在重编程和转分化过程中整合基因校正:一步策略克服基于干细胞的基因治疗的局限性

摘要

最近诱导多能干细胞(iPSCs)和基因治疗工具的出现，提高了罕见遗传疾病的自体细胞治疗的可能性。然而，由于疾病相关基因的干扰，细胞重编程在某些疾病如毛细血管扩张共济失调、范可尼贫血、LIG4综合征和纤维发育不良骨化进行性综合征中效率低下。为了克服这些治疗的局限性，有必要在重编程过程中或之前从根本上纠正异常基因。此外，作为帕金森氏病的遗传病因学，众所周知，诱导神经干细胞(iNSCs)通过LRRK2基因突变，LRRK2 (G2019S)进行性耗尽。因此，为了维持由含有LRRK2 (G2019S)的PD患者细胞直接衍生的诱导NSCs，在TD过程中同时处理LRRK2 (G2019S)成纤维细胞将是理想的。因此，同时重编程(TD)和基因治疗将解决由于易受重编程或TD的影响而导致的治疗局限性，并适合于基因缺陷患者自体细胞治疗产品的一般应用。从而避免了目前所需要的艰苦的过程。

1.介绍

自2006年的发现以来，诱导多能干细胞（IPSC）被认为是细胞替代疗法以及研究人类疾病的高度有用资源。因此，预计IPSC将适用于治疗广泛的疾病，包括神经系统疾病，血液学异常，脊髓损伤，心脏病，糖尿病和关节炎[1，2]．一些研究小组已经报道了从肌萎缩性侧索硬化症、家族性自主神经异常、脊髓性肌肉萎缩、腺苷脱氨酶缺乏相关的严重联合免疫缺陷、先天性角化障碍、什瓦赫曼-博迪安-戴蒙德综合征、豹综合征、戈谢氏病III型、杜氏肌营养不良症、贝克尔肌营养不良症、蒂莫西综合征、帕金森病(PD)、亨廷顿病、Hutchinson-Gilford早衰症、少年发病1型糖尿病、唐氏综合征、Rett氏综合征和Lesch-Nyhan综合征[3.- - - - - -11.]．幸运的是，这些与疾病相关的iPSCs的产生没有受到基因突变的负面影响。尽管疾病相关基因可能对重编程过程产生潜在的不利影响，导致重编程效率低下和抑制维持能力下降，但除非基因突变非常严重，导致非常早期的胚胎致死率，否则这并不被认为是一个关键问题。然而，即使是在胚胎发育阶段没有严重致命性的遗传性遗传疾病，某些疾病相关基因也会严重阻碍重编程过程或损害iPSCs的维持，这在毛细血管扩张共济失调(A-T)病例中已经观察到[12.，范可尼贫血症[13.，14.， LIG4综合症[15.和进行性骨化性纤维发育不良综合征[16.，17.]．因此，重要的是要产生基因校正的ips，以避免可能的重编程损伤的缺陷基因的干扰。为了实现这一目标，必须在进入受损iPSCs阶段之前，从体细胞阶段对iPSCs进行基因治疗。

细胞替代疗法的另一种策略是转分化(TD)，也被称为直接重编程，这是一个过程，谱系特异性细胞类型直接来自体细胞类型，从而绕过多能性阶段。TD具有快速生成特定类型细胞以及避免由iPSCs固有特性引起的畸胎瘤形成等优点。然而，td介导的谱系特异性细胞也可能受到疾病相关基因的损害。这种效应的一个主要例子是富含亮氨酸重复激酶2 (LRRK2)的G2019S突变体，该突变体导致诱导神经干细胞(insc)的核破坏，已在PD患者的脑切片中检测到[18.]．尽管可以通过LRRK G2019S突变从IPSC成功地生成NSC，但由于LRRK2（G2019S）和Lamin B1蛋白质之间的异常相互作用，它们在若干通道中完全耗尽，这是锚固到内核膜的异常相互作用，并且参与破坏框架核信封[18.]．因此，该相互作用对通过TD工艺直接从PD患者细胞直接衍生的NSC的形成负面影响。因此，随着并发重编程和基因校正方法，LRRK2(G2019S)基因将在TD过程中使用基因校正工具进行基本治疗，而不是在细胞仍含有突变基因的NSC阶段。

在这篇综述中，我们强调了当前基于ipsc的治疗方法面临的挑战，并介绍了一步基因校正和重编程方法作为克服基于ipsc的基因治疗局限性的解决方案。我们还建议采用一种理想的基因治疗方法，将基因校正过程与TD过程相结合，以致病性LRRK2突变体(G2019S)为例，该突变体在帕金森病中逐渐耗尽神经干细胞。

2.影响重编程的遗传缺陷

2.1。影响重编程过程的DNA修复缺陷

重编程过程的主要挑战之一是基因组不稳定性或凋亡诱导造成的干扰[20.，21.]．在此过程中，p53蛋白作为基因组完整性的关键监测因子，在异位过表达重编程因子时积累[22.];因此，p53严格调控体细胞的重编程，并能全面阻碍这一过程。因此，暂时降低p53活性可以成功地将重编程效率提高不低于原始值的100倍[23.- - - - - -26.，因为缺乏对细胞凋亡和DNA损伤的关注[27.]．作为DNA损伤反应中激活p53的激酶之一，共济失调-毛细血管扩张症发生突变(atm)基因在调节基因组稳定性方面也起着关键作用。染色体不稳定的原因atm突变导致A-T的发育，一种稀有的遗传性疾病，其特征在于运动神经变性，白血病和过早衰老[28.]．与A-T相关的广泛表型对重编程效率有额外的影响。因此，在A-T纯合子细胞中，由A-T成纤维细胞生成的诱导多能干细胞的效率极低，与正常细胞相比，大约只有4% [12.，29.]．

FA综合征是另一种罕见的遗传性疾病，以染色体不稳定综合征为特征，如再生障碍性贫血、白血病和乳腺癌或卵巢癌[30.]．因此，与FA相关的基因也参与DNA修复，特别是DNA链间交联修复，因此这些基因的突变有可能削弱重编程过程。为了建立一种FA- ipsc模型，一些研究小组已经尝试从含有FA的患者体内生成ipscFANCA或FANCD2，或来自FA鼠标模型FANCA，FANCC， 或者FANCD1 / BRCA2(乳腺癌及卵巢癌易感蛋白2)[13.，31.，32.]．尽管fa相关基因不会诱导早期发育致死率，但在这些基因与患者来源的成纤维细胞互补之前，诱导多能干细胞无法成功生成[14.]．此外，当小鼠ips细胞由FA小鼠成纤维细胞生成时，重编程效率也被发现降低或受损[13.，20.，32.]．BRCA1结合多种FA蛋白，包括BRCA2 [33.，34.]．这些蛋白质形成的复合物导致BRCA1表现出与BRCA2相似的表型，表明BRCA1缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的重编程也以与BRCA2缺陷的MEFs相似的方式受损[20.]．同时，作为BRCAs的相互作用蛋白之一，RAD51通过同源重组在DNA修复过程中发挥关键作用。类似于功能损失引起的重编程效率低BRCA基因的沉默RAD51基因表达也严重降低了重编程效率[20.]．

除了涉及ATM-、FA-、BRCA-或rad51依赖的同源重组(HR)的DNA修复系统外，非同源端连接(NHEJ)也是一种重要的DNA修复系统，涉及DNA链断裂区域末端的直接连接。在这一途径中，DNA连接酶IV(由LIG4基因）参与在NHEJ和V（D）J重组的最终步骤期间修复双链断裂[35，36.]．突变LIG4LIG4综合征以白血病、免疫缺陷和发育迟缓为特征。此外，虽然这种畸形突变的后果LIG4基因的破坏较小鼠胚胎造成的致命性要轻LIG4基因，细胞的重编程效率来自携带LIG4基因突变显着低于正常对照细胞的突变[15.]．

上述例子表明，若干染色体不稳定性相关综合征与重编程的局限性有关，这表明重编程效率与基因组不稳定性之间存在很强的联系(见表)1）.

2．2．构成激活骨形态发生蛋白(BMP)信号通路影响重编程

BMP作为转化生长因子- β的成员，与BMP II型受体结合，BMP结合II型受体激酶磷酸化BMP I型受体激活Smad蛋白，包括Smad 1/5/8，在骨形成中起主要作用[37.]．除了在细胞分化中的作用，bmp还调节组蛋白H3赖氨酸9甲基化，在功能上阻碍体细胞重编程[38.]．因此，BMP信号通路的激活阻止了ipscs前期中期之后的重编程[38.]．事实上，来自FOP综合征患者的成纤维细胞含有内在异常的BMP I型受体，也表现出非典型重编程以及不完全重编程后自我更新受到抑制[16.，17.]．FOP直接由激活素A受体1型(ACVR1.)基因，导致异常激活素受体样激酶2 (ALK2)蛋白的合成，导致BMP I型受体的构成性活性和异常异位骨化[37.]．已证明，ALK2仅在重编程过程的早期阶段有助于iPSCs的生成，而构成性ALK2激活阻碍了早期阶段后iPSCs的生成[16.]．突变的ALK2-iPSCs (mALK2-iPSCs)除了重编程效率低外，表型表现出弱碱性磷酸酶活性，表明重编程不完全，并有向成骨细胞分化和矿化的倾向，具有代表性的成骨标记基因高表达[17.]．因此，mALK2-iPSCs不能有效地稳定或维持，除非异常的ALK2蛋白被遗传处理或使用ALK2抑制剂功能减弱。

3.基于IPSC的基因治疗的基因校正工具和限制

仍有许多疾病在重编程效率方面没有得到证实。其中部分患者由于基因缺陷影响基因重编程效率低下，将面临基于ipsc的基因治疗的局限性。然而，正如前面几节的例子所强调的那样，为了克服这些限制，有必要在诱导多能干细胞产生之前或在重编程过程阶段从患者来源的体细胞中完全去除因果基因。病毒vector-mediated足总基因治疗是克服ips基因治疗局限性的第一个例子。由于多种FA相关疾病患者的细胞重编程能力较差，因此采用重组病毒载体介导的基因治疗策略，使无功能的FA蛋白得以功能恢复。在重编程之前传递外源性FA基因至关重要，因为无功能的FA基因会损害患者来源的成纤维细胞的重编程[13.，14.]．然而，要克服病毒载体传递的正常基因表达沉默的可能性，以及简化程序以避免繁琐的步骤所涉及的要求，如对病毒基因组整合细胞进行分类，然后根据已排序的细胞进行重新编程。虽然一个功能性FA基因的缺失可以简单地由一个正常的外源性FA基因来补充，但病毒载体介导的基因治疗通常不能用于功能性基因的获得，例如ACVR1.C.617G> A，其构成思考Smads信号通路作为主导效果。也就是说，为了克服基于IPSC的基因治疗的局限性作为这种突变的显性效果，必须应用基本处理以用野生型替换突变的基础，根本不能被正常基因互补。

这可以通过结合多种精确的基因组编辑工具如强大的分子剪刀，包括锌指核酸酶（ZFN）来实现这一点。39.- - - - - -41.，转录激活因子样效应核酸酶(TALENs) [42.，43.， rna引导的内切酶从微生物群集有规律间隔短回文重复- cas9 (CRISPR-Cas9)核酸酶系统[44.- - - - - -46.，或基于细菌人工染色体(BAC-)的HR [19.]，使目标基因能根据需要在基因组中有效地插入、删除或替换[17.]．到目前为止，对ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统的优缺点进行了全面评估[47.]．然而，尽管为基因校正显示了高靶向效率，但基于BAC的HR系统并不流行。基于BAC的HR模式是通过直接重组其自身巨大的同源臂，长度为约70-80kb，在靶向基因座中[19.，48.，49.];因此，这种方法不需要额外的供体DNA(图)1(一)）.相比之下，由于可编程核酸酶模式，包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，仅诱导靶序列上的DNA双链断裂，因此需要额外的供体模板来有效地通过同源性定向修复介导基因校正(图)1 (b)）.

为了有效地将基因编辑工具应用于诱导多能干细胞，细胞必须能够抵抗包括胰蛋白酶化或转染在内的过程中所需要的压力条件。总的来说，ROCK抑制剂Y-27632已经被证明可以增强胰蛋白酶解离的单个细胞的生存能力，帮助维持细胞的自我更新能力[50]．然而，Y-27632处理不能阻止mALK2-iPSCs在胰蛋白酶化和转染的情况下自发分化，尽管提高了细胞的活力[17.]．因此，我们将在下一节提出基于ips的治疗方法所面临的挑战。

4.克服基于干细胞基因疗法的局限性的策略

4．1.重组和基因校正的结合

目前使用的基于ipsc的基因治疗方法，一般是在供体来源的体细胞重编程后，在ipsc中应用基因校正工具(图)2(一个)；一步一个步骤一种）。然而，这种方法依赖于假设涉及该疾病的异常基因对IPSC的产生或维护没有影响（图2(一个)；一步a).也就是说，如果不能有效地产生或维持来自上述疾病之一患者的细胞的诱导多能干细胞(图2(一个),一步b)，目前的基因治疗方法无法有效应用于致病性iPSCs。因此，为了克服传统基因治疗的这一盲点，将首先在患者来源的体细胞中，在iPSC阶段之前，将异常基因替换为正常基因。这可以通过在患者来源的体细胞中同时引入基因校正工具和重编程因子来实现(图)2 (b)）[17.]．我们将这种方法应用于Malk2皮肤成纤维细胞，其表现出非典型的重编程和抑制IPSC的维持[16.，17.]．重编程因子的表达结合基因校正工具，包括重编程episomal载体、CRISPR/ cas9编码载体靶向ACVR1.基因，以及携带正常碱基的供体DNA，使正常的ALK2-iPSCs产生，而无需担心基因突变引起的非典型重编程或维持抑制[17.]．除了对脆弱的iPSCs应用这种方法外，通过同时重编程和基因编辑一步生成基因校正的iPSCs还具有节省时间、精力和成本的额外优势[17.，51，这样就不需要进行繁琐的重编程过程，然后再像传统的基因校正方法那样分别进行基因编辑。因此，本文所述的一步法具有很高的实用性，广泛适用于细胞替代治疗。

4．2．LRRK2 (G2019S)体细胞的偶联TD和基因校正

由基因突变引起的家族性帕金森病通常很少见，但早发或晚发帕金森病最常见的原因之一是LRRK2 (G2019S)的常染色体显性突变，占所有家族性帕金森病病例的5-6%或散发性帕金森病病例的1-2% [52，53]．一些研究小组已经证明了利用zfn介导的同源直接修复(HDR)在遗传上纠正LRRK2 (G2019S)突变iPSCs的能力[54，55]．zfn介导的HDR方法也可以使用LRRK2 (G2019S)体细胞，结合重编程和基因校正过程(图)3(一个),一步b).尽管该突变对重编程过程或iPSC的维持没有影响，但它可以帮助以比两步生成方法更快的速度生成治疗性iPSC，包括重编程和随后的基因校正(图)3(一个),一步一个步骤）.该方法的另一个吸引人的特性是，这些基因编辑工具也可以应用于携带LRRK2 (G2019S)的insc，因为TD的主要优势之一是缺乏形成畸胎瘤的风险，这是使用ipsc来源的细胞的相关担忧[56，并能迅速产生谱系特异性的细胞类型。然而，LRRK2 (G2019S)突变也可导致iNSCs进行性退化，其中来自mLRRK2-iPSCs的iNSCs在经过几代传代后出现耗竭[18.]．这些结果强烈表明，mLRRK2对由mLRRK2-体细胞衍生的iNSCs的维持有负面影响。因此，为了从稳定维持LRRK2 (G2019S)突变的PD成纤维细胞中直接生成insc，在TD过程中对mLRRK2成纤维细胞进行基因治疗是理想的，这可以通过TD和基因校正的耦合方法实现(图)3 (b),一步b).与mlrrk2 - insc相比，基因校正的insc可以稳定地自我更新，并向多巴胺能神经元(DNs)分化。基因校正干细胞应用于细胞替代治疗的主要关键因素是其持续生长能力、分化潜能的维持能力和自我更新能力。最近有几个小组介绍了将人成纤维细胞直接转化为DNs的方法[57，58]．因此，通过偶联基因校正和直接转化为DNs，从PD成纤维细胞直接诱导基因校正DNs在概念上是可能的。然而，诱导的DNs具有持续生长的普遍局限性，阻碍了筛选阳性克隆和获得足够数量的治疗材料的能力。因此，随着基因重编程和基因校正方法的并行应用，基因校正和td介导的iNSC联合应用似乎是一种合适的方法来生成治疗PD细胞的治疗材料。

5。结论

到目前为止，已经产生了多种类型的患者源性诱导多能干细胞，其中大多数已被作为基因治疗的资源提供。然而，目前基于ipscs的基因治疗方法对一些疾病的治疗仍然是一个挑战。

其中一些疾病是由染色体不稳定或DNA修复受损引起的。尽管产生少量疾病来源的iPSCs仍有希望，但非整倍体发生率高的病例可能会因OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC等重编程因子而进一步恶化。事实上，atm缺陷的iPSCs在几次传代后获得了严重的染色体异常[29.]．虽然c-MYC是一种代表性的癌蛋白，它可以提高重编程效率，但它也可能大大增加带有缺陷DNA修复基因的重编程细胞发生异常的可能性。然而，由于DNA修复所涉及的蛋白质通常使用本文提出的一步系统来修复，因此重编程效率可以提高，从而降低非整倍体的发生率。

由于最近采用了一步法，迄今只报告了4例应用该方法的病例[17.，51，59]．在所有病例中，细胞都经过CRISPR/ cas9介导的HDR基因处理，靶向效率为5-17% [17.，51，59]．这种靶向效率与基于ipsc的方法获得的效率相当，后者已尝试使用各种可用的基因治疗工具，如质粒、BAC、腺相关病毒、辅助腺病毒和ZFN [60]．

LRRK2 (G2019S)与固定在核膜内的层蛋白B1蛋白相互作用，参与破坏核膜框架，导致层蛋白B1蛋白功能丧失，最终增加染色质不稳定性，最终耗尽iNSC池。因此，使用td介导的insc结合基因校正可能维持insc的染色质稳定性，从而为PD患者的细胞置换提供一种稳定的治疗方法。

除了对上述罕见疾病的基因治疗外，先进的一步法一般适用于所有的疾病源细胞，无论所涉及的基因有缺陷，大大节省了时间，减少了劳动密集型实验的需要，并将目前基于ipsc的基因治疗方法所需的成本削减一半。因此，本文所描述的一步法有望在不久的将来成为更快速和个性化的细胞替代疗法的发展中越来越受欢迎。

相互竞争的利益

作者宣布没有关于本文的出版物的竞争利益。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金2013M3A9B4076487和2014M3A9D7034335以及韩国韩医学研究所K16091和K16130的部分资助。

参考文献

1. S. Yamanaka，《诱导多能干细胞:过去、现在和未来》细胞干细胞，第10卷，第5期。6, pp. 678-684, 2012。视图:出版商网站|谷歌学者
2. G. Lee和L. Studer，“诱导多能干细胞技术用于研究人类疾病”自然方法，第7卷，第5期1，页25-27,2010。视图:出版商网站|谷歌学者
3. I.-H。Park, N. Arora, H. Huo等，“疾病特异性诱导多能干细胞”，细胞第134期5，第877-886页，2008。视图:出版商网站|谷歌学者
4. J. T. Dimos, K. T. Rodolfa, K. K. Niakan等人，“肌萎缩性侧索硬化症患者产生的诱导多能干细胞可以分化为运动神经元。”科学第321卷2008年。视图:出版商网站|谷歌学者
5. G. Lee, E. P. Papapetrou, H. Kim等人，“使用患者特异性iPSCs建模家族性自主神经异常的发病机制和治疗，”自然，第461卷，第2期。7262, pp. 402-406, 2009。视图:出版商网站|谷歌学者
6. X. Carvajal-Vergara, A. Sevilla, S. L. Dsouza等人，“患者特异性诱导多能干细胞衍生的LEOPARD综合征模型”，自然，卷。465，没有。7299，pp。808-812,2010。视图:出版商网站|谷歌学者
7. J. Zhang, Q. Lian, G. Zhu等，“一种hutchinson gilford早衰症的人类iPSC模型显示血管平滑肌和间充质干细胞缺陷，”细胞干细胞，第8卷，第2期1，第31-45页，2011。视图:出版商网站|谷歌学者
8. M. C. N. Marchetto, C. Carromeu, A. Acab等人，“利用人类诱导多能干细胞治疗rett综合征的神经发育模型”，细胞，第143卷，第2期。4, pp. 527-539, 2010。视图:出版商网站|谷歌学者
9. a . D. Ebert, J. Yu, F. F. Rose Jr.等，“从脊髓性肌肉萎缩患者中诱导多能干细胞”，自然，第457卷，第2期。7227页，277 - 280,2009。视图:出版商网站|谷歌学者
10. 美国阿加瓦尔,中州。来自先天性角化障碍患者的诱导多能干细胞的端粒伸长自然，第464卷，第2期。(2) 2010年。视图:出版商网站|谷歌学者
11. M. Yazawa, B. Hsueh, X. Jia等，“使用诱导多能干细胞研究Timothy综合征的心脏表型，”自然号，第471卷。7337, pp. 230-236, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
12. S. Nayler, M. Gatei, S. Kozlov等人，“来自共济失调-毛细血管扩张症的诱导多能干细胞概述了细胞表型”，干细胞转化医学， vol. 1, no. 17，第523-535页，2012。视图:出版商网站|谷歌学者
13. L. U. W. Müller, M. D. Milsom, C. E. Harris等人，“克服范可尼贫血细胞的重编程抗性”，血，卷。119，没有。23，pp。5449-5457,2012。视图:出版商网站|谷歌学者
14. 一个。Raya, I. Rodríguez-Piz, G. Guenechea等人，“范可尼贫血诱导的多能干细胞的疾病矫正造血祖细胞，”自然第460期7251, pp. 53-59, 2009。视图:出版商网站|谷歌学者
15. K. Tilgner, I. Neganova, I. Moreno-Gimeno等人，“连接酶IV缺乏的人类iPSC模型揭示了nhej介导的dsb修复在诱导多能干细胞和新生造血祖细胞的生存和基因组稳定性中的重要作用。”细胞死亡和分化，第20卷，第2期。8, pp. 1089-1100, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
16. M. Hamasaki, Y. Hashizume, Y. Yamada等，“ALK2致病突变抑制诱导多能干细胞重编程和维持:重编程机制和药物鉴定策略，”干细胞，第30卷，第2期11，pp。2437-2449,2012。视图:出版商网站|谷歌学者
17. B. Y.Kim，S. Jeong，S. Y. Lee等，“同时进行重编程和基因校正的进展，以克服突变体Alk2-IPSC的治疗局限性，”实验与分子医学， 2016年第48卷第237条。视图:出版商网站|谷歌学者
18. G.-H。Liu, J. Qu, K. Suzuki等，“致病性LRRK2引起的人类神经干细胞进行性变性，”自然，第491卷，第2期。2012年。视图:出版商网站|谷歌学者
19. h .歌曲,研究。Chung，和Y. Xu，“利用高效的基于bac的同源重组系统在人类ESCs中建模疾病”，细胞干细胞，卷。6，不。1，pp。80-89,2010。视图:出版商网站|谷歌学者
20. F.González，D.Georgieva，F.Vanoli等人，“同源重组DNA修复基因在重新编程到多能状态时发挥着关键作用”细胞的报道，第3卷，第2期。3，第651-660页，2013。视图:出版商网站|谷歌学者
21. B. B. Lake, J. Fink, L. klemetsaue等，“通过沉默Puma诱导多能干细胞重编程的背景依赖性增强，”干细胞，第30卷，第2期5, pp. 888-897, 2012。视图:出版商网站|谷歌学者
22. Li Y.， Feng H. Gu et al.，“p53-PUMA轴抑制iPSC的产生，”自然通讯， 2013年第4卷，第2174条。视图:出版商网站|谷歌学者
23. r.m. Marión, K. Strati, H. Li等人，“p53介导的DNA损伤反应限制了重编程，以确保iPS细胞基因组的完整性，”自然第460期7259页，1149-1153,2009。视图:出版商网站|谷歌学者
24. H. Hong, K. Takahashi, T. Ichisaka等，“通过p53-p21途径抑制诱导多能干细胞生成”，自然第460期7259页，1132-1135,2009。视图:出版商网站|谷歌学者
25. H. Li, M. Collado, a . Villasante等人，“Ink4/Arf位点是iPS细胞重编程的屏障”自然第460期7259，pp。1136-1139，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
26. A. Banito, S. T. Rashid, J. C. Acosta等，“衰老损害了成功的多能干细胞重编程，”基因和发展，第23卷，第2期。18, pp. 2134 - 2139,2009。视图:出版商网站|谷歌学者
27. M. A. Rasmussen, B. Holst, Z. Tümer等，“瞬时p53抑制增加人类成纤维细胞的重编程，而不影响凋亡和DNA损伤，”干细胞报告，第3卷，第2期。3, pp. 404-413, 2014。视图:出版商网站|谷歌学者
28. G.罗特曼和Y.夏伊洛，《ATM:从基因到功能》人类分子遗传学，第7卷，第5期10，pp。1555-1563，1998。视图:出版商网站|谷歌学者
29. T. Kinoshita, G. Nagamatsu, T. Kosaka等人，“共济失调-微血管扩张症突变(ATM)缺陷降低了重编程效率，导致iPS细胞的基因组不稳定性，”生物化学与生物物理研究通讯，第407卷，第5期。2，页321-326,2011。视图:出版商网站|谷歌学者
30. m.d. Tischkowitz和S. V. Hodgson，《范可尼贫血症》，医学遗传学杂志，第40卷，第5期。1，页1 - 10,2003。视图:出版商网站|谷歌学者
31. G.-H。Liu, K. Suzuki, M. Li等，“使用无整合患者来源的诱导多能干细胞模拟范可尼贫血发病机制和治疗，”自然通讯， 2014年第5卷第4330条。视图:出版商网站|谷歌学者
32. S.纳瓦罗，V. Moleiro, F. J. Molina-Estevez等人，“从基因矫正的Brca2形形细胞生成诱导多能干细胞:对细胞重编程和干细胞治疗的影响，”干细胞，第32卷，第2期2, pp. 436-446, 2014。视图:出版商网站|谷歌学者
33. F. Zhang, J. Ma, J. Wu等，“PALB2连接dna损伤反应中的BRCA1和BRCA2，”当代生物学第19卷第2期6，第524-529页，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
34. T. Taniguchi, I. Garcia-Higuera, P. R. Andreassen, R. C. Gregory, M. Grompe, and A. D. D'Andrea，“Fanconi贫血蛋白FANCD2与BRCA1和RAD51的s相特异性相互作用”，血号，第100卷。7，页2414-2420,2002。视图:出版商网站|谷歌学者
35. N. E. Sharpless, D. O. Ferguson, R. C. O'Hagan等人，“受损的非同源末端连接诱发了含有染色体易位、扩增和缺失的软组织肉瘤，”分子细胞，第8卷，第2期6，PP。1187-1196，2001。视图:出版商网站|谷歌学者
36. M. O'Driscoll, K. M. Cerosaletti, pm - mGirard等人，“在表现出发育迟缓和免疫缺陷的患者中发现的DNA连接酶IV突变”，分子细胞，第8卷，第2期6，页1175 - 1185,2001。视图:出版商网站|谷歌学者
37. T. Fukuda, M. Kohda, K. Kanomata等，“组成性激活ALK2和增加SMAD1/5协同诱导进行性骨化纤维发育不良患者的骨形态发生蛋白信号。”生物化学杂志第284期11, pp. 7149-7156, 2009。视图:出版商网站|谷歌学者
38. J. Chen, H. Liu, J. Liu等，“H3K9甲基化是体细胞重编程进入ips细胞的障碍，”自然遗传学第45卷第5期1, pp. 34-42, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
39. Y.-G。Kim, J. Cha, and S. Chandrasegaran， "杂交限制性内切酶:锌指融合到Fok I裂解域"，美国国家科学院的诉讼程序第93卷第5期3，第1156-1160页，1996。视图:出版商网站|谷歌学者
40. M. Bibikova, K. Beumer, J. K. Trautman, D. Carroll，“用设计好的锌指核酸酶增强基因靶向”，科学，第300卷，第2期2003年。视图:出版商网站|谷歌学者
41. S. Ramalingam, V. London, K. Kandavelou等人，“利用设计的锌指核酸酶产生和基因工程人类诱导多能干细胞”，干细胞与发育第22卷第2期4, pp. 595-610, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
42. D. Hockemeyer, H. Wang, S. Kiani等，“使用TALE核酸酶的人类多能细胞基因工程”，自然生物技术，第29卷，第2期8，第731-734页，2011。视图:出版商网站|谷歌学者
43. J. C. Miller, S. Tan, G. Qiao等，“一个用于高效基因组编辑的TALE核酸酶结构”，自然生物技术，第29卷，第2期2, pp. 143-150, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
44. S. W. Cho, S. Kim, J. M. Kim, J. S. s。Kim，“Cas9 rna引导内切酶在人类细胞中的靶向基因组工程，”自然生物技术第31卷第1期3, pp. 230-232, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
45. L.Cong，F.A.Ran，D.Cox等，“使用CRISPR / CAS系统的多重基因组工程”，科学，第339卷，第2期。6121，pp.819-823,2013。视图:出版商网站|谷歌学者
46. P.Mali，L. Yang，K.M. Esvelt等，“通过Cas9的RNA引导人类基因组工程”科学，第339卷，第2期。6121, pp. 823-826, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
47. T. Gaj, C. A. Gersbach，和C. F. Barbas，“ZFN, TALEN和基于CRISPR/ cas的基因组工程方法”，生物技术的发展趋势第31卷第1期7, pp. 397-405, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
48. Z.-N。张,研究。Chung, Z. Xu，和Y. Xu，“Oct4通过sirt1介导的去乙酰化灭活p53来维持人类胚胎干细胞的多能性，”干细胞，第32卷，第2期1, pp. 157-165, 2014。视图:出版商网站|谷歌学者
49. S.-K.涌，朱，Y.徐和X.Fu，“DNA损伤反应中人p53乙酰化的功能分析”蛋白质和细胞，第5卷，第5期。7, pp. 544-551, 2014。视图:出版商网站|谷歌学者
50. K. Watanabe, M. Ueno, D. Kamiya等，“ROCK抑制剂允许分离的人类胚胎干细胞存活，”自然生物技术，第25卷，第2期6，页681-686,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
51. S. E. Howden, J. P. Maufort, B. M. Duffin, A. G. Elefanty, E. G. Stanley, J. A. Thomson，“患者成纤维细胞的同时重编程和基因校正”，干细胞报告，第5卷，第5期。6, pp. 1109-1118, 2015。视图:出版商网站|谷歌学者
52. D. M. Kay, C. P. Zabetian, S. a . Factor等，“帕金森病和LRRK2:美国运动障碍诊所中常见突变的频率”，运动障碍第21卷第2期4，页519-523,2006。视图:出版商网站|谷歌学者
53. D. Berg, K. Schweitzer, P. Leitner等，“家族性和散发性帕金森病中LRRK2基因突变的类型和频率”，大脑，第128卷，第128号12，页3000-3011,2005。视图:谷歌学者
54. F. Soldner, J. Laganiere, A. W. Cheng等，“在两种早期帕金森点突变中完全不同的同基因多能干细胞的产生”，细胞，第146期。2, pp. 318-331, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
55. P. Reinhardt，B.Schmid，L.F.Burbulla等，“人体IPSCS中LRRK2突变的遗传校正将Parkinsonian神经变性与基因表达的ERK依赖性变化联系起来，”细胞干细胞，第12卷，第2期3, pp. 354-367, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
56. W. T. Wong和J. P. Cooke，“使用谱系特异性转录因子强迫表达的人成纤维细胞向内皮细胞的治疗性转分化”，组织工程杂志，第7卷，第1-10页，2016。视图:出版商网站|谷歌学者
57. U. Pfisterer, A. Kirkeby, O. Torper等，“人类成纤维细胞向多巴胺能神经元的直接转化”，美国国家科学院的诉讼程序，卷。108，否。25，pp。10343-10348，2011。视图:出版商网站|谷歌学者
58. Liu X.， F. Li, E. A. Stubblefield et al.，“人类成纤维细胞向多巴胺能神经元样细胞的直接重编程，”细胞研究第22卷第2期2，页321 - 332,2012。视图:出版商网站|谷歌学者
59. S. Howden, B. McColl, A. Glaser等，“有效生成无吲哚敲入或基因校正的人类多能干细胞的Cas9变体”干细胞报告，第7卷，第5期3, pp. 508-517, 2016。视图:出版商网站|谷歌学者
60. I. Sancho-Martinez, M. Li, and J. C. Izpisua Belmonte，“疾病矫正iPSC方式:基于iPSC治疗的进展”，临床药理学与治疗方法，第89卷，第89期。5, pp. 746-749, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者

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