SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/2725670 2725670 评论文章 整合重组的基因修正和分化转化过程:一步策略来克服干细胞基因治疗的局限性 李 舒英 1 http://orcid.org/0000 - 0003 - 1396 - 1831 钟 Sun-Ku 1 Adjaye 詹姆斯 医学研究部门 东方医学研究所 1672年Yuseong-daero Yuseong-gu 大田市34054 韩国 kiom.re.kr 2016年 15 12 2016年 2016年 19 07年 2016年 09年 11 2016年 16 11 2016年 2016年 版权©2016舒英李和Sun-Ku涌。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

最近出现的诱导多能干细胞(万能)和基因治疗工具提出了自体的细胞治疗罕见遗传疾病的可能性。然而,细胞重新编程效率在某些疾病如共济失调毛细血管扩张,Fanconi贫血,LIG4综合症和fibrodysplasia ossificans progressiva综合征,由于疾病相关基因的干扰。要克服这些治疗的局限性,有必要从根本上纠正异常基因重组前或过程中。此外,作为帕金森病的遗传病因,众所周知,诱导神经干细胞(iNSCs)逐步耗尽体内基因LRRK2的基因突变,LRRK2 (G2019S)。因此,保持诱导nsc直接来源于PD患者细胞体内基因LRRK2窝藏(G2019S),这将是理想的体内基因LRRK2同时治疗(G2019S)纤维母细胞在TD的过程。因此,同时重组(TD)治疗和基因治疗提供解决方案限制造成的脆弱性的重组或TD,除了适合一般应用自体工业化产品的代患者遗传缺陷,从而无需目前需要艰苦的过程。

 韩国国家研究基金会 2013年m3a9b4076487 2014年m3a9d7034335 东方医学研究所 K16091 K16130 1。介绍

自2006年发现以来,诱导多能干细胞(万能)一直被认为是高度有用的资源替代疗法以及研究人类疾病。因此,则预计将适用于治疗广泛的疾病,包括神经障碍、血液异常,脊髓损伤,心脏病,糖尿病和关节炎( 1, 2]。几组已经报道的生成各种万能干细胞来自患者的肌萎缩性脊髓侧索硬化症等遗传病,家族性神经异常,脊髓性肌萎缩,腺苷脱氨酶deficiency-related重度联合免疫缺陷症(角化病congenita, Shwachman-Bodian-Diamond综合症,豹综合症,戈谢病类型III,杜氏肌肉营养不良症,贝克尔肌肉萎缩症,盖综合症,帕金森病(PD),亨廷顿氏舞蹈症,Hutchinson-Gilford早衰症综合征,幼年发病1型糖尿病,唐氏综合症,Rett综合征,和Lesch-Nyhan综合症( 3- - - - - - 11]。幸运的是,这些疾病产生的细胞则没有基因突变的负面影响。虽然疾病相关基因重组过程可能产生不利影响,导致可怜的重编程效率和抑制维护,这是不被认为是一个至关重要的问题,除非基因突变是如此严重导致早期胚胎杀伤力。然而,即使没有严重的遗传疾病致死率在胚胎发育阶段,某些疾病相关基因会严重阻碍重组过程或削弱万能的维护,已观察到的共济失调毛细血管扩张(t) ( 12),Fanconi贫血(FA) [ 13, 14],LIG4综合症[ 15],fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP)综合征( 16, 17]。因此,重要的是要生成gene-corrected万能干细胞避免重组障碍的潜在干扰的有缺陷的基因。为实现这一目标,有必要从体细胞基因治疗则阶段之前到达受损的细胞则阶段。

替代疗法的另一个策略是分化转移(TD),也称为直接重新编程,这是一个过程,lineage-specific细胞类型直接来源于体细胞类型,从而绕过多能性阶段。TD的具有许多优点,如快速生成特定的细胞类型,以及避免造成的畸胎瘤形成万能的内在特征。然而,TD-mediated lineage-specific细胞也可能受疾病相关基因。这种效应的一个典型的例子是G2019S突变体的富亮氨酸重复激酶2体内基因LRRK2(),导致核破坏诱导神经干细胞(iNSCs)和PD患者的脑部切片中发现了( 18]。尽管nsc可以成功地从细胞则产生LRRK G2019S突变,它们完全耗尽后几个段落由于体内基因LRRK2异常之间的交互(G2019S)和核纤层蛋白B1蛋白质,这是固定在框架内核膜和参与打破核被膜的 18]。因此,这种互动会产生负面影响的形成nsc直接来源于PD患者细胞通过TD的过程。因此,随着并发编程和gene-correction方法, LRRK2要从根本上治疗(G2019S)基因在TD过程中使用gene-correction工具而不是在NSC阶段的细胞仍将港口突变基因。

在本文中,我们强调当前面临的挑战iPSC-based治疗方法和介绍一步gene-correction和重组的方法解决克服iPSC-based基因治疗的局限性。我们还提出采用理想的基因治疗方法,结合TD的gene-correction过程过程中,关注体内基因LRRK2致病突变的例子(G2019S),它逐渐耗尽在帕金森病神经干细胞。

 2。影响重组的遗传缺陷 2.1。DNA修复缺陷影响重组过程

重编程过程的的主要挑战之一是干扰由于基因组不稳定或诱导细胞凋亡 20., 21]。在这个过程中,p53蛋白基因组完整性的一个重要监控,积累的异位超表达的重组因子( 22];因此,严格控制体细胞重编程和p53会妨碍这一过程。因此,减少临时p53的活动可以成功地提高重组效率不低于初始值的100倍( 23- - - - - - 26),由于缺乏关注细胞凋亡和DNA损伤( 27]。作为一个激酶激活p53的DNA损伤反应,ataxia-telangiectasia突变( 自动取款机)基因在调节基因组稳定性中起着举足轻重的作用。染色体不稳定造成的 自动取款机突变导致t的发展,一种罕见的遗传疾病,特点是运动神经退化,白血病,和过早老化 28]。与t有额外相关的广泛的表型影响重组效率。因此,t成纤维细胞产生的细胞则效率极低,仅约为4%,在结合体t细胞与正常细胞相比 12, 29日]。

FA综合症是另外一种罕见的遗传性疾病,其特征是染色体不稳定症状如再生障碍性贫血、白血病、乳腺癌或卵巢癌( 30.]。因此,与FA相关的基因也参与DNA修复,特别是DNA interstrand交联修复,因此这些基因的突变有可能损害重编程过程。开发一个FA-iPSC模型,一些团体试图生成万能FA患者港口 FANCA或 FANCD2,或者从一个FA小鼠模型 FANCA, FANCC,或 FANCD1 / BRCA2(乳腺癌和卵巢癌敏蛋白2)( 13, 31日, 32]。虽然FA-related基因不诱发早期发育杀伤力,不能成功地生成,直到这些基因的细胞则是补充patient-derived成纤维细胞( 14]。此外,当鼠标则是来自FA小鼠成纤维细胞,重组效率还发现减少或受损 13, 20., 32]。BRCA1 coopts几个足总蛋白质,包括BRCA2 [ 33, 34]。这些蛋白质形成的复杂导致BRCA1展现相似的表型BRCA2,表明重组从BRCA1-deficient小鼠胚胎成纤维细胞(mef)也以类似的方式来观察受损BRCA2-deficient mef ( 20.]。与此同时,作为一个相互作用的蛋白质的brca, RAD51 DNA修复过程中起着关键作用通过同源重组。类似的功能损失引起的重编程效率低 BRCA基因的沉默 RAD51基因表达也严重降低重编程效率( 20.]。

除了涉及ATM - DNA修复系统,FA - BRCA -,或RAD51-dependent同源重组(人力资源),nonhomologous结束加入(NHEJ)也是一个重要的DNA修复系统涉及直接结扎的DNA链断裂区域。在这个途径,DNA连接酶IV(编码的 LIG4基因)参与修复双链断裂在最后一步NHEJ和V (D) J重组( 35, 36]。突变 LIG4基因与LIG4综合症,它的特征是白血病,免疫缺陷和发育迟缓。此外,尽管这hypomorphic突变的后果 LIG4基因不是老鼠胚胎造成致命性破坏 LIG4基因,细胞的重编程效率来源于病人携带 LIG4基因突变明显低于正常控制细胞( 15]。

上面的例子表明,几个染色体instability-related综合症与限制在重组,意味着一个强大的重编程效率和基因组不稳定性(表之间的联系 1)。

疾病与低效的重组或抑制多能性维护。

类别 疾病 基因 基因状态 重编程效率或多能性的维护 参考文献。
DNA修复 共济失调毛细血管扩张(t) 自动取款机 7004年delca 7886 deltatta 高效的一代在杂合子(15%)/低效率极低的一代纯合子(4%) ( 2]
Fanconi贫血(FA) FANCA, FANCD2 ▽ 一个 没有改变,或极低的高效生成(FANCA),低有效的重组和可怜的维护(FANCD2) ( 13, 14]
足总或乳腺癌 BRCA1, BRCA2 ins 一个 在第11外显子或S1598F BRCA1基因点突变, ▽ 一个 外显子27 BRCA2 ~ 20倍低于正常 ( 20.]
癌症 Rad51 可拆卸的表达式的成分 ~ 60倍低于正常 ( 20.]
LIG4综合症 LIG4 c。2440C>T in allele 1 and c.1406G>A in allele 2, or c.833G>A 重编程效率低(0.002 ~ 0.012%)和细胞凋亡敏感性 ( 15]
信号 Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) ACVR1 c.617G >一 重编程效率低(~ 0.05%)和抑制性万能的维护 ( 16, 17]

未知的 一个 轨迹。

 2.2。持续激活骨形态发生蛋白(BMP)信号通路影响重组

成员转化生长因子,每个绑定到BMP II型受体,然后BMP-bound II型受体激酶磷酸化BMP I型受体激活Smad蛋白质,包括Smad 1/5/8,扮演主要角色在骨形成( 37]。除了他们的角色在细胞分化,我国还调节组蛋白H3 9赖氨酸甲基化,功能阻碍体细胞重编程( 38]。因此,BMP信号通路的激活可以防止重组超出中间pre-iPSCs阶段( 38]。事实上,成纤维细胞来源于FOP综合症患者,港口内在BMP I型受体异常也表现出典型的重组以及抑制自我更新后不完全重编程( 16, 17]。FOP是直接激活素受体的突变引起的,类型1 ( ACVR1)基因,导致合成的异常激活素受体激酶2 (ALK2)蛋白质,导致本构BMP I型受体的活动和异常(异位骨化 37]。ALK2已被证明的功效进行了有益的贡献一代的细胞则只有在重编程过程的早期阶段,而本构ALK2激活妨碍了一代的细胞则在早期阶段( 16]。除了重编程效率低,变异ALK2-iPSCs (mALK2-iPSCs)表型表现出弱碱性磷酸酶活性,表明不完全重编程,以及倾向分化成成骨细胞矿化,高代表成骨的标记基因的表达( 17]。因此,mALK2-iPSCs不能有效地稳定或维护,除非异常ALK2蛋白质基因治疗或使用ALK2抑制剂功能减弱。

 3所示。Gene-Correction工具和iPSC-Based基因治疗的局限性

仍有许多种类的疾病没有证实重组效率。和他们中的一些人将面临的局限性iPSC-based基因治疗由于低效的重组基因缺陷的影响。然而,突出的例子在前面的部分中,为了克服这些限制,完全有必要从patient-derived删除因果基因体细胞代万能前,或者在重组过程中阶段。病毒vector-mediated 足总基因治疗的第一个例子是克服iPSC-based基因治疗的局限性。由于细胞重编程能力差几个FA-related障碍,患者治疗策略已开始使用重组病毒vector-mediated基因治疗,从而使非功能足总蛋白质的功能恢复。交付是至关重要的外生FA基因重组之前,作为非功能FA基因会损害patient-derived成纤维细胞的重编程( 13, 14]。然而,有几个障碍需要克服的可能性沉默的正常基因的表达由病毒载体,以及简化程序,以避免众多繁琐的步骤的要求,如整理viral-genome-integrated细胞,随后基于排序的细胞重新编程。虽然失去了功能性FA基因可以简单地补充一个正常的外源基因,病毒vector-mediated基因疗法不能一般应用于功能性基因的获得,如 ACVR1c.617G >一,which constitutively activates the Smads signaling pathway as a dominant effect. That is, in order to overcome the limitation of iPSC-based gene therapy as the dominant effect of this mutation, a fundamental treatment must be applied to replace the mutated base with the wild type, simply not complemented by the normal gene.

这最好可以通过结合一些精确的基因编辑工具的好处等强大的分子剪刀,包括锌指核酸酶(ZFNs) [ 39- - - - - - 41),转录activator-like效应核酸酶(取得) 42, 43定期],RNA-guided内切酶的微生物集群空间短回文repeat-Cas9 (CRISPR-Cas9)核酸酶系统( 44- - - - - - 46),或细菌人工染色体(BAC)建立人力资源( 19),使靶基因有效地插入,删除或替换基因组中根据需要( 17]。到目前为止,ZFN的优点和缺点,取得和CRISPR / Cas9系统已经全面评估( 47]。然而,BAC-based HR系统不受欢迎,尽管显示基因修正的定位效率高。BAC-based人力资源的模式是通过直接重组自己的巨大的同源臂,大约70 - 80 kb的长度,在目标轨迹( 19, 48, 49];因此,这种方法不需要额外的供体DNA(图 1(一))。相比之下,因为可编程核酸酶模式,包括ZFN,取得,和CRISPR / Cas9只是诱导DNA双链断裂在目标序列,捐赠者模板是另外需要有效地调解基因修正homology-directed修复(图 1 (b))。

模式的基因修正基因编辑工具。绘制图像(一)的基础上,以前的报告( 19]。选择磁带(CAG-Neo γ)插入到非编码区域的正常BAC recombineering DNA。侧翼同源臂的长度表示。窝藏的基因突变基地被替换为正常的BAC基因通过同源重组。选择磁带由Cre重组酶切除。(b)的可编程的核酸酶模式,如ZFN,取得,或CRISPR / Cas9,诱导DNA双链断裂(双边带)在目标轨迹。可编程的核酸酶的基因模式校正与供体DNA修复双边带,另外介绍了。

有效基因编辑工具适用于万能,细胞必须抵抗压力条件的过程,包括胰蛋白酶化或转染。一般来说,岩石抑制剂y - 27632被证明能提高单个细胞的生存能力分离胰蛋白酶,帮助维持自我更新能力的细胞( 50]。然而,y - 27632治疗不能防止mALK2-iPSCs自发分化在胰蛋白酶化和转染,尽管提高生存能力的细胞( 17]。因此,我们将建议在下一节iPSC-based治疗方法面临的挑战。

 4所示。策略来克服干细胞基因治疗的局限性 4.1。联合重组和基因修正

目前基因治疗方法用于iPSC-based通常涉及gene-correction工具的应用则donor-derived体细胞重编程后(图 2(一个);一步 1 一个步骤 2 )。然而,这种方法依赖于假设异常基因,参与疾病,没有万能的影响一代或维护(图 2(一个);一步 1 a)。也就是说,如果它是不可能有效地产生或维持细胞则源于细胞的患者上述疾病(图之一 2(一个),一步 1 b),当前基因治疗方法不会有效地适用于致病万能。因此,为了克服传统基因疗法的盲点,异常基因将第一次取代patient-derived体细胞的正常基因,在iPSC阶段。这可以通过同时引入gene-correction工具以及重组因子patient-derived体细胞(图 2 (b))[ 17]。我们应用这种方法mALK2真皮成纤维细胞,表现出典型的重组和抑制万能的维护 16, 17]。的表达重组因子加上gene-correction工具,包括重组游离向量,CRISPR / Cas9-encoding向量的目标 ACVR1基因,供体DNA携带正常的基地,使正常的一代ALK2-iPSCs没有问题关于非典型重组或维护抑制由基因突变引起的( 17]。除了这种方法的应用为脆弱的万能,一步一代gene-corrected则同时重组和基因编辑有额外的好处的节省时间,精力,和成本( 17, 51),从而消除执行繁琐的重编程过程的需要,然后随后执行基因单独编辑,根据传统gene-correction方法。因此,所述一步到位的方法非常实用和广泛适用于替代疗法。

合并后的重组和gene-correction策略的概述。(一)当前iPSC-based gene-correction方法。一步 1 答:不致病的则可以稳定维持自我更新属性。一步 1 b:致病性万能,来源于细胞突变 自动取款机, 足总, LIG4,或 ACVR1,表现出严格的自我更新和一个潜在的上升的基因组不稳定,阻碍进展步骤 2 b。步骤 2 答:万能干细胞生成的步骤 1 可以随后受到基因修正与ZFNs等各种工具,取得,CRISPR / Cas9或BAC向量。(b)一步过程同时涉及重组和基因修正。Gene-corrected则是直接从patient-derived体细胞产生,同时结合重组因子和gene-correction工具。

 4.2。耦合TD和体内基因LRRK2基因修正(G2019S)体细胞

家族性帕金森病引起的基因突变通常是罕见的,但最常见的原因之一,过早或过晚发性PD体内基因LRRK2的结果从一个常染色体显性遗传变异(G2019S),占5 - 6%的病例家族性帕金森病或偶发性帕金森氏病1 - 2%的情况下 52, 53]。和几组已经证明体内基因LRRK2基因正确的能力(G2019S)突变则使用ZFN-mediated同源性定向修复(HDR) ( 54, 55]。体内基因LRRK2 ZFN-mediated HDR的方法也可以使用执行(G2019S)相结合体细胞重编程和gene-correction流程(图 3(一个),一步 1 b)。虽然这突变没有影响重组过程或iPSC维护,它仍然可以帮助更快地生成治疗则可能比使用两步一代方法,涉及重组和后续基因修正(图 3(一个),一步 1 一个步骤 2 )。这种方法的另一个吸引人的财产,这些基因编辑工具也可以用于体内基因LRRK2 iNSCs携带(G2019S),由于TD的主要优势之一是缺乏畸胎瘤形成的风险,这是一个有关问题使用iPSC-derived细胞( 56),可以快速生成lineage-specific细胞类型。体内基因LRRK2然而,(G2019S)突变也会导致iNSCs的进行性变性,iNSCs来自mLRRK2-iPSCs展览的损耗后接受几个段落( 18]。这些发现强烈建议mLRRK2施加负面影响维护iNSCs源自mLRRK2-somatic细胞。因此,直接从体内基因LRRK2 PD的成纤维细胞生成iNSCs (G2019S)突变保持稳定,是理想的基因治疗mLRRK2成纤维细胞在TD的过程中,可以通过使用一个耦合TD和gene-correction方法(图 3 (b),一步 1 b),与mLRRK2-iNSCs gene-corrected iNSCs稳定自我更新和分化向多巴胺能神经元(DNs)。的主要关键因素gene-corrected干细胞疗法的应用程序的能力不断增长,维护他们的分化潜能,和自我更新能力。几组最近推出了人类的直接转换成纤维细胞的方法DNs ( 57, 58]。因此,它可能是在概念上可以生成gene-corrected DNs耦合从PD直接诱导成纤维细胞的基因修正和直接转换成DNs。然而,诱导DNs一般限制的持续增长,这妨碍了筛选阳性克隆的能力以及获得足够多的治疗资料。因此,随着并发编程和gene-correction方法,应用基因修正和TD-mediated iNSC似乎是一个合适的方法来生成治疗PD的材料细胞疗法。

体内基因LRRK2 gene-correction方法的应用在细胞(G2019S)突变。(一)常规gene-correction方法使用体内基因LRRK2突变产生的细胞则(G2019S)突变成纤维细胞,包括重组与后续基因修正(步骤 2 通过一步 1 ),联合重组和体内基因LRRK2 gene-correction方法基于(G2019S)突变成纤维细胞(步骤 1 b)。(b)突变体内基因LRRK2 iNSCs产生(G2019S)突变成纤维细胞,可能表现出步中受损的自我更新和增殖 1 ,然而,在步骤 1 b,分化转化和基因修正同时发生,纠正iNSCs能够保持稳定增殖和自我更新潜能。

 5。结论

到目前为止,许多类型的patient-derived万能已经生成,其中大部分已经基因疗法提供参考资料。然而,有几种疾病的治疗使用当前iPSCs-based基因治疗方法仍然是一个挑战。

一些这些疾病导致染色体不稳定或受损的DNA修复。虽然一代低数量的disease-derived万能仍然是有前途的,非整倍性的发生率高的情况下可以进一步加剧了重组因子如OCT4、SOX2 KLF4,原癌基因。事实上,ATM-deficient获得严重的染色体异常的细胞则经过几个段落( 29日]。虽然原癌基因,代表癌蛋白,提高编程效率,也异常的概率大幅提高在重新编程细胞DNA修复基因缺陷。然而,随着蛋白质参与DNA修复通常获救一步系统的使用提出,重组效率可能会增强,从而减少非整倍性的发病率。

一步系统最近引入的,只有4例应用这种方法已报告日期( 17, 51, 59]。在所有情况下,细胞基因治疗CRISPR / Cas9-mediated HDR,导致目标[5 - 17%的效率 17, 51, 59]。这个目标效率与获得iPSC-based方法,已尝试使用不同的基因治疗工具,如质粒,BAC,腺相关病毒,helper-dependent腺病毒,ZFN [ 60]。

LRRK2 (G2019S)与核纤层蛋白B1蛋白质相互作用,这是固定在框架内核膜和参与打破核被膜,导致的损失函数的核纤层蛋白B1蛋白质,最终增加染色质不稳定,最终耗尽iNSC池。因此,使用TD-mediated iNSCs加上基因修正可能使染色质iNSCs稳定性的维护,从而提供一个稳定的PD患者的细胞替代治疗方法。

除了上面提到的罕见疾病基因治疗,先进一步法通常适用于所有disease-derived细胞无论有缺陷的基因,可以大大节省时间,减少劳动密集型实验,减少所需的成本目前iPSC-based一半的基因治疗方法。因此,所述一步到位的方法有望成为越来越流行的发展更迅速和更个性化的替代疗法在不久的将来。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

这项工作的部分支持由韩国国家研究基金会拨款2013 m3a9b4076487和2014 m3a9d7034335和东方医学研究所资助K16091 K16130。

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