长期储存的蔬菜果汁被高静水压力:微生物安全的保证

文摘

食品经营者寻找新的温和的技术,延长产品的保质期不改变的感官和营养特性。高的静水压力(水马力)满足这些需求;然而它也引发细菌细胞的亚致死的伤。亚致死的伤可能破坏产品在存储和造成重大的公共健康问题。本研究旨在检验的变化尚不致命的受伤病原体细胞两种蔬菜汁:胡萝卜汁(pH值6.0 - -6.7)和甜菜根汁(pH值4.0 - -4.2)所引起的水马力(300 - 500 MPa)。细菌细胞复苏的可能性在28天的果汁存储在两个不同的温度下(5°C和25°C)测定使用平皿计数方法。在整个期间存储的胡萝卜汁在冷藏温度下,传播和再生l . innocua菌株被观察到。存储在25°C之间的显示,这些细菌的数量大大减少14和21天。上述现象中没有检测到大肠杆菌的情况。没有细胞复苏期间长期冷藏库中所有菌株甜菜根汁。但是,在某些情况下破坏本产品间歇地发生在25°C储存温度。这项工作表明,胡萝卜汁支持增长和再生HHP-sublethally受伤l . innocua,而甜菜根汁可分为安全的产品。

1。介绍

蔬菜汁属于功能性食品和人类的饮食中发挥重要作用。先前的研究表明,他们的一些评论可以帮助预防几大文明的疾病,如心脏病,癌症,糖尿病,肥胖,以及预防和减轻一些微量营养素缺乏的1- - - - - -3]。鉴于其与健康有关的属性,他们吸引了伟大的消费者的兴趣。胡萝卜(胡萝卜胡萝卜)和红甜菜(甜菜属)是传统,在世界许多地方受欢迎的蔬菜。它们含有天然抗氧化剂,高数量的维生素、矿物质和微量元素(4- - - - - -8]。然而,生蔬菜汁市场潜力有限,由于它的保质期短,通常应该在几天内消耗(9]。此外,蔬菜汁商用生果汁(之间的污染最严重10,11]。最初的微生物负载通常是大约6.0日志CFU /毫升(11,12),包括病原体(11,13]。蔬菜汁污染的原因之一,有潜在危险的微生物天然肥料,通常应用于生态农业(14]。土壤中病原菌生存相对较长的一段时间,这取决于环境条件。值得注意的是,原始的低酸性条件,未加工的蔬菜果汁导电病原微生物的生长,如沙门氏菌spp。单核细胞增多性李斯特氏菌,大肠杆菌O157: H7,金黄色葡萄球菌,或空肠弯曲杆菌(11,13- - - - - -17]。所以,一些制造商降低pH值的蔬菜汁使用抗坏血酸或添加苹果汁延长货架寿命,并提供安全的新鲜果汁。尽管有这些努力,最经常发现病原体在未经高温消毒的新鲜的甜菜根和胡萝卜果汁李斯特菌物种和大肠杆菌群11,18]。

高静水压力(水马力)已经正式由美国食品和药物管理局批准,作为一个非热能的巴氏灭菌法技术(19]。如今,食品行业成员的水马力吸引了广泛的关注,是最成功的商业化非热处理技术(19,20.]。这种技术可以获得更高质量的食品,而不是使用传统方法处理。为主,不明显改变产品的感官和营养属性但减少了微生物计数负责损坏和缩短保质期(21- - - - - -26]。尽管上述好处,水马力引发细菌细胞的亚致死的伤27- - - - - -31日]。

一般来说,水马力诱发不同程度的亚致死的伤害。高压改变细胞形态学和遗传机制,抑制代谢反应,为细胞的维护是必不可少的(26]。这些现象可能会有所不同取决于级属甚至种类的微生物,类型的衬底、加工参数。不同的食物保存策略带来不同的压力因素影响产品的微生物群。科学研究取得了一些重要的信息因素,影响食品中细菌细胞的损伤和恢复矩阵(32,33]。现在,很明显,两种现象取决于类型的技术,以及环境条件如食物的pH值,存储温度、添加各种组件等食物营养,防腐剂,等。监管网络允许强调细菌反应变化通过激活适当的机制,它允许它们适应(33]。亚致死的受伤的细胞可能存在于人口,尽管大多数微生物死亡。此外,食物矩阵可以抑菌杀菌,由于内在因素包括水活动,pH值,含盐量,等。受伤的细胞可以产生适应性反应压力,恢复介质包含必要的营养物质,在存储和成长。另一方面,受伤的细胞可能会对物理和化学环境的敏感性,对正常细胞耐药(33)和失去的能力定义培养基上生长。亚致死的受伤的细胞在食品的存在带来了重大公共卫生问题和评估是至关重要的微生物对食品保存策略(34]。另一方面,只有一小部分的商人供应商提供HHP-treated蔬菜汁(25]。此外,没有高压食品是目前市场上在室温下(20.,26]。

根据欧洲委员会规定(EC) 2073/2005号(35制造商有义务确保微生物安全的食品保质期宣布结束。除了食品微生物标准,以上文档指定了方法证明微生物传播的可能性在产品的货架寿命。这些工具之一是微生物挑战测试。挑战测试是一个实际的研究评估至关重要的有机体的行为(如病原体),显示和/或生存的机会在矩阵的食物,如果是这样的话,他们会有多快。检查食品污染相关微生物,然后存储和检测这些生物在保质期(36,37),用于估计增长潜力( )。

本研究的目的是评估的存活率和再生的可能性HHP-sublethally受伤细菌细胞在两种类型的蔬菜汁长期存储在两个不同的温度。此外,HHP-sublethally受伤的行为的理解细胞在存储可能有助于设计和控制过程,以及建立保持时间限制存储。

2。材料和方法

2.1。微生物生长条件

大肠杆菌写明ATCC 7839(从美国输入文化获得收集、马纳萨斯、美国)l . innocuaCIP80.11T(从文化的巴斯德研究所,获得巴黎,法国)野生菌株,与未经高温消毒的,商业甜菜汁,l . innocua23/13和大肠杆菌61/14,从部门收集的水果和蔬菜获得产品技术IAFB(华沙,波兰),被用于这个调查。菌株被存储在一个精子银行在温度低于-27±3°C。首先,纯培养无菌珠固定化是添加到10毫升无菌脑心浸液肉汤(BHI)(我'Etoile BioMerieux,法国)。肉汤亚文化在37°C孵化24 h,然后用10每一夜之间文化感动µL在培养皿中循环,与平板划线分离技术的使用与胰蛋白酶的大豆(TSA)琼脂(Biocar诊断、博韦、法国)大肠杆菌或大豆胰蛋白酶的酵母提取物(TSYE)琼脂(Biocar诊断、博韦、法国)l . innocua。接下来,从板增加了文化,使用10µL循环,250毫升厄伦美厄烧瓶内包含200毫升的大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB) (Biocar诊断、博韦、法国),或与酵母提取物大豆胰蛋白酶的肉汤(TSBYE) (Biocar诊断、博韦、法国),准备第二次文化,孕育了37°C 18 h获取固定相的文化。然后10毫升的第二个亚文化是添加到新鲜、无菌肉汤(TSB或TSYEB)和孵化37°C 18 h。文化被离心收获(4000×g, 10分钟。4°C)。沉淀细胞无菌resuspended到磷酸盐(PBS, pH值7.4)离心机。洗涤过程重复两次。这之后,细菌细胞悬浊液准备在PBS的典范。只是水马力治疗前,巴氏杀菌甜菜根汁和苹果汁5%补充(维多利亚酶类,pH值4.0 - -4.2)和胡萝卜汁(至关重要的新鲜,pH值6.0 - -6.7)注射细菌悬浮液,在一个约7.0日志CFU /毫升,由传播镀TSA / TSYEA适当稀释,并转移到无菌聚乙烯管(美国牛顿Sarstedt) 13毫升部分复制。

2.2。水马力的设备

样品暴露在高压治疗,使用4000 U/65设备(Unipress华沙,波兰)。处理室的体积是0.95 L,和最大工作压力是600 MPa。pressure-transmitting液,使用蒸馏水和聚丙二醇(1:1,v / v)。仪器的工作温度范围从−10°C + 80°C。400 MPa的压力在70 - 80年代,生成和释放时间2 - 4。样品受到高的静水压力在不同的压力,根据应变和果汁(300、400、500 MPa),环境温度(即。,大约20°C)和5或10分钟(表1)。不同的压力参数的使用旨在归纳尚不致命的细菌伤害的最高水平的样本。这些工艺条件触发的最高水平的亚致死损伤细胞菌株,选择基于我们早期的研究(38,39]。温度升高,由于绝热加热,大约是每400 MPa 3°C。增压时报报道不包括上来和惨败。为每个测试应变、果汁和存储温度,使用两个独立的进行了化验样本,来自两个独立的过程。治疗后,样本存储在5°C和25°C到28天,定期分析。非承压的样本作为控制。

2.3。平皿计数分析方法

每个品种的可行性被计数菌落化验水马力后立即处理。此后,定期处理和未经处理的果汁都列举在冷藏库。在每个采样时间,与样品管打开无菌和分析。胰蛋白胨进一步十进制稀释盐汤(Biokar诊断、博韦、法国),每个样本的准备。适当稀释的样本在琼脂扩散。项总可行的细胞由板在TSA或TSYEA传播。选择性琼脂,琼脂,补充关键生理盐水(POCh、格利维策、波兰)的浓度5% (w / v),被用来确定noninjured细胞人口。最大浓度的氯化钠,没有造成轻的菌落计数细胞,减少估计的初步试验。亚致死的受伤的幸存者被量化的数量差异,在可行和noninjured细胞之间。与非选择性琼脂板是孵化24 h / 37°C和选择性琼脂48 h / 37°C。 The plates containing less than 300 CFU/mL were selected for counting.

2.4。统计分析

统计分析的结果是由双向方差分析统计模型与图基的测试,使用Statistica版本13 (TIBCO软件公司,帕洛阿尔托,CA,美国)。的差异被认为是重要的p <0.05。统计结果进行比较,获得菌株相同的物种在同一温度和矩阵。

3所示。结果与讨论

3.1。存储温度的影响大肠杆菌和l . innocua在蔬菜汁

在目前的研究中,两种类型的高压treated-vegetable果汁(甜菜根和胡萝卜)分析了在存储四个星期的时间来测试他们的微生物安全。我们测试如果亚致死的受伤水马力细菌细胞能够再生和生存的蔬菜汁。第二个目标是调查如果存储环境温度会支持HHP-treated细菌的增长相比,冷藏条件。作为一个初步的实验,我们研究了水马力对测试的影响的物种,在前面提到的类型的果汁范围200 - 500 MPa的压力到10分钟。下一步是做筛查分析选择参数,产生最高水平的亚致死的伤的菌株。结果表明,在胡萝卜汁400 MPa的压力5分钟触发尚不致命的伤害英诺克李斯特菌这些细菌菌株,而扩展参数使其失去活性。反过来,大肠杆菌株亚致死的受伤500 MPa的压力下5分钟(数据未显示)。诱导细菌细胞的亚致死损伤甜菜根汁需要温和的参数:300 MPa 10分钟(38,39]。因为前面提到的,这个实验显示了执行结果只有thoseparameters的使用,促使亚致死的伤害(表的最高水平1)。

菌株的生存能力,在未经处理的汁样本,如图1。尽管甜菜根汁、酸pH值明显降低人口的所有测试菌株在存储温度(没有被观察到p≥0.05)。可行的细胞数量,测试菌株的甜菜根汁在温度,减少了小于1.0日志CFU /毫升所有期间的存储。只、l . innocua野生型菌株在甜菜汁,储存在25°C,减少约2.1日志CFU /毫升。在胡萝卜汁,储存在5°C之间的可行的测试菌株的细胞数量7和10日志CFU /毫升。整个期间的存储的可行性大肠杆菌稳定,而传播的l . innocua被观察到。的数量l . innocua在人口增加了1.8和3.3日志根据应变。反过来,结果25°C表明数量的可行性大肠杆菌细胞增加约1.0日志CFU /毫升,而显著差异被发现l . innocua。的存活率l . innocua压力与温度相关的负面。这些细菌的数量大大减少,14至21天的存储,在25°C。监测胡萝卜汁的pH值(暂停l . innocua株)表明该参数从6.2下降到4.2在28天的存储,当pH值没有发现细菌的胡萝卜汁稳定的存储(6.18±0.04)。

帕特森et al。(2012)表明,胡萝卜汁的发展本质上是有害的l . monocytogenes。他们观察到的病原菌生存两个变量的胡萝卜汁控制样品,在十天的存储在4°C, 8°C,和12°C。,热量和nonheat消毒、胡萝卜汁控制样本接种的鸡尾酒l . monocytogenes然后存储。的数量l . monocytogenes悬浮在nonheat胡萝卜汁,在冷藏温度下降6.56日志CFU /毫升5.06日志CFU /毫升和6.00日志CFU / mL,分别。前热消毒胡萝卜汁,李斯特菌在存储数字增加温度。据推测,这些差异与热敏特性相关的抗菌化合物在胡萝卜汁(胡萝卜汁的研究是巴氏杀菌)。另外,作者曾寻找胡萝卜汁属性的影响大肠杆菌。他们的结果与我们的研究结果相似。他们观察到的数量大肠杆菌在胡萝卜汁保持不变,而果汁是存储在4°C到14天;然而,增加在存储8°C和12°C。此外,热处理的胡萝卜汁在接种之前没有对增长的影响大肠杆菌。相同的结果是通过戈麦斯Aldapa et al。(2013)。据报道,diarrheagenic的鸡尾酒的增长大肠杆菌在胡萝卜汁是抑制致病型冷藏温度。24小时后所有diarrheagenic的数量大肠杆菌致病型增加在存储12°C, 20°C, 30°C, 37°C。一些研究人员一直试图回答,病原体会存活多久在酸果汁如果发生污染40- - - - - -42]。O157: H7大肠杆菌幸存在菠萝汁(pH值3.57)为120天在冷藏温度,但在室温储存,有些数下降。反过来,鳄梨汁(pH值6.2)支持增长,这些细菌在温度(40]。相当数量的单核细胞增多性李斯特氏菌悬浮在番茄汁幸存在存储在5°C和30°C为12天;然而计数细菌略有下降的冷藏温度(41]。Oyarzabal et al .(2003)显示O157: H7大肠杆菌,单核细胞增多性李斯特氏菌,沙门氏菌通过12周可恢复的存储在苹果-23°C,橘子,菠萝,和白葡萄汁集中(pH值3.6 - -3.7)和香蕉泥(pH值5.5)。

3.2。长期储存和温度影响的存活和再生HHP-Sublethally受伤大肠杆菌和l . innocua在蔬菜汁

长期储存的影响HHP-injured生存的细菌菌株,胡萝卜和甜菜根汁,如图2和3。的存活率l . innocua在胡萝卜汁四周冷藏库类似于集合和野生型菌株(图2(一个))。这是观察到细菌的数量人口显著增加,3.64日志CFU /毫升和2.98日志CFU /毫升,分别在引用初始HHP-treated活细胞计数。甜菜根汁的减少l . innocua细胞在人群中被发现(图2(一个))。21天的存储,野生型菌株细胞没有检测到。一周后,收集应变也低于检测水平(1.0日志CFU /毫升)。大肠杆菌经济增长在长期冷藏没有观察到,在胡萝卜汁和甜菜根汁(图3(一个))。然而,细胞减少人口的发展明显快于甜菜根汁在四周冷藏储存。的数量大肠杆菌收集和野生型菌株的细胞数量减少。在胡萝卜汁的情况下,减少3.57和2.05日志CFU /毫升。甜菜根汁时,下降5.42和3.19日志CFU /毫升,在引用初始微生物计数,只是水马力治疗后。的大肠杆菌甜菜根汁完成人口将近1.0日志CFU / mL后21天的冷藏库。然而,扩展存储时间4周显示这些细菌微生物的增长。

的数量l . innocua在人口增长了超过3.0日志CFU /毫升的4天中存储的胡萝卜汁25°C(图2 (b))。随后存储导致这些细菌的数量快速减少的样本。后三周期间,增长并没有观察到。的增长大肠杆菌才注意到,在第一个48 h(存储在25°C(图3 (b))。在接下来的12天的存储、生存的大肠杆菌菌株在水马力,发现胡萝卜汁稳定,达到9日志CFU /毫升。然而,在那个时候,野生型菌株的数量略有减少日志CFU /毫升(图2.403 (b))。的数量l . innocua细胞数量下降了7天后的甜菜根汁存储25°C(图2 (b))。扩展引起的储存时间单一变质的产品。最后一天的存储,l . innocua收集菌株细胞达到4.26日志CFU /毫升,而野生型菌株的检测极限。相反的现象被观察到大肠杆菌(图3 (b))。收集菌株的数量HHP-beetroot汁在1.0日志CFU /毫升,年底期间存储25°C。在同一存储条件下,大肠杆菌野生型菌株增加,达到3.0日志CFU /毫升28天。增长潜力的结果( )如表所示2。只的情况l . innocua菌株在胡萝卜汁,储存在5°C,增长潜力高于0.5日志CFU /毫升。这个结果意味着的胡萝卜汁支持增长l . innocua,这是储存在冷藏条件。在其他果汁样品,细菌增长潜力的价值低于临界值。因此,这些条件阻碍测试菌株的传播。

的变化尚不致命的伤害蔬菜汁的细菌细胞,在长期储存在5°C和25°C,如表所示3和4,分别。菌株的初始水平的亚致死的伤,水马力治疗后,2.9 - -4.5日志CFU /毫升。亚致死的受伤的再生细胞观察悬浮在胡萝卜汁。的再生l . innocua后的第一天,在5°C(表存储3(表)和25°C4)是显著的。受伤的细胞的数量大肠杆菌收集应变显著下降(p< 0.05),冷藏的第七天。此后,一些不同的亚致死的受伤的细胞被发现,尽管他们没有统计学意义(p≥0.05)。第一个7天的存储、亚致死的受伤的野生型细胞的再生大肠杆菌也观察到。延长储存时间导致的数量逐渐增加受伤的野生型细胞大肠杆菌。28天的存储,受伤的细胞达到的水平翻了一番(5.43日志CFU /毫升)。减少的趋势尚不致命的伤害大肠杆菌,在存储HHP-carrot汁的25°C,也观察到。这种现象是快得多,比在5°C(表4)。24小时后的存储,再生细胞收集应变是0.48日志CFU /毫升3.54 5°C和日志CFU /毫升25°C。在大多数情况下,没有明显的细胞复苏,在长期冷藏库中所有菌株甜菜根汁(表3)。然而,亚致死的受伤的细胞的数量减少在细菌死亡人口(数据的视图2(一个)和3(一个))。长期储存的甜菜根汁25°C显示复苏的受伤病原体细胞可能发生,尽管破坏本产品的间歇性发生(表4,数据2 (b)和3 (b))。

碱性pH值矩阵表明,这是令人难以置信的挑战,实现微生物净化的水马力(20.]。尽管相信水马力技术适用于酸产品,科研人员仍在寻找这种高压力的应用矩阵(6,24,25,43]。类似于我们的研究中,帕特森et al。(2012)观察到HHP-injured的人口大肠杆菌(500 MPa, 1分钟。)在随后的胡萝卜汁存储有所下降。只是压力治疗后,失活是1.82日志CFU /毫升,而第十天,这些细菌的数量达到检测不到的水平,独立于存储温度。相同的水马力条件灭活的鸡尾酒l . monocytogenes在胡萝卜汁。在14天的存储在任何温度下,它仍低于检测极限。研究损伤引起的水马力在微生物和随后的复苏果汁已被几组研究人员报道(21,22,34,44,45]。到目前为止,pressure-induced受伤微生物甜菜根汁已报告在一些出版物31日,46- - - - - -48]。不幸的是,有较小的数据存储的影响。Buzrul et al。(2008)使用温和的水马力(5分钟。350 MPa)灭活大肠杆菌和英诺克李斯特菌在猕猴桃(pH值3.32)和菠萝汁(pH值3.77)。他们调查的影响存储在这些微生物的生存,在上述果汁,在不同的温度下(4°C, 20°C, 37°C)。失活了超过1.0日志CFU /毫升,在存储在4°C 24 h,对细菌在果汁。在随后的三个星期的存储,测试温度,没有果汁中检测到损伤恢复。同样的现象被观察到约旦et al。(2001)大肠杆菌橙色、番茄和苹果果汁。

许多研究证实,HHP-treated蔬菜汁的自然微生物群在存储过程中会恢复。Picouet et al。(2015)监控三个微生物组恢复,冷藏7到21天,HHP-treated胡萝卜汁600 MPa下5分钟。尽管如此,总厌氧菌细菌仍低于检出限在第一周的存储。21天,这些细菌在nonacidified达到1.2日志CFU /毫升(pH值6.48)和4.3 CFU /毫升登录酸化(pH值5.5)汁。反过来,酵母和霉菌数量达到相当于或低于3.0日志CFU /毫升。作者得出结论,酸化的胡萝卜汁不方便地延长产品的货架寿命。Zhang et al。(2016)显示,土著微生物群的胡萝卜汁,保留由水马力(550 MPa, 6分钟),经过20天的储存在冷藏温度略有增加。与上述类似,帕特森et al。(2012)观察到,HHP-injured胡萝卜汁的自然微生物群(500和600 MPa, 1分钟)恢复快12°C(7日志CFU /毫升10天的存储),而不是在4°C(3日志CFU /毫升22天的存储)。治疗,此外,他们注意到压力显著延迟复苏和增长生存的微生物,在未经处理的汁样品参考。Sokołowska et al。(2014)观察到的腐败微生物总计数HHP-beetroot汁(400 MPa, 10分钟)不变10天的冷藏库。 Then, there was an increase of contamination to more than 3.0 log CFU/mL. In turn, indigenous microbiota in fruit juices normally had been not recovered during long-term storage, even if juice was preserved by mild-HHP treatment [49,50]。木村et al。(2017)观察到水马力可能不同细胞,损伤程度和氧化应激可能在水马力治疗后继续工作。根据存储环境,复苏和恢复细胞可能成倍增加,之前其他受伤的细胞完全复苏。微生物细胞,幸存的增压,也成为亚致死的受伤和发展对环境的敏感性,而正常细胞耐药(51]。

新版本的ISO 11290 - 1:2017微生物的食物chain-Horizontal方法的检测和枚举单核细胞增多性李斯特氏菌和李斯特菌spp.-Part 1:检测方法,不考虑复苏步骤。从人类的健康安全的观点可能是有风险的决定,特别是由于系统(入侵)形式的李氏杆菌病是现在公认比以前更频繁地发生在小暴发认可(52]。因为受伤的细菌细胞显示有限的可能性,甚至无法在选择性琼脂,生长,由于上述事实,亚致死的受伤的细胞应该需要额外注意食品质量控制部门运营商。这方面需要特别了解,以防产品是否是保留通过非热能的替代技术,通过诱导亚致死的伤。食品法典委员会(CAC)提出以下标准来描述食品的产品支持l . monocytogenes增长。是写在CAC:“RTE食品中有一个大于平均增加0.5的日志级别的有机体,至少在预期寿命(标记的制造商)在合理可预见的条件下的分布、存储和使用消耗,包括安全裕度”(CAC, 2009)。加工食品和即食食品(RTE)与长期在冷藏条件下保质期为李氏杆菌病(风险产品40]。Uyttendaele et al。(2009)观察到的增长l . monocytogenes在三种类型的即食产品,储存在冷藏温度测试的挑战。他们认为,食品是否支持的增长l . monocytogenes与否主要取决于物理化学因素(pH值, ,包装大气)的食物矩阵,而不是定义为这样的食物类型。

4所示。结论

这项研究的结果表明,胡萝卜汁支持增长和再生HHP-sublethally受伤l . innocua。基于上述数据,HHP-treated甜菜根汁可分为安全产品,而胡萝卜汁可以归类为高风险食物。我们的研究结果证实,HHP-treated蔬菜汁需要在冷藏条件下保存。然而,需要进行更多的科学研究发现细菌的理解机制,参与细胞复苏在食品存储矩阵。

预测微生物学是一个有用的方法来帮助评估食品安全和保质期的产品,建立了食品的内在和外在特征。然而,良好生产规范(GMP),卫生习惯(GHP)、开发、和实施程序,基于HACCP,在维护食品安全,基本设置,验证食品保质期。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

道德间隙是不需要,没必要为这个研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关文章的发表。

确认

这项工作得到了教授Wacław Dąbrowski农业与食品学院生物技术。

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