病毒性集成效率和稳定的基因表达有多种能力的成年祖细胞

文摘

病毒性集成系统,PhiC31噬菌体整合酶(C31),睡美人转座酶(某人),提供了一种有效的方法体外基因传递到细胞。在这里,我们使用一个plasmid-encoding GFP和新霉素磷酸转移酶以及识别序列C31和某人集成系统有效地证明两个系统介导的集成在人工培养的成纤维细胞和鼠多功能成年祖细胞(rMAPC)。印迹分析G418-resistant rMAPC克隆显示2倍数量的SB-mediated插入每个克隆相比C31。序列的识别染色体结网站表示随机资料SB-mediated要素和更受限制的配置文件C31要素。转基因rMAPC生成与系统维护能力分化成肝和GFP表达内皮虽然明显衰减。我们得出结论,某人和C31是有效的MAPC病毒性基因工程集成系统干细胞生物学的基本研究。

1。介绍

干细胞有能力长期自我更新文化,可以诱导多种细胞类型。这些特征提供了一个独特的遗传和发育研究资源或治疗中使用细胞和基因治疗的发展。多功能成年祖细胞(MAPC)代表一个类的干细胞来源于骨髓(BM)和其他成年哺乳动物的组织文化可以扩展(1- - - - - -3生成多种细胞类型在体外和在活的有机体内(4- - - - - -8]。移植的一些研究已经表明,人类MAPCs有利于功能恢复后血管缺血可能通过营养效应(9- - - - - -12和拥有contact-independent免疫抑制潜在13,14]。这些属性表明MAPCs可能是一个有效的潜在来源用于免疫调节和治疗缺血性疾病。进一步扩展其使用的单基因疾病,用于细胞筛选模型的建立需要工程师MAPC方法引入遗传元素定义的。

病毒性dna介导基因转移一直探索的新基因表达在不同的细胞类型在体外和在活的有机体内。然而,裸DNA载体的有效性往往限制无法提供持续的基因表达。稳定整合plasmid-encoded序列是低效的,因为它依赖于随机双链break-mediated重组。解决这个问题的方法之一是使用病毒性载体结合的重组酶的能力将遗传物质整合到细胞染色体。

睡美人(某人)转座酶和PhiC31 (C31)整合酶plasmid-based已经证明调解稳定系统在哺乳动物细胞基因转移和表达。某人的一员Tc1 /海员——家庭的DNA转座子,发现不活跃的残余在不同基因组在所有主要的王国除了细菌和调解基因转移的“剪切和粘贴”机制(15)(图1)。某人转座子系统是由一个进化的“修复”Tc1式的基因组序列中发现salmonid鱼(16]。催化转座酶的自治元素由两侧末端反向重复(也是)包含两个直接重复(博士),这是转座酶的结合位点和换位的必要条件16,17]。基因转移应用程序,转座酶分离DNA转座子结束,取而代之的是任何货物。转座酶可以提供相同(独联体)或单独的(反式)从一个编码转座子或质粒在体外信使rna转录(18]。当表示,转座子的转座酶首次将捐赠的质粒和正是将这种基因元素插入脊椎动物染色体TA二核苷酸。与随机重组,插入由换位发生在不改变侧翼染色体序列。某人转座子系统已被用于稳定的多个基因改造啮齿动物和人类细胞系(16,17,19和主要包括小鼠肝细胞20.- - - - - -25),人类皮肤细胞(26),小鼠肺(27- - - - - -29日),和人类外周血t细胞(30.]以及胚胎干细胞(ES)细胞从老鼠31日,32)和人(33,34]。小鼠MAPC修改使用表达式的某人转座子工程双记者编码DsRed2和萤火虫荧光素酶被用来研究MAPC通过的导航模式在活的有机体内生物荧光成像后移植到免疫缺陷小鼠(35]。此外,最近的研究证明有用的某人转座子系统人类CD34基因改造⁺从脐带血造血祖细胞分离36,37]。

的C31整合酶是一种丝氨酸重组酶家族的成员中发现链霉菌属(38]。在自然条件下,双组分C31系统介导单向复合事件之间attP噬菌体基因组和attB网站的链霉菌属染色体。应用程序在哺乳动物细胞中,基因序列的attB含有质粒插入细胞染色体在野生型网站有部分同源性噬菌体attP(“伪-序列attP“网站)当codelivered噬菌体整合酶酶的来源(39,40)(图1)。PhiC31-mediated集成的频率大约是10 - 100倍高的可逆相比可(Cre和隔爆)这两个要求目标识别preinserted到基因组序列(41]。的效用C31调解制度已经证明了稳定的基因表达各种培养的哺乳动物细胞系(42),在主细胞,包括老鼠肝脏(43,44),人类皮肤细胞(45),和肌源性干细胞46)以及特有的基因插入在鼠标47)和人类胚胎干细胞(48]。

这里,我们直接测试这两个病毒性载体系统集成能力协调稳定的基因转移到原始的成体干细胞。一个内部控制,双官能团的质粒是利用codeliver识别序列C31和某人集成系统。我们调查的频率基因插入,基因表达的强度,影响基因修饰的干细胞MAPC的潜力。这些结果提供了一个评估这些病毒性集成系统的相对有效性的目的体外基因转移和手段为病毒性生成集成工程平台交付和表达的转基因干细胞。

2。材料和方法

2.1。质粒构建

整合向量(pKT2 /唠叨)构造使用T2末端反向重复序列侧翼的货物(49]。建设pKT2 /唠叨,新霉素磷酸转移酶(Neo) cDNA被PCR获得使用pT / Neo (50)作为模板与引物Neo-F (5′gcc ACC ATG ATT棉酚CAA手枪GGA TTG颈- 3′)和Neo-R(5′公司治理文化柠檬酸棉酚棉酚CTC GTC亚美大陆煤层气有限公司AAG-3′),随后克隆到pCR2.1-TOPO(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)pTOPO-Neo形式。一个生态国际扶轮片段包含放大Neo序列插入到polylinker PGK启动子和兔子β球蛋白聚腺苷酸化的信号pKT2 / PGK形成pKT2 / PGK-Neo。的丙氨酸B序列和EF1α监管GFP编码序列是由引入307 - bp生态R1片段包含C31丙氨酸从pTA - B网站丙氨酸B (39米歇尔•卡洛博士),请提供的斯坦福大学)到相同的站点在质粒pVITRO-GFP (Invivogen,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。一个欣dIII -Xho我片段包含attB序列,EF1α启动子、绿色荧光蛋白编码序列和SV40聚腺苷酸化信号随后PGK启动子的分离和克隆上游pKT2 / PGK-Neo之间欣dIII和萨尔我。

荧光素酶(pCMV-Luc)和SB10转座酶(pCMV-SB)表达向量之前描述(50,51]。C31整合酶被CMV启动子的转录控制隔离新人道我- - - - - -Spe我从pTOPO-Int片段包含整合酶编码序列(请提供的米歇尔·卡洛博士,斯坦福大学)和克隆它的荧光素酶pCMV-Luc之间新人道我和Xbai .质粒DNA制备使用Endofree马克西准备工具包(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)。

2.2。细胞培养和基因转移

人纤维肉瘤HT1080细胞保持完整的生长介质组成的杜尔贝科的修改鹰中补充10%胎牛血清和1% antimycotic-antibiotic(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国),和孵化37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。转染的前一天,4 - 5×10⁵细胞被播种到6厘米组织文化板块。细胞cotransfected pKT2 /唠叨(500 ng) + pCMV-Luc pCMV-SB或pCMV-Int(150、500、或1500 ng)使用SuperFect试剂(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)在最后一卷1毫升完成前三个小时生长介质改变介质。稳定的基因转移,收集细胞转染两天后,与台盼蓝染色,计数。可行的细胞(30000)被镀成100毫米菜包含完整的生长介质与850年补充μg / mL G418(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国)。经过14天的选择、细胞被固定和染色以70%甲醇溶液含有1%结晶紫。

鼠MAPC (rMAPC)保持在纤连蛋白涂层烧瓶或菜肴使用先前描述的条件(52]。转染的日子,rMAPC释放与胰蛋白酶盘子,用PBS洗净,0.1到0.5×10⁶可行的细胞(台盼蓝-)resuspended nucleofection溶液中V(美国Amaxa,马里兰州)pKT2 /唠叨(5μg)和等量的要么pCMV-Luc, pCMV-SB,或pCMV-Int,转移到提供的试管,electroporated (Amaxa;设置a - 23)如前所述52,53]。这些细胞被立即resuspended prewarmed增长中、去籽切成6厘米。稳定转染的细胞生长在中补充了G418 (400μg / mL)转染后1天。

2.3。流式细胞术

HT1080细胞或MAPC收获和呈现为流仪分析单细胞悬浮体。活细胞识别和封闭的排斥propidium碘,然后检测表达GFP FACSCalibur系统(Beckton-Dickinson)使用CellQuest分析软件(BD生物科学、海德堡、德国)。

2.4。南部杂交分析

如前所述(执行南部印迹44]。简单地说,10μ克基因组DNA分离从几个G418-resistant MAPC克隆在一夜之间被消化Bam嗨(SB-treated细胞)或Spe我(C31-treated细胞),通过0.8%琼脂糖凝胶电泳,然后涂抹到nytran。835 - bp片段编码绿色荧光蛋白序列从积分分离向量(pKT2 /唠叨)年龄我- - - - - -欣dIII消化和³²P放射性标记使用让它II随机引物标记工具包(美国加州拉霍亚,Stratagene)使用DNA探针。

2.5。在体外分化和标记表达式

未分化rMAPC unmanipulated,已经通过随机集成在cotransfection与荧光素酶表达载体或由稳定的集成C31integrase或某人转座酶RNA隔离和rt - pcr分析收获进行了如前所述[52]。rMAPC被分化成内皮细胞或肝细胞(描述2,6,7]。内皮细胞分化,在基底生长培养基培养转基因MAPC补充2%或5%血清+血管内皮生长因子(VEGF, 10 ng / mL)。肝脏分化引起了添加2%血清肝细胞生长因子(HGF, 20 ng / mL)和纤维母细胞生长4 (FGF4 10 ng / mL)生长介质。在9和14天,收获细胞RNA隔离,和晚期rt - pcr或存在分析使用引物endothelium-specific记录血管内皮生长因子受体2 (Flk1)、血管内皮生长因子receptor-1 (Flt1)和endothelial-derived基因1(烤箱)或hepatocyte-specific标记肝细胞的核factor-3-beta (HNF3b)、甲胎蛋白(AFP),和转体基因(竞技场队伍),在glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)担任内部控制RNA加载和完整性。晚期rt - pcr的扩增子通过2%琼脂糖凝胶电泳分离。存在,目标基因表达规范化GAPDH和相对表达式计算的公式。引物序列描述在早期研究[6,7]。所有实验都至少执行在每组重复的技术复制。

2.6。细胞遗传学分析

转基因rMAPC清洗去除死细胞和resuspended 10毫升培养基。细胞被送往明尼苏达大学的细胞遗传学核心实验室进行分析。简单,细胞治疗与秋水仙胺3小时,然后根据标准的细胞遗传学协议收获。大约100中期被G-banding评估在400 - 425区间水平分辨率。

2.7。复苏的集成网站

G418-resistant克隆cotransfection后被孤立的细胞类型pKT2 /唠叨+ pCMV-Luc pCMV-SB或pCMV-Int。基因组DNA (gDNA)使用Puregene DNA分离净化设备(Gentra系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。基因组的复苏方法用于识别PhiC31 integrase-mediated染色体插入。高分子量DNA (2g)是消化新人道我,Spe我和Xba我(生成兼容5′末端;示意图如图1)在100%乙醇沉淀和回收DNA的结扎稀释条件下(500L)和4单位的T4 DNA连接酶(美国新英格兰生物学实验室,贝弗利,质量)。的结扎的DNA与100%异丙醇沉淀,颗粒状microcentrifugation和被resuspended 10前用70%乙醇洗净L无菌H₂o·2毫升的DNA electroporated进DH10B electrocompetent大肠杆菌(美国威斯康星州麦迪逊Promega),使细菌细胞恢复SOC媒体通过孵化风潮在37°C / 200 rpm Luria电镀前1小时/ Bertania琼脂包含50克/毫升卡那霉素。质粒DNA孤立并使用引物测序,侧面attB网站(如图1 (b)):attB- f(5′标签GGC棉酚GG亚美大陆煤层气有限公司GG TGG-3′)attB- r (5′ggc TTC GAG ACC GTG ACC TA-3′)。SB-mediated集成事件,linker-mediated PCR技术被用来恢复transposon-chromosome结序列描述(54)和示意图如图表示1。基因组DNA (2g)是消化论坛我和结扎链接器。主要进行PCR引物5′gta ATA CGA CTC ATA GGG C - 3′, 5′玻纤棉酚TTT太极拳亚美大陆煤层气有限公司CTG TTT AAA GGC ACA GTC AAC-3′在下列条件:94°C 2分钟,然后25 94°C的周期为15秒,60°C 30秒和72°C 90秒。PCR产品稀释和嵌套PCR是在相同条件下使用引物5′gg GCT 20亚美大陆煤层气有限公司总部GGA颈- 3′,5′广汽TTG TGT猫GCA CAA AGT AGA TGT CC-3′。嵌套的产品反应通过2%琼脂糖凝胶电泳分离。特定的产品被切除,纯化使用Qiaquick凝胶萃取装备(美国加州试剂盒,瓦伦西亚),和克隆到pGEM-T向量(美国威斯康星州麦迪逊Promega)使用ElectroMax DH10B(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)转换。所有恢复集成事件在先进的基因测序分析中心明尼苏达大学并受BlastN分析对使用运用老鼠基因组数据库。

3所示。结果

3.1。人工培养的成纤维细胞基因转移和稳定表达

某人,C31可都需要自己的独特的识别序列和催化组件来调解基因序列插入染色体。相比我们直接集成的有效性和长期使用单一双组分质粒表达,是内部控制整合序列(图1(一))。的模式整合到宿主基因组由某人和催化C31图表示1 (b)。

功能测试内部控制向量(pKT2 /唠叨)cotransfected每个重组酶时,我们进行了克隆形成实验在培养人类男性纤维肉瘤HT1080细胞。该细胞系的基础上选择一个相对正常核型细胞遗传学分析(46,XY 5 p + 11 +) (55]。的影响的剂量codelivered recombinase-encoding稳定的基因转移和表达质粒是由G418-resistant集落形成和GFP荧光。pKT2 /唠叨(500 ng)是cotransfected一式三份,150,500,或1500 ng CMV-regulated荧光素酶(pCMV-Luc)转座酶(pCMV-SB),或整合酶(pCMV-Int)表达质粒(图2(a))。流仪结果两天后GFP的表达了几乎相当于转染效率(20% - -25%的细胞GFP阳性;数据未显示)。类似于以前的研究(20.,50,56),我们的数据显示,经常观察到的抑制作用随着剂量的transposase-encoding质粒。的最低剂量pCMV-SB10 (150 ng)产生最大的增加(20倍大于没有转座酶控制)G418-resistant集落形成,而产生的最高剂量(1500 ng)只有5倍比没有转座酶控制殖民地(图2(b))。为C31整合酶,增加的浓度pCMV-Int改善G418-resistant集落形成(从3 - 7倍)相比没有整合酶控制pKT2 /唠叨(图2(b))。

十G418-resistant克隆生成的cotransfection 500 ng或1500 ng某人转座酶或C31整合酶在G418-containing媒介独立扩展一个额外的4周上游的描述表达GFP记者通过流式细胞术(数字2(c)和2(d))。三耐药克隆生成的随机重组(+ pCMV-Luc)显示GFP的表达(> 60%),但绝大多数未能表达绿色荧光蛋白(GFP阳性6/10 < 10%)。相比之下,GFP表达被某人保持所有克隆呈现耐药——或PhiC31-mediated集成但与增加细胞转染效率500 ng和1500 ng的重组酶。这些结果表明,单一双官能构造适当的重组酶的存在可以调解整合到宿主基因组造成持久的转基因表达。

3.2。病毒性MAPC集成效率和稳定的基因表达

骨骨髓来源干细胞自我更新和增殖能力的文化是重要的生物工具为研究细胞和分化命运。确定集成效率由某人转座酶(某人)和C31整合酶(Int)成体干细胞,我们评估稳定基因转移在MAPC源自新生大鼠的骨髓(产后2 - 5天)。Nucleofection作为基因转移的方法是基于以前的研究证明这些细胞基因转移效率和低毒性(52,53]。

整合向量pKT2 /唠叨codelivered与重组酶的来源1:1质量比(剂量证明有效地渲染HT1080细胞抵抗G418筛选)为未分化MAPC使用Amaxa Nucleofector技术(部分中描述2。2),转染效率从15%到20%不等的流仪分析GFP阳性细胞24小时后(数据没有显示)。经过7到10天的文化,增长我们发现G418-resistance是某人在背景增加了30倍和10倍Int MAPC允许时形成不同的殖民地(图3(一个))或联合耐药克隆亚文化时保持细胞密度在100 - 500细胞/厘米²(图3 (b))。这些克隆扩张进一步分析包括基因整合位点(图的决心3 (c))。

3.3。转基因MAPC保持分化的能力

基因工程的核型的影响MAPC在细胞遗传学水平评估G418-resistant汇集克隆,维持在100 - 500细胞的密度/厘米²。大多数的利差(> 80%)与正常二倍体核型unmanipulated鼠细胞以及细胞经历了随机整合在cotransfection与荧光素酶表达载体或由稳定的集成C31integrase或某人转座酶(图4(一))。

MAPC具有分化成多种细胞类型的能力。细胞工程G418-resistance使用控制Luc某人转座酶或PhiC31整合酶在降低血清中维护文化(2 - 5%)和血管内皮生长因子(VEGF)的存在或纤维母细胞生长因子4 (FGF4) +肝细胞生长因子(HGF)。后14天的分化,不同形态的变化纺锤状MAPC被观察到。形态Luc之间无显著差异,某人,Int(图就非常明显4 (b))。进一步量化和比较不同方法之间的分化水平,终点rt - pcr和存在分析RNA分离这些细胞阳性表达内皮(Flk-1、Flt1 Eg1)或肝细胞(HNF3b,法新社和竞技场队伍)特定的标记(图4 (c)和表1)。这些结果说明利用某人或MAPC转基因C31维持干细胞的性格和能力在诱导分化成多种细胞谱系。

3.4。在MAPC基因表达强度

GFP基因表达强度决定的记者。24耐药克隆被随机孤立的某人和C31扩大在G418-containing中额外增加3 - 4周。GFP表达的水平为每个独立的克隆,流式细胞术测定(图5(一个))。尽管所有克隆人的G418抗性,GFP大多数克隆强度很低,只有很少比例的细胞表现出表达以上背景。克隆被分成三类根据百分比(%)的细胞GFP表达高于背景:低GFP≤5%⁺;中级:10 - 20% GFP⁺;GFP和高≥20%⁺。使用这些标准,我们发现大多数G418-resistant克隆中含有较低或中间的百分比GFP-expressing细胞,包括23/24克隆生成的随机整合,PhiC31整合酶,23/24和18/24某人转座酶,只有1的SB-mediated克隆表现出更高水平的GFP的表达。

确定每个重组酶的影响要素拷贝数,我们研究了平均每个MAPC克隆的要素数量印迹分析。基因组DNA分离随机选择10的24 G418-resistant MAPC克隆与酶切消化后在整合向量序列,生成GFP-hybridizing大小不同的片段,每个要素和提供一个评估的数量稳定的转座酶或插入由某人C31整合酶(图5 (b))。要素的数量在SB-mediated稳定克隆6±3,与一个G418-resistant克隆(7号)显示至少有12个独立的要素。这个值高出三倍比先前描述的SB10-mediated插入人工培养的成纤维细胞(1 - 2转座子要素/克隆)(50,56,57]。有趣的是,每个克隆人类成纤维细胞1 - 2基因要素表现出稳定的基因表达,而MAPC以增加数量的要素显示弱的转基因表达。有更少的要素/克隆的情况C31 integrase-mediated基因转移(3±1),可能造成这个向量的site-preferred角色系统。

MAPC克隆的有趣的是,转基因表达显著降低相比,克隆获得相同的构造在HT1080(图5 (c))。分析个体克隆获得的平均GFP +细胞HT1080 rMAPC进一步证实这个观察(图5 (d))。这些结果表明低拷贝数集成,表观遗传的抑制promoter-transgene元素(58),或集成在一个基因组的网站不支持活跃转录。

3.5。分子分析集成网站孤立MAPC克隆

几个要素进一步特征序列层面上使用linker-mediated PCR(某人)或质粒拯救(C31)技术(见部分2。7)。某人,我们恢复30独特的转座子:染色体连接序列映射到独立的染色体(图17日立场6和表2)。我们也获得了27截然不同C31要素分布在染色体(图116和表3)。MAPC克隆生成使用某人表现出相对随机分布的集成C31对待MAPC透露特定序列在染色体X的浓缩,9岁和17(表2和4)。这些网站在多个独立的克隆,我们决定测试三个克隆证明高、中或低的GFP表达对要素数量和基因组位置(表3)。这一分析显示,每个克隆的要素数量和基因组的位置要素与GFP表达水平有关。绿色荧光蛋白的克隆表现出更高的比例⁺细胞有4个要素,而克隆具有中等或低水平的表达特征2和3要素,分别。此外,克隆证明增加GFP的表达(嗨)包含插入染色体X和17类似克隆证明减少GFP表达(Lo),而集成9号染色体上没有检测到。同样,另外分析了克隆超过5要素/细胞没有表现出高水平的GFP的表达。这些数据表明,要素或要素单独的基因位置可能不会决定坚持转基因的表达,但这些以及其他的组合表观遗传因素可能起着关键的决定作用。

4所示。讨论

在这项研究中,我们使用了一个内部控制的双功能提供磁带编码绿色荧光蛋白表达质粒或新霉素磷酸转移酶的两个组件C31和某人集成系统为人工培养的成纤维细胞和鼠多功能成年祖细胞(rMAPC)。两个系统通过recombinase-mediated整合有效介导产生稳定的基因转移外源序列。转基因rMAPC维持其干细胞特性,证明了能够分化成内皮细胞和肝组织的特定的细胞因子。沉默的观察GFP每个系统当G418-resistant rMAPC扩大在文化。印迹分析表明,要素的数量在SB-transposed稳定克隆6±3而更少的独立要素被检测到C31整合酶工程细胞系(3±1)。

病毒性,dna介导基因转移一直探讨的潜在基因疗法针对各种不同的细胞类型在体外和在活的有机体内。一个远程目标是测试病毒性载体系统集成能力协调稳定、dna介导基因转移在造血干细胞(HSC)。基因工程的HSC的能力来完成长期的重新造血系统曾被使用来完成集成病毒载体和报道使用某人转座子系统(36,37]。与HSC MAPC文化长期自我更新能力,可以与特定的细胞因子诱导分化形成多种细胞类型。这些特征提供了独一无二的资源用于测试:(i)病毒性基因转移在原始干细胞,(2)基因工程的影响在维持干细胞特性,(3)稳定的转基因表达分化后,和(iv)插入站点配置文件在一个基因组广泛,与潜在的功能筛选原始和分化细胞系统。

应用干细胞治疗遗传病的修正可能需要长期的新引入的治疗基因的表达,最有效地通过转基因的整合。然而,随着外源元素整合到染色体DNA的插入突变带来的不利影响。集成可能导致管制的肿瘤抑制基因的表达,致癌基因或细胞循环监管基因导致癌症(59- - - - - -63年]。因此,全基因组分析insertion-site偏好集成各种目标向量是在探索细胞和组织(60,61年,64年,65年]。

某人转座子在哺乳动物基因组呈现出一个相对随机集成模式(66年- - - - - -68年),不太可能融入转录基因或转录监管区域比其他集成向量如逆转录病毒和慢病毒(66年,67年,69年]。有一个类似的基因转移效率,C31整合酶显示偏好一个看似有限数量的插入目标网站在哺乳动物的基因组,受益于“伪的顺序要求attP”网站。事实上,一些分析C31-mediated集成事件表明,优惠网站集成在老鼠和人类基因组存在符合最多30 - 40%部分野生型噬菌体序列同源性attP目标(20.,40,42]。这些数据表明,C31 integrase-mediated DNA插入是一个相对site-preferred通过集成方法实现持久的基因表达。

病毒的共同限制或plasmid-based集成在未分化的细胞是基因沉默,发生在扩张或差异化的目标人群。这种淬火的表达可能引起的表观遗传的影响,如转录调控序列的甲基化或抑制转录因子结合通过染色质缩合和基因组改造。我们的研究结果表明,当某人转座酶实现多个集成/克隆,C31整合酶介导的平均2 - 4集成/克隆。这是比已报道了老鼠和人类细胞(平均1集成网站克隆42,43]),可能是由于使用的整合质粒的浓度或比例的整合质粒C31整合酶。交替,老鼠细胞或干细胞如MAPC特别是可能有一个更开放的染色质结构,从而暴露出更多的“伪attP由PhiC31整合酶”网站的目标。

唯一的其他研究报告成功使用PhiC31整合酶在大鼠细胞都使用了老鼠胚胎成纤维细胞细胞系(Rat2)首先确定优惠网站的基因组整合。基于这些优惠网站,pcr方法被开发来形容C31-mediated集成事件后视网膜色素上皮细胞直接注入和后续在活的有机体内电穿孔(70年]。从这个方法,三个网站染色体12杆子有着1 q41, 2 q26被确定为优先目标,每个显示水平有限的序列同源性的C31attP网站。我们的结果证实发现优惠C31目标存在于1 q41和2 q26和扩展这个观察发现了3个新的目标代表更高频率的整合染色体17 q12.1事件,9的时候,Xq35。可能这些基因组热点PhiC31集成中确定鼠MAPC独特由于染色质的性质在这些未分化的细胞。

5。结论

我们在这里报告一个相对高效的病毒性修改MAPC使用某人转座子和PhiC31噬菌体整合酶,在某人可以用来实现更高的基因表达和PhiC31减少集成网站但表达水平降低。虽然两个系统提供另一种病毒的基因转移方法到成人多能祖细胞以及其他类型的干细胞,仍然需要比较研究旨在描述维护分化后的基因表达。

确认

作者感谢共济会癌症中心细胞遗传学核心设施明尼苏达大学进行细胞遗传学分析。这项工作是Fanconi贫血研究基金会赠款支持格兰特(美国Lakshmipathy),淋巴瘤和白血病社会翻译格兰特(美国Lakshmipathy),阿诺德和梅布尔贝克曼基金会(r . s . McIvor),美国培训批准号T32 GM08347,明尼苏达大学博士论文奖学金(a·威尔伯)。答:威尔伯和f·蒙托亚的贡献同样这项工作。

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