNA病毒不整合到宿主基因组 《日本学院学报B 2009年 85年 8 348年 362年 2 - s2.0 - 70450265981 10.2183 / pjab.85.348 Huangfu D。 Osafune K。 Maehr R。 郭 W。 Eijkelenboom 一个。 陈 年代。 Muhlestein W。 梅尔顿 d . A。 诱导多能干细胞的主要人类成纤维细胞只有Oct4和Sox2 自然生物技术 2008年 26 11 1269年 1275年 2 - s2.0 - 55749104227 10.1038 / nbt.1502 米凯尔森 t·S。 汉娜 J。 张 X。 Ku M。 Wernig M。 Schorderet P。 伯恩斯坦 b E。 Jaenisch R。 着陆器 大肠。 迈斯纳 一个。 通过整合基因组分析解剖直接重新编程 自然 2008年 454年 7200年 49 55 2 - s2.0 - 46449094276 10.1038 / nature07056 史 Y。 Desponts C。 做 j . T。 Hahm h·S。 Scholer h·R。 丁 年代。 小鼠胚胎成纤维细胞的诱导多能干细胞Oct4 Klf4与小分子化合物 细胞干细胞 2008年 3 5 568年 574年 2 - s2.0 - 54949115497 10.1016 / j.stem.2008.10.004 冯 B。 Ng j . H。 恒 j . c, D。 Ng H . H。 分子,促进或提高体细胞重编程细胞诱导多能干细胞 细胞干细胞 2009年 4 4 301年 312年 2 - s2.0 - 62949220231 10.1016 / j.stem.2009.03.005 阿里身上 E。 Rechavi G。 Rozenblatt 年代。 Givol D。 重组人类成纤维细胞的多能干细胞使用信使rna的四个转录因子 生物化学和生物物理研究通信 2010年 394年 1 189年 193年 2 - s2.0 - 77949793550 10.1016 / j.bbrc.2010.02.150 天使 M。 Yanik m F。 先天免疫抑制使频繁的重组蛋白质与RNA转染编码 《公共科学图书馆•综合》 2010年 5 7 2 - s2.0 - 77955352428 10.1371 / journal.pone.0011756 e11756 沃伦 l 诺斯 p D。 Ahfeldt T。 Loh y . H。 李 H。 刘 F。 Ebina W。 Mandal p K。 史密斯 z D。 迈斯纳 一个。 戴利 g . Q。 分等 答:S。 柯林斯 J·J。 考恩 C。 Schlaeger t M。 罗西 d . J。 高效重组多能性和定向分化的人类细胞信使rna合成修改 细胞干细胞 2010年 7 5 618年 630年 2 - s2.0 - 77958536106 10.1016 / j.stem.2010.08.012 Bosnali M。 Edenhofer F。 代的转录因子Oct4和Sox2 transducible版本 生物化学 2008年 389年 7 851年 861年 2 - s2.0 - 49149127200 10.1515 / BC.2008.106 周 H。 吴 年代。 锺株 j . Y。 朱 年代。 汉 d . W。 林 T。 Trauger 年代。 好 G。 姚 年代。 朱 Y。 Siuzdak G。 Scholer h·R。 段 l 丁 年代。 代使用重组蛋白诱导多能干细胞 细胞干细胞 2009年 4 6 581年 2 - s2.0 - 66049090360 10.1016 / j.stem.2009.05.014 Edenhofer F。 蛋白质转导的再现:小说的见解机制细胞内的蛋白质 当前的药物设计 2008年 14 34 3628年 3636年 2 - s2.0 - 59849102702 10.2174 / 138161208786898833 阿甘 j . M。 懒散的女人 美国F。 答转导:分子机制和治疗前景 分子医学的趋势 2007年 13 10 443年 448年 2 - s2.0 - 35248880092 10.1016 / j.molmed.2007.08.002 布鲁克斯 H。 Lebleu B。 维维斯 E。 答peptide-mediated细胞交付:回到基础 先进的药物输送的评论 2005年 57 4 559年 577年 2 - s2.0 - 13844256698 10.1016 / j.addr.2004.12.001 Krosl J。 奥斯丁 P。 Beslu N。 克朗 E。 汉弗莱斯 r·K。 工作” G。 造血干细胞的体外扩张TAT-HOXB4重组蛋白质 自然医学 2003年 9 11 1428年 1432年 2 - s2.0 - 0344413639 10.1038 / nm951 Kwon y D。 哦 美国K。 金 h·S。 Ku s Y。 金 s . H。 崔 y . M。 月亮 s Y。 人类胚胎干细胞的细胞操纵TAT-PDX1蛋白质转导 分子治疗 2005年 12 1 28 32 2 - s2.0 - 20844449780 10.1016 / j.ymthe.2005.03.010 兰德里 j . R。 金斯顿 年代。 Knezevic K。 De Bruijn m·f·t·R。 威尔逊 N。 诺丁汉 w·T。 Peitz M。 Edenhofer F。 Pimanda j·E。 Ottersbach K。 Gottgens B。 Runx基因的直接目标sci /高卵黄囊和胎儿肝脏 血 2008年 111年 6 3005年 3014年 2 - s2.0 - 42449101777 10.1182 / - 2007 - 07 - 098830血 股票 K。 Nolden l Edenhofer F。 Quandel T。 Brustle O。 神经干细胞分化转录的因素调制使用直接蛋白质转导 细胞和分子生命科学 2010年 67年 14 2439年 2449年 2 - s2.0 - 77954582967 10.1007 / s00018 - 010 - 0347 - 1 Haupt 年代。 鲍格才家族 l Brustle O。 Edenhofer F。 非遗传性调制的切口人工交付活动的切口胞内域成神经干细胞 干细胞的评论和报道。在新闻 Keramari M。 哈扎维 J。 Ingman k。 Patsch C。 Edenhofer F。 病房 c . M。 金柏 美国J。 Sox2在胚胎滋养外胚层的形成至关重要 《公共科学图书馆•综合》 2010年 5 11 2 - s2.0 - 78649751050 10.1371 / journal.pone.0013952 e13952 金 D。 金 c . H。 月亮 j . I。 钟 y G。 常 m . Y。 汉 b S。 Ko 年代。 杨 E。 查 k . Y。 兰扎 R。 金 k . S。 一代的人类诱导多能干细胞直接交付的重组蛋白质 细胞干细胞 2009年 4 6 472年 476年 2 - s2.0 - 66049143859 10.1016 / j.stem.2009.05.005 赵 h·J。 李 c·S。 Kwon y W。 Paek j·S。 李 s . H。 户珥 J。 李 e . J。 卢武铉 t Y。 楚 i S。 Leem s . H。 金 Y。 康 h·J。 公园 y . B。 金 h·S。 从成年体细胞诱导多能干细胞蛋白质重组没有遗传操作 血 2010年 116年 3 386年 395年 2 - s2.0 - 77955437362 10.1182 / - 2010 - 02 - 269589血 曼斯菲尔德 j . H。 Harfe b D。 尼森 R。 Obenauer J。 Srineel J。 乔杜里 一个。 Farzan-Kashani R。 朱克 M。 Pasquinelli 答:E。 Ruvkun G。 锋利的 p。 Tabin c·J。 麦克马纳斯 m . T。 MicroRNA-responsive“传感器”转基因揭开Hox-like和其他发育调节脊椎动物微rna表达模式 自然遗传学 2004年 36 10 1079年 1083年 2 - s2.0 - 6944246368 10.1038 / ng1421 他们的 M。 Munst B。 Edenhofer F。 f.edenhofer@uni-bonn.de 探索精制条件重新编程细胞重组Oct4蛋白质 国际发育生物学杂志》上 2011年 54 11 - 12 1713年 1721年 10.1387 / ijdb.103193mt Kellendonk C。 Tronche F。 莫纳亨 答:P。 Angrand p . O。 斯图尔特 F。 舒兹 G。 Cre重组酶活动的调控合成类固醇RU 486 核酸的研究 1996年 24 8 1404年 1411年 2 - s2.0 - 0029874029 10.1093 / nar / 24.8.1404 应 问:L。 尼克尔斯 J。 埃文斯 e . P。 史密斯 a·G。 改变力量自发融合 自然 2002年 416年 6880年 545年 548年 2 - s2.0 - 0037041428 10.1038 / nature729 高桥 K。 Okita K。 中川昭一 M。 实验: 年代。 诱导多能干细胞的成纤维细胞的文化 自然的协议 2007年 2 12 3081年 3089年 2 - s2.0 - 39149086020 10.1038 / nprot.2007.418 Peitz M。 Pfannkuche K。 Rajewsky K。 Edenhofer F。 疏水FGF的能力和基本答肽重组Cre重组酶的促进细胞吸收:高效的哺乳动物基因组的基因工程的工具 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 2002年 99年 7 4489年 4494年 2 - s2.0 - 0037007121 10.1073 / pnas.032068699 何 一个。 “黑 s R。 Mermelstein 美国J。 Waksman G。 懒散的女人 美国F。 合成蛋白质转导域:增强转导潜在的体外和体内 癌症研究 2001年 61年 2 474年 477年 2 - s2.0 - 0035863391