葡萄糖异构酶发酵条件和培养基的优化芽孢杆菌megaterium响应面法

摘要

葡萄糖异构酶是食品工业中广泛用于生产高果糖玉米糖浆的一种酶。许多微生物,包括芽孢杆菌megaterium已发现能够生产葡萄糖异构酶。但是，葡萄糖异构酶生产的研究数量芽孢杆菌megaterium是有限的。在这项研究中，我们建立了最佳介质部件和培养条件芽孢杆菌megaterium通过在ModDe 5.0软件中通过Plackett-Burman设计和响应表面方法评估多因素和不同参数的组合影响来评估葡萄糖异构酶生产。经过实验证实的优化条件如下：D-木糖（1.116％），K₂HPO_4.(0.2%)、MgSO_4.h·7₂O(0.1%)，酵母提取物(1.161%)，蛋白胨(1%)，pH 7.0，接种量20% (w/v)，在36.528°C下振荡120 rpm 48小时，产生最高活性的葡萄糖异构酶(0.274 0.003 U/mg biomass). These results provide additional important information for future development of large-scale glucose isomerase production by芽孢杆菌megaterium。

1.介绍

高果糖玉米糖浆(HFCS)是一种葡萄糖-果糖的混合物，广泛用于食品工业中作为一种低热量甜味剂。葡萄糖异构酶等异构酶的处理为高果糖玉米糖浆的生产提供了一种高效、节约成本的方法。葡萄糖异构酶又称d -葡萄糖异构酶和d -木糖异构酶，是催化葡萄糖向果糖、木糖向木糖异构化的胞内酶;因此，它加速了食品的甜味，对高果糖玉米糖浆的生产起着重要作用。1957年，马歇尔和库伊首次报道了一种存在于完整细胞或声波提取物中的酶pseudomonas疏水龙，最近被命名为葡萄糖异构酶，可以将d -葡萄糖转化为d -果糖，生产高果糖玉米糖浆[1]．此外，1967年，克林顿玉米加工公司首次将葡萄糖异构酶用于工业化规模的高果糖玉米糖浆生产[2]．此后几十年，食品工业对HFCS的利用和需求显著增加。由于葡萄糖异构酶在HFCS生产中的应用，到目前为止，它是食品工业中最常见的酶之一[3.]．此外，葡萄糖异构酶用于乙醇生产，因为葡萄糖异构酶也可以将木糖转化为木瓜糖，为嗜酸性细菌提供营养素，并支持半纤维素的生物合成以产生生物乙醇。在市场上，商业化的葡萄糖异构酶产品被出售为固定化酶和细胞。这些产品的酶活性受到各种因素，例如金属阳离子，微生物源，pH和温度的存在。存在一些二价金属阳离子，如mg^2＋和有限公司^2＋或锰^2＋，已被证明能增强葡萄糖异构酶活性，而其他金属阳离子，包括Ag⁺、汞^2＋、铜^2＋、锌^2＋， 你^2＋和加利福尼亚州^2＋已被证明能降低酶的活性。此外，葡萄糖异构酶的酶活性也受到木糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇等的抑制[4.]．

几种微生物源已被用于实验室规模的葡萄糖异构酶生产，如链霉菌属spp。关节杆菌spp。thermosulfurogenes梭状芽胞杆菌那假单胞菌spp。ThermoanaErobacterspp。ThermoanaIrobacterium.spp。双歧杆菌spp。,芽孢杆菌spp。4.那5.]．工业规模使用的大多数商业化葡萄糖异构酶都是由链霉菌属spp。关节杆菌spp。游动放线菌属missouriensis,芽孢杆菌coagulans．然而，使用芽孢杆菌megaterium葡萄糖异构酶的中试生产和产业化规模有限。芽孢杆菌megaterium，一种嗜苯胺细菌，已被称为生产青霉素酰胺酶，淀粉酶，葡萄糖脱氢酶和杀真菌和抗病毒剂的重要工业微生物。1962年，Takashima和Takabe首先分离出葡萄糖异构酶芽孢杆菌megaterium，命名为d -葡萄糖酮异构酶，具有与其他葡萄糖异构酶不同的特点。这种酶是NAD⁺对葡萄糖具有高度的特异性[6]．此外，Mukesh-Kumar等人还确定了单个发酵因素如pH、温度和培养时间对一次一次法的影响[7]．然而，培养成分的多因素的综合影响，例如营养成分（D-木糖，K.₂HPO_4., MgSO_4.研究了不同转速、pH、温度、接种量和培养时间对葡萄糖异构酶生物合成的影响芽孢杆菌megaterium尚未阐明。本研究研究了营养成分和栽培条件等多种栽培参数对葡萄糖异构酶生产的综合影响，并对主要栽培参数进行了优化芽孢杆菌megaterium在Modde 5.0软件中使用Plackett-Burman设计和响应表面方法产生最大葡萄糖异构酶活性。

2.材料和方法

2.1。化学品

除非另有说明，所有试剂均从HiMedia Laboratories Ltd. (Mumbai, India)获得微生物级或分析级。Carbazole (Supelco 442506)和cysteine hydrochloride (C7880)购自Sigma-Aldrich Ltd. (Missouri, USA)。

2.2。细菌菌株，生长曲线测量，葡萄糖异构酶生产和提取

的芽孢杆菌megaterium本研究中使用的菌株从虾养殖池中分离，鉴定和沉积在越南国立大学的生物转换大学的生物转化实验室中沉积和沉积在Ho Chi Minh City。

在37°C的富集培养基(0.25%酵母提取物，0.5%蛋白胨，0.15% K)中培养单株菌株过夜₂阿宝_4.， 0.5% d -木糖，0.05% MgSO_4.h·7₂O, pH 7)。通过添加富集培养基调节过夜培养的浊度，达到最终OD值₆₀₀= 0.5。5毫升隔夜培养物(OD₆₀₀= 0.5)，每2 h检测细胞密度(CFU/mL)，持续40 h，建立生长曲线。

将静止相培养物（孵育后22小时）接种到新鲜诱导培养基中（0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，0.3％K.₂阿宝_4.， 1% d -木糖，0.1% MgSO_4.h·7₂o，pH 7.0）用于制备葡萄糖异构酶。将细菌培养物在37℃下，旋转速率120rpm温育48小时。温育后，离心悬浮液并除去上清液。收集颗粒，并测定生物质重量（Mg生物质）。然后，通过含有0.9％NaCl，0.1％溶菌酶和1％甲苯的萃取缓冲液将细胞溶解成最终浓度20mg生物量/ 1.5ml悬浮液。通过离心除去细胞碎片，用粗提取物用于进一步实验。

２.３.葡萄糖异构酶活性的测定

葡萄糖异构酶活性的测定采用先前报道的方法进行了一些修改[7]．简而言之，将0.2ml细胞悬浮液加入到含有0.5ml 0.2 m Na的0.5ml的异构化反应混合物中_3.阿宝_4.， 0.1 mL的0.1 M MgSO_4.， 0.1 mL的0.01 M CoCl₂h·6₂0.2 mL 1.0 M葡萄糖。反应混合物在70℃孵育1小时，然后依次加入2 mL 0.5 M高氯酸终止反应。用半胱氨酸-咔唑-硫酸法测定反应混合物中的果糖量，采用果糖标准曲线[8]．一个单位的葡萄糖异构酶活性定义为在测定条件下每分钟产生1μmole的酶的量。结果呈现为U / Mg生物质。

２.４.诱导培养基各组分对葡萄糖异构酶生产影响的测定

通过在诱导培养基(0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.3% K)中培养细菌，评估培养基中不同营养成分对葡萄糖异构酶生产的影响₂阿宝_4.， 1% d -木糖，0.1% MgSO_4.h·7₂o）在37°C下，使用单因素实验，旋转速率120rpm 48小时。为了优化碳源浓度，使用0.5％的间隔取代各种浓度的D-木糖浓度的D-木糖浓度为0.5％。通过在诱导介质式中替换各种浓度的磷酸二钾（0,0.1,0.2,0.3,0.4，0.5％）来确定磷酸二钾磷酸钾的最佳浓度。不同浓度的MgSO效果_4.(0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2和0.25%)也进行了分析。为研究不同浓度氮源的影响，以0.25%为间隔，将诱导培养基酵母膏浓度由0 ~ 1.25%变化。此外，还研究了不同浓度蛋白胨(0、0.5、1、1.5、2和2.5%)作为第二氮源的影响。之后，用前一节提到的方法测定酶活性。

2．5．单个发酵条件对葡萄糖异构酶产量影响的测定

通过在诱导培养基中生长细菌培养基（0.5％酵母提取物，1.0％蛋白胨，0.3％K，通过生长细菌培养来确定发酵因子对葡萄糖异构酶产生的影响。₂阿宝_4.， 1.0% d -木糖，0.1% MgSO_4.h·7₂O)单因素试验48小时。为了研究pH对葡萄糖异构酶生产的影响，以1.0单位间隔将诱导培养基的pH从5.5调整到8.0。将不同比例(5、10、15、20、25、30%)的细菌接种到诱导培养基中。通过在旋转速率范围内(80、100、120、140、160和180 rpm)摇动细菌培养物来选择最佳搅拌。不同培养温度的影响是通过在33 - 44°C的温度范围内培养细菌，间隔2°C来确定的。在所有条件下，酶活性测定都是用前一节提到的方法进行的。

2.6。优化发酵条件和葡萄糖异构酶生产的培养基组合物

为了优化用于生产葡萄糖异构酶的发酵条件和培养基组合物，通过Plackett-Burman设计鉴定了对葡萄糖异构酶产生具有显着影响的条件。在这种设计中，八个变量，例如D-木糖，MgSO的浓度_4.，K₂HPO_4.选用Plackett-Burman设计进行分析，选取置信度在95%以上的因素进行进一步优化。采用响应面法对结果进行分析，建立响应面和等高线图，可视化实验变量与响应之间的关系，并选择最优变量。

2.7。统计分析

所有实验都被复制。使用统计R软件（Lucent Technologies）进行统计分析。使用方差分析（ANOVA）和Fisher LSD测试分析不同组的手段之间的差异，并将统计显着性的标准设定为 ．数据显示为平均值±标准偏差。

3.结果和讨论

3．1.建立芽孢杆菌megaterium富集培养基中的生长曲线

在这项研究中，我们建立了生长曲线芽孢杆菌megaterium在含有0.25％酵母提取物的富集培养基中，0.5％蛋白胨，0.15％K.₂阿宝_4.， 0.5% d -木糖，0.05% MgSO_4.h·7₂O.接种后，在前6小时内稳定，该隐含细菌必须适应新培养基，0小时至6小时的时间是滞后阶段。下一期从8小时到22小时，细菌具有指数增长，并且细菌密度显着增加，这暗示了该时期是生长曲线的指数阶段。22小时后，细菌密度达到最大值，直至26小时不变，表明22小时至26小时的时间是生长曲线的固定相。28小时后，细菌密度降低，这提出了死亡阶段（图1）.为了在新培养基中获得最高的生长产量和缩短滞后期，我们建议在富集培养基接种后22小时接种诱导培养基中的细菌。

３．２．诱导培养基组分浓度对葡萄糖异构酶生产的影响

如图所示2当D-木糖浓度从0增加到1.5％时，酶活性从0.228至0.255 U / mg生物质逐渐增加。然而，D-木糖的浓度较高（从2.0-2.5％），酶活性从0.255降至0.233 U / Mg生物质。D-木糖是细菌的主要碳源，其对细菌生长起着重要作用。此外，D-木糖也是通过葡萄糖异构酶从葡萄糖转换为果糖的电感基材。因此，D-木糖浓度的增加将导致改善细菌生长和葡萄糖异构酶生物合成的活化。然而，较高浓度的D-木糖（2.0-2.5％）可以抑制细菌生长和降低酶活性（图2）.在之前的研究中，Prabhakar和Raju观察到在培养基中添加1%的d -木糖时，培养基中葡萄糖异构酶的活性最大节细菌属。而高浓度的d -木糖(2%)则显著降低了酶活性和细菌生物量，这与我们的结果一致[9]．统计分析表明，1% d -木糖与1.5% d -木糖之间无显著差异(0.256±0.003 vs 0.255±0.004 U/mg生物质)。因此，我们选择1% d -木糖作为葡萄糖异构酶的诱导产物。

K的影响₂HPO_4.葡萄糖异构酶生产的浓度也进行了评估。简单地说，添加0.2% K后，酶活性显著提高₂HPO_4.和没有K的情况相比₂HPO_4.(分别为0.248±0.003和0.219±0.004 U/mg生物量，）.然而，我们观察到酶活性的下降，而K的浓度₂HPO_4.分别为0.225±0.002和0.207±0.005 U/mg生物量，）.一起携带，我们确定了k的最佳浓度₂HPO_4.是0.2%(图3.）.磷酸盐是ATP，核苷酸和核糖核苷酸的主要成分;因此，它在能量生产，核酸和蛋白质生物合成中起着重要作用。因此，感应介质中磷酸盐的缺陷，例如没有k的培养基₂HPO_4.或含低浓度K的介质₂HPO_4.，导致葡萄糖异构酶活性降低。相反，磷酸盐浓度过高会导致蛋白质合成减少，这在以前的研究中有报道[10]．指出无机磷酸盐的积累会降低游离镁离子的浓度，从而阻碍蛋白质的合成。镁离子不仅在蛋白质合成中起重要作用，而且是葡萄糖异构酶的激活剂。因此，K的增加₂HPO_4.浓度对葡萄糖异构酶活性有抑制作用。此外，Gersch等还观察到磷酸盐对土霉素的次生代谢物生物合成的抑制作用链霉菌属hygroscopicus［11]．

MgSO_4.h·7₂O提供镁离子，这是细菌生长和葡萄糖异构酶活性的激活所必需的。我们发现酶活性随着MgSO的增加而增加_4.h·7₂O浓度(0.223±0.002和0.264±0.011 U/mg生物量)，）.注意MgSO的浓度较高_4.h·7₂O(0.15-0.25%)导致酶活性从0.248±0.001降至0.199±0.002 U/mg生物量(图3)4.）.根据这些数据，我们选择了MgSO的最佳浓度_4.h·7₂O是0.1%。这些数据与Chen等人报道的结果相似，他们观察到MgSO的最佳浓度_4.h·7₂O用于葡萄糖异构酶的生产Streptomyces flavogriseust.为0.1%，酶活最高(1.93 U/mg蛋白);较低浓度(0.03%)或较高浓度(0.5%)均导致酶活性下降[12]．

微生物对氮的需求是多样的;因此，不同微生物的氮源及其最适浓度也不同。本研究探讨了酵母提取物和蛋白胨对葡萄糖异构酶生产的重要性。我们观察到酵母提取物浓度从0调整到1%，同时酶活性从0.224±0.001增加到0.270±0.001 U/mg生物量(）.酵母提取物是细菌生长和蛋白质合成的主要氮源;由此，酵母提取物的增加加速了葡萄糖异构酶产生。一些作者表明，葡萄糖异构酶产生的酵母提取物的最佳浓度为0.5-1％，与我们的结果相同[9那13]．另一方面，酵母提取物浓度达到最大值(1.25%)，酶活性降低到0.243±0.001 U/mg生物量(图3)5.）.从这些数据中，我们选择1％的酵母提取物作为制备葡萄糖异构酶的酵母提取物的最佳浓度。

蛋白胨是微生物常见的有机氮源之一，在葡萄糖异构酶的生产中起着关键作用乳酸菌bifermentans和链霉菌属thermonitrificans［14那15]．如图所示6，当蛋白胨浓度从0增加到1%时，酶活性从0.182±0.002增加到0.263±0.004 U/mg生物量(）.酶活性随蛋白胨浓度的增加而降低(1.5 ~ 2.5%)。因此，我们选择1%蛋白胨作为产生葡萄糖异构酶的最佳浓度。这一发现与之前的研究结果一致[16]，作者报告了氮源的最佳浓度链霉菌属。1%蛋白胨可产生葡萄糖异构酶。综上所述，葡萄糖异构酶生产的最佳诱导培养基为芽孢杆菌megaterium含1% d -木糖，0.2% K₂HPO_4., 0.1% MgSO_4.h·7₂O，1％酵母提取物和1％蛋白胨。

３．３．发酵条件对葡萄糖异构酶生产的影响

pH对葡萄糖异构酶生产的影响7．当诱导培养基pH从5.5增加到7.0时，酶活从0.176±0.01增加到0.243±0.01 U/mg生物量(）.然而，较高的pH范围（pH7.5-pH8.0）将抑制酶活性（从0.194±0.001至0.185±0.001 U / mg生物质，REAC。）。获得葡萄糖异构酶的最大活性的最佳pH值（pH7.0）在细菌生长的范围内（pH 5.7-pH7.0）。此外，最佳pH值是中性pH值，这有利于工业规模的葡萄糖异构酶产生，因为pH调节不需要进行。在以前的报告中，Yassien和Jiman-Fayani建议pH 7.0对微生物生长和葡萄糖异构酶产生的最佳选择Streptomyces Albaduncus.，这与我们的结果一致[17]．相反，一些作者测定了最佳pH芽孢杆菌megateriumbptk5是6.0 [7]．最佳pH值的差异芽孢杆菌megaterium该研究与穆克什-库马尔研究之间的差异可能是由不同的孤立来源造成的。请注意,芽孢杆菌megaterium本研究中使用的菌株是从越南的虾养殖池中分离出来的，而芽孢杆菌megateriumBPTK5菌株从木薯废料中分离得到。

我们还研究了细菌接种量对葡萄糖异构酶生产的影响(图)8）.我们观察到，当细菌接种量从5%增加到20%(分别为0.141±0.004和0.260±0.004 U/mg生物量)时，酶活性增加。）.然而，与中等接种物尺寸（20％）相比，较高的接种尺寸（25-30％）导致酶活性降低。因此，我们选择最佳的细菌接种尺寸为20％。当细菌接种物量过低时，细菌缓慢生长，酶活性低。接种尺寸的增加将增加底物，营养素和细菌之间的相互作用，这反过来增强细菌代谢，蛋白质合成和酶活性。然而，大量接种尺寸导致营养和衬底竞争以及酶活性的降低。

温度是影响细菌生长和酶生物合成的重要因素。每一种细菌都能适应一个最佳的温度范围，在这个温度范围内迅速生长并合成蛋白质。如果细菌在较高的温度下培养，它们会被削弱，减少酶的产生。如图所示9，随着温度从33°C升高到37°C，酶活性增加(0.160±0.010 vs 0.262±0.004 U/mg生物质，）.当温度高于最适温度(39°C - 43°C)时，酶活性从0.238±0.001显著降低至0.206±0.020 U/mg生物量(）.根据这些数据，我们选择37℃作为葡萄糖异构酶生产的最佳温度。

旋转速率影响溶解氧浓度和营养物在介质中的扩散。因此，充分的旋转速率将促进细菌生长和酶的生物合成。然而，过高的溶解氧浓度可能会在原核生物中引起高压氧化应激，进而抑制微生物的生长和代谢，如支链氨基酸的生物合成[18]．如图所示10当转速从80转至120转时，酶活显著增加(分别为0.209±0.004和0.248±0.001 U/mg生物质)，转速越快(140 ~ 180 rpm)，酶活性从0.239±0.010降低到0.205±0.001。U / mg生物质(）.120转/分和140转/分之间酶活性没有差异。因此，为了节约能源，我们选择120 rpm的转速作为葡萄糖异构酶生产的最佳转速。综上所述，葡萄糖异构酶的最佳发酵条件为pH 7.0，细菌接种量20%，培养温度37℃，转速120 rpm。

3．4．使用Plackett-Burman设计筛选显著变量

筛选葡萄糖异构酶生产的重要变量芽孢杆菌megaterium， 9个变量的影响程度，包括介质成分(d -木糖，K₂HPO_4., MgSO_4.h·7₂o，使用Plackett-Burman设计研究了12次运行和9个两级因子（-1的低级和+，研究了o，酵母提取物和蛋白胨）和发酵条件（pH，细菌接种物尺寸，温度和旋转速率）进行了研究1为高水平）。在Plackett-Burman设计中，变量编码如下：D-木糖浓度（X₁), K₂HPO_4.专注 （X₂), MgSO_4.h·7₂o集中（X_3.)、酵母提取物浓度(X_4.)、蛋白胨浓度(X_5.)、初始pH值(X₆)、细菌接种量大小(X₇)、培养温度(X₈)、旋转速率(X₉）.Plackett-Burman实验设计中各变量的实际酶活性见表1．最显著的变量是由它们的实际酶活性和相应的酶活性决定的值和变量低于0.05的值被认为对葡萄糖异构酶生产有显著的统计学影响。如表所示2，包括d -木糖浓度(X₁)、酵母提取物浓度(X_4.)及栽培温度(X₈）对葡萄糖异构酶产生显着影响芽孢杆菌megaterium．因此，我们选取了d -木糖浓度、酵母膏浓度、培养温度等变量进行进一步优化实验。

3．5．响应面法优化葡萄糖异构酶生产

显著变量包括d -木糖浓度(X₁)、酵母提取物浓度(X_4.)及栽培温度(X₈）使用二阶多项式模型的响应表面方法和总数17个试验（表格）在三种编码水平（-1,0和+1）中评估。3.）.一般多项式模型方程为:Y = 一个_0.+一个₁X₁+一个₂X_4.+一个_3.X₈+一个₁₂X₁X_4.+一个₂₃X_4.X₈+一个₁₃X₁X₈+一个₁₁X₁²+一个₂₂X_4.²+一个_33.X₈²，其中Y是预测的酶活性，X₁是D-xylose浓度,X_4.是酵母提取物浓缩，和X₈是培养温度。酶活性(Y)由重复试验确定，表中为重复的平均值4.．各因素对酶活性的影响及多因素间的相互作用见表5.．在全二次模型应用的基础上，发现酵母膏与培养温度的交互作用存在二次效应(X_4.X₈)可以从模型中剔除，因为交互系数与0 (）.因此，多项式模型重写为:Y = 0.277 + 0.006X₁+ 0.012X_4.−0.004X₈+ 0.004X₁X_4.+ 0.004X₁X₈ − 0.016X₁² − 0.010X_4.²−0.007X₈²．根据这个方程，我们提出葡萄糖异构酶活性(Y深受……的影响X₁²那X_4.那X_4.²（D-木糖，酵母提取物和酵母提取物二次效果的二次效果），而其他变量对葡萄糖异构酶活性的影响较低。在变量中，D-木糖浓度（X₁)、酵母提取物浓度(X_4.)、d -木糖浓度与酵母提取物浓度相互作用(X₁·X_4.)， d -木糖浓度与培养温度互作(X₁·X₈)对葡萄糖异构酶活性有正向影响，而其他变量和交互作用对葡萄糖异构酶活性有负向影响。

补充d -木糖来生产葡萄糖异构酶已经在几种微生物中进行了研究。Yassien和Jiman-Fatani认为，在培养基中添加1%的木糖能产生最大的葡萄糖异构酶Streptomyces Albaduncus.与葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、果糖、蔗糖、肌醇、半乳糖和阿拉伯糖等多种替代碳源相比[17]．此外,链霉菌属thermonitrificans可以通过含有1％木糖和2％山梨糖醇的培养基中培养产生最高葡萄糖异构酶活性[14]．注意，木糖对葡萄糖异构酶生产的改善与细菌生长无关。一些作者报道木糖或木糖和葡萄糖的组合降低了生物量产量和增加了酶活性[19那20.]．

酵母提取物对葡萄糖异构酶生产的重要性已经在一些研究中得到了很好的描述。根据Givry和Duchiron的研究，高量的d -木糖异构酶由乳酸菌bifermentans仅在有机氮源存在下获得，例如酵母提取物，蛋白胨和肉类提取物，而在柠檬酸铵和磷酸铵的内部存在无机氮源对D-木糖异构酶生产没有显着影响[15]．在之前的研究中，Nwokoro也认为酵母提取物是最佳的氮源B. licheniformis.在包括有机和无机源的各种氮源中产生葡萄糖异构酶[21]．此外，Prabhakar和Raju证明，补充酵母提取物降低了细菌的干重，但它增加了葡萄糖异构酶活性。这一发现暗示酵母提取物没有增强关节杆菌但它提高了培养基成分的有效利用，以产生葡萄糖异构酶[9]．因此，酵母提取物对葡萄糖异构酶产生的显着影响并不令人惊讶B. Megakerium.．

每种细菌具有特异性的最佳温度范围，其中它生长和合成蛋白质和二次代谢化合物。在几个报告中记录了葡萄糖异构酶的最佳温度，并在宽范围内提出25-50℃。在以前的研究中，Pandidurai等。表明葡萄糖异构酶生产的最佳培养温度肠杆菌聚集体是37℃，具有高葡萄糖异构酶活性（41U / mL），而较高的温度导致酶活性降低[22]．另一方面，青霉菌fellutanum葡萄糖异构酶在30℃时产量最高[13]．Habeeb等人还提出了最适温度链霉菌属SPP。产生葡萄糖异构酶的SH10为25℃[23]．注意Nwokoro的报道地衣芽孢杆菌在较高的温度(50°C)下产生最大数量的葡萄糖异构酶[21]．我们的结果表明，培养温度对葡萄糖异构酶生产的影响，并建立了葡萄糖异构酶生产中培养温度和D-木糖之间的相互作用。还确定了培养温度的最佳值。

3.6。模型验证

为了再次确认回归方程，我们对拟合葡萄糖异构酶生产方程的响应面方法学参数进行了方差分析(表)6）.我们发现R²值(判定系数)大于0.8，接近1.0 (R²= 0.971)问²值高于0.5（问²= 0.794)。此外,│R² − 问²│值应小于0.2 ~ 0.3值低于0.05（）.这些数据满足了对良好统计模型的所有要求，可以准确地预测从实验获得的数据[24]．因此，这些数据证明，该模型是良好的统计模型和与模型密切合作的实验数据。

优化葡萄糖异构酶生产的表面响应模型表明，葡萄糖异构酶的生产依赖于d -木糖(X₁)、酵母提取物(X_4.)及栽培温度(X₈）.图中的响应面和等高线图11结果表明，在36 ~ 37℃的培养温度下，d -木糖(1.0-1.2%)和酵母提取物(1.1-1.2%)的存在可获得葡萄糖异构酶活性的最优值(超过0.2774 U/mg生物质)。

Modde 5.0软件进行优化实验，以确定最佳点X₁那X_4.,X₈．之后，我们进行了培养B. Megakerium.利用从ModDE 5.0软件获得的最佳条件（D-木糖浓度= 1.116％，酵母提取物浓度= 1.161％，培养温度= 36.528℃）。从一式三份实验中获得的葡萄糖异构酶活性（0.274±0.003u / mg生物量）接近从回归方程获得的预测葡萄糖异构酶活性（0.278u / mg生物量）。实验和预测最佳值的酶活性值之间的差异为1.439％（差异<5％）。总之，这些数据表明，统计模型对于优化D-木糖，酵母提取物和培养温度有效和可接受。

我们还确定了葡萄糖异构酶生产的最佳条件B. Megakerium.含有D-木糖（1.116％），K的培养基₂HPO_4.(0.2%)、MgSO_4.h·7₂O(0.1%)，酵母提取物(1.161%)，蛋白胨(1%)和特定的发酵条件，包括初始pH 7，接种量(20% w/v)，培养温度(36.528°C)，培养时间(48小时)。根据统计模型建立了葡萄糖异构酶的有效生产，可用于中试或工业规模生产。值得注意的是，Mukesh-Kumar等人报道最大的葡萄糖异构酶活性可以通过B. Megakerium.d -木糖和蛋白胨在35°C, pH 6.0条件下培养48小时[7]．孤立源的差异B. Megakerium.可以阐明我们的实验与前一项研究之间的优化条件的差异。此外，培养基组分和发酵条件对其他葡萄糖异构酶的影响芽孢杆菌菌株也有很好的记录。Calik等人提出了生产葡萄糖异构酶的最佳条件芽孢杆菌thermoantarcticus桦木木聚糖(1.06%)、酵母提取物(0.56%)_4.）₂所以_4.（0.59％），pH6.0，55°C。此外，Lawal等人。据报道，最佳的pH和培养温度产生葡萄糖异构酶芽孢杆菌megaterium和芽孢杆菌coagulanspH 5.0-9.0和30-70°C。注意，我们的优化条件与前研究中报道的最佳pH和培养温度一致。

4.结论

单因素及不同因素相互作用对葡萄糖异构酶生产的影响B. Megakerium.使用Plackett-Burman设计和响应表面方法确定。D-木糖，酵母提取物和温度对酶活性产生强烈影响。注意，D-木糖浓度，酵母提取物浓度和D-木糖和酵母提取物相互作用可以显着改善葡萄糖异构酶活性。我们成功地为葡萄糖异构酶生产建立了最佳条件B. Megakerium.如下：D-木糖（1.116％），K₂HPO_4.(0.2%)、MgSO_4.h·7₂O(0.1%)，酵母膏(1.161%)，蛋白胨(1%)，pH 7.0，细菌接种量(20% w/v)，培养温度(36.528℃)，培养48 h，相应酶活为0.274±0.003 U/mg生物量。这些最佳条件被认为是有用的葡萄糖异构酶生产B. Megakerium.在大型成本效益高的大尺度中。

数据可用性

支持本文结果的数据集包含在本文及其补充材料中。

的利益冲突

作者宣布关于本文的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

Gia-Buu Tran和Hoang-Yen Thi Nguyen构思，设计了这项研究，并起草了手稿。Gia-Buu Tran和Hoang-Yen Thi Nguyen进行了实验。Hoang-Yen Thi Nguyen处理研究数据并进行了对数据的统计分析。Gia-Buu Tran解释了结果，修订了稿件，并解决了审稿人的所有疑问。所有作者阅读并认可的终稿。

致谢

作者谨感谢Ngoc-Anguyen博士在这项研究过程中分享他的智慧，并校对稿件。作者还感谢他们在该项目中的工业大学生物技术和食品技术研究所的同事，在此项目中得到帮助。

补充材料

原始数据显示了细菌的生长和单因素的影响，包括d -木糖浓度，K₂HPO_4，MgSO_4.h·7₂O，酵母提取物，蛋白胨，以及pH值，细菌接种大小，温度，旋转速率对葡萄糖异构酶活性的补充文件的excel表(图S1-S10)。（补充材料）

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