SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 717069年 10.4061 / 2011/717069 717069年 研究文章 病毒性集成效率和稳定的基因表达有多种能力的成年祖细胞 威尔伯 安德鲁 1、2、3 Ulloa蒙托亚 费尔南多 4 锤 路加福音 4 Moriarity Branden年代。 1、2 吉尔茨 Aron M。 1、2、5 Largaespada 大卫。 1、2 Verfaillie 凯瑟琳·M。 4、6 McIvor r·斯科特 1、2 Lakshmipathy 乌玛 4、7 卡特 马克·G。 1 基因组工程中心 基因治疗程序 明尼阿波利斯明尼苏达大学人类遗传学研究所 MN 55455 美国 2 部门的遗传学 细胞生物学和发展,明尼苏达大学,明尼阿波利斯,MN 55455 美国 3 美国医学微生物学 免疫学和细胞生物学和西蒙斯癌症研究所 南伊利诺伊大学医学院 斯普林菲尔德 伊尔62702 美国 siumed.edu 4 医学系的 干细胞研究所 明尼阿波利斯明尼苏达大学 MN 55455 美国 umn.edu 5 生理学系 人类分子遗传学中心 威斯康辛医学院 密尔沃基 WI 53226 美国 mcw.edu 6 不同学科间的干细胞研究所Katholieke鲁汶大学,鲁汶 比利时 kuleuven.be 7 生活的技术 5781年范-艾伦 卡尔斯巴德 CA 92008 美国 lifetechnologies.com 2011年 2 10 2011年 2011年 14 01 2011年 01 06 2011年 15 06 2011年 2011年 版权©2011年安德鲁·威尔伯等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

病毒性集成系统,PhiC31噬菌体整合酶( ϕ C31), 睡美人转座酶(某人),提供了一种有效的方法 体外基因传递到细胞。在这里,我们使用一个plasmid-encoding GFP和新霉素磷酸转移酶以及识别序列 ϕ C31和某人集成系统有效地证明两个系统介导的集成在人工培养的成纤维细胞和鼠多功能成年祖细胞(rMAPC)。印迹分析G418-resistant rMAPC克隆显示2倍数量的SB-mediated插入每个克隆相比 ϕ C31。序列的识别染色体结网站表示随机资料SB-mediated要素和更受限制的配置文件 ϕ C31要素。转基因rMAPC生成与系统维护能力分化成肝和GFP表达内皮虽然明显衰减。我们得出结论,某人和 ϕ C31是有效的MAPC病毒性基因工程集成系统干细胞生物学的基本研究。

 1。介绍

干细胞有能力长期自我更新文化,可以诱导多种细胞类型。这些特征提供了一个独特的遗传和发育研究资源或治疗中使用细胞和基因治疗的发展。多功能成年祖细胞(MAPC)代表一个类的干细胞来源于骨髓(BM)和其他成年哺乳动物的组织文化可以扩展( 1- - - - - - 3生成多种细胞类型 在体外和 在活的有机体内( 4- - - - - - 8]。移植的一些研究已经表明,人类MAPCs有利于功能恢复后血管缺血可能通过营养效应( 9- - - - - - 12和拥有contact-independent免疫抑制潜在 13, 14]。这些属性表明MAPCs可能是一个有效的潜在来源用于免疫调节和治疗缺血性疾病。进一步扩展其使用的单基因疾病,用于细胞筛选模型的建立需要工程师MAPC方法引入遗传元素定义的。

病毒性dna介导基因转移一直探索的新基因表达在不同的细胞类型 在体外和 在活的有机体内。然而,裸DNA载体的有效性往往限制无法提供持续的基因表达。稳定整合plasmid-encoded序列是低效的,因为它依赖于随机双链break-mediated重组。解决这个问题的方法之一是使用病毒性载体结合的重组酶的能力将遗传物质整合到细胞染色体。

睡美人(某人)转座酶和PhiC31 ( ϕ C31)整合酶plasmid-based已经证明调解稳定系统在哺乳动物细胞基因转移和表达。某人的一员 Tc1 /海员——家庭的DNA转座子,发现不活跃的残余在不同基因组在所有主要的王国除了细菌和调解基因转移的“剪切和粘贴”机制( 15)(图 1)。某人转座子系统是由一个进化的“修复” Tc1式的基因组序列中发现salmonid鱼( 16]。催化转座酶的自治元素由两侧末端反向重复(也是)包含两个直接重复(博士),这是转座酶的结合位点和换位的必要条件 16, 17]。基因转移应用程序,转座酶分离DNA转座子结束,取而代之的是任何货物。转座酶可以提供相同( 独联体)或单独的( 反式)从一个编码转座子或质粒 在体外信使rna转录( 18]。当表示,转座子的转座酶首次将捐赠的质粒和正是将这种基因元素插入脊椎动物染色体TA二核苷酸。与随机重组,插入由换位发生在不改变侧翼染色体序列。某人转座子系统已被用于稳定的多个基因改造啮齿动物和人类细胞系( 16, 17, 19和主要包括小鼠肝细胞 20.- - - - - - 25),人类皮肤细胞( 26),小鼠肺( 27- - - - - - 29日),和人类外周血t细胞( 30.]以及胚胎干细胞(ES)细胞从老鼠 31日, 32)和人( 33, 34]。小鼠MAPC修改使用表达式的某人转座子工程双记者编码DsRed2和萤火虫荧光素酶被用来研究MAPC通过的导航模式 在活的有机体内生物荧光成像后移植到免疫缺陷小鼠( 35]。此外,最近的研究证明有用的某人转座子系统人类CD34基因改造+从脐带血造血祖细胞分离 36, 37]。

原理图的内部控制由pKT2 /唠叨向量和集成产品 睡美人(某人)转座酶和噬菌体PhiC31 ( ϕ C31)整合酶。(一)整合向量包括(i) ϕ C31整合酶识别网站( attB);(2)eF1 α或巨细胞病毒(公关)监管GFP表达单元;(3)新霉素抗性基因(Neo)由PGK启动子转录监管;(iv)在T2侧面转座酶结合位点(红外/ DRs;盒双三角形)隔开;(v) colE1细菌复制和卡那霉素抗性基因的起源;(vi),聚腺苷酸化信号从兔子β球蛋白基因。(b)某人transposase-mediated集成(左):某人转座酶首次将转座子序列在红外/博士转座酶结合位点和精确地将它们插入TA-dinucleotide目标细胞染色体,随后复制。 ϕ C31 integrase-mediated集成(右):在一个外源基因序列 attB含有质粒在“伪——集成到哺乳动物的基因组 attP”网站,有部分同源染色体序列野生型噬菌体 attP序列。

的 ϕ C31整合酶是一种丝氨酸重组酶家族的成员中发现 链霉菌属( 38]。在自然条件下,双组分 ϕ C31系统介导单向复合事件之间 attP噬菌体基因组和 attB网站的 链霉菌属染色体。应用程序在哺乳动物细胞中,基因序列的 attB含有质粒插入细胞染色体在野生型网站有部分同源性噬菌体 attP(“伪-序列 attP“网站)当codelivered噬菌体整合酶酶的来源( 39, 40)(图 1)。PhiC31-mediated集成的频率大约是10 - 100倍高的可逆相比可(Cre和隔爆)这两个要求目标识别preinserted到基因组序列( 41]。的效用 ϕ C31调解制度已经证明了稳定的基因表达各种培养的哺乳动物细胞系( 42),在主细胞,包括老鼠肝脏( 43, 44),人类皮肤细胞( 45),和肌源性干细胞 46)以及特有的基因插入在鼠标 47)和人类胚胎干细胞( 48]。

这里,我们直接测试这两个病毒性载体系统集成能力协调稳定的基因转移到原始的成体干细胞。一个内部控制,双官能团的质粒是利用codeliver识别序列 ϕ C31和某人集成系统。我们调查的频率基因插入,基因表达的强度,影响基因修饰的干细胞MAPC的潜力。这些结果提供了一个评估这些病毒性集成系统的相对有效性的目的 体外基因转移和手段为病毒性生成集成工程平台交付和表达的转基因干细胞。

 2。材料和方法 2.1。质粒构建

整合向量(pKT2 /唠叨)构造使用T2末端反向重复序列侧翼的货物( 49]。建设pKT2 /唠叨,新霉素磷酸转移酶(Neo) cDNA被PCR获得使用pT / Neo ( 50)作为模板与引物Neo-F (5′gcc ACC ATG ATT棉酚CAA手枪GGA TTG颈- 3′)和Neo-R(5′公司治理文化柠檬酸棉酚棉酚CTC GTC亚美大陆煤层气有限公司AAG-3′),随后克隆到pCR2.1-TOPO(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)pTOPO-Neo形式。一个 生态国际扶轮片段包含放大Neo序列插入到polylinker PGK启动子和兔子 β球蛋白聚腺苷酸化的信号pKT2 / PGK形成pKT2 / PGK-Neo。的 丙氨酸B序列和EF1 α监管GFP编码序列是由引入307 - bp 生态R1片段包含 ϕ C31 丙氨酸从pTA - B网站 丙氨酸B ( 39米歇尔•卡洛博士),请提供的斯坦福大学)到相同的站点在质粒pVITRO-GFP (Invivogen,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。一个 欣dIII - Xho我片段包含 attB序列,EF1 α启动子、绿色荧光蛋白编码序列和SV40聚腺苷酸化信号随后PGK启动子的分离和克隆上游pKT2 / PGK-Neo之间 欣dIII和 萨尔我。

荧光素酶(pCMV-Luc)和SB10转座酶(pCMV-SB)表达向量之前描述( 50, 51]。 ϕ C31整合酶被CMV启动子的转录控制隔离 新人道我- - - - - - Spe我从pTOPO-Int片段包含整合酶编码序列(请提供的米歇尔·卡洛博士,斯坦福大学)和克隆它的荧光素酶pCMV-Luc之间 新人道我和 Xbai .质粒DNA制备使用Endofree马克西准备工具包(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)。

 2.2。细胞培养和基因转移

人纤维肉瘤HT1080细胞保持完整的生长介质组成的杜尔贝科的修改鹰中补充10%胎牛血清和1% antimycotic-antibiotic(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国),和孵化37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司2。转染的前一天,4 - 5×105细胞被播种到6厘米组织文化板块。细胞cotransfected pKT2 /唠叨(500 ng) + pCMV-Luc pCMV-SB或pCMV-Int(150、500、或1500 ng)使用SuperFect试剂(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)在最后一卷1毫升完成前三个小时生长介质改变介质。稳定的基因转移,收集细胞转染两天后,与台盼蓝染色,计数。可行的细胞(30000)被镀成100毫米菜包含完整的生长介质与850年补充 μg / mL G418(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国)。经过14天的选择、细胞被固定和染色以70%甲醇溶液含有1%结晶紫。

鼠MAPC (rMAPC)保持在纤连蛋白涂层烧瓶或菜肴使用先前描述的条件( 52]。转染的日子,rMAPC释放与胰蛋白酶盘子,用PBS洗净,0.1到0.5×106可行的细胞(台盼蓝-)resuspended nucleofection溶液中V(美国Amaxa,马里兰州)pKT2 /唠叨(5 μg)和等量的要么pCMV-Luc, pCMV-SB,或pCMV-Int,转移到提供的试管,electroporated (Amaxa;设置a - 23)如前所述 52, 53]。这些细胞被立即resuspended prewarmed增长中、去籽切成6厘米。稳定转染的细胞生长在中补充了G418 (400 μg / mL)转染后1天。

 2.3。流式细胞术

HT1080细胞或MAPC收获和呈现为流仪分析单细胞悬浮体。活细胞识别和封闭的排斥propidium碘,然后检测表达GFP FACSCalibur系统(Beckton-Dickinson)使用CellQuest分析软件(BD生物科学、海德堡、德国)。

 2.4。南部杂交分析

如前所述(执行南部印迹 44]。简单地说,10 μ克基因组DNA分离从几个G418-resistant MAPC克隆在一夜之间被消化 Bam嗨(SB-treated细胞)或 Spe我( ϕ C31-treated细胞),通过0.8%琼脂糖凝胶电泳,然后涂抹到nytran。835 - bp片段编码绿色荧光蛋白序列从积分分离向量(pKT2 /唠叨) 年龄我- - - - - - 欣dIII消化和32P放射性标记使用让它II随机引物标记工具包(美国加州拉霍亚,Stratagene)使用DNA探针。

 2.5。在体外分化和标记表达式

未分化rMAPC unmanipulated,已经通过随机集成在cotransfection与荧光素酶表达载体或由稳定的集成 ϕ C31integrase或某人转座酶RNA隔离和rt - pcr分析收获进行了如前所述[ 52]。rMAPC被分化成内皮细胞或肝细胞(描述 2, 6, 7]。内皮细胞分化,在基底生长培养基培养转基因MAPC补充2%或5%血清+血管内皮生长因子(VEGF, 10 ng / mL)。肝脏分化引起了添加2%血清肝细胞生长因子(HGF, 20 ng / mL)和纤维母细胞生长4 (FGF4 10 ng / mL)生长介质。在9和14天,收获细胞RNA隔离,和晚期rt - pcr或存在分析使用引物endothelium-specific记录血管内皮生长因子受体2 (Flk1)、血管内皮生长因子receptor-1 (Flt1)和endothelial-derived基因1(烤箱)或hepatocyte-specific标记肝细胞的核factor-3-beta (HNF3b)、甲胎蛋白(AFP),和转体基因(竞技场队伍),在glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)担任内部控制RNA加载和完整性。晚期rt - pcr的扩增子通过2%琼脂糖凝胶电泳分离。存在,目标基因表达规范化GAPDH和相对表达式计算的 2 - - - - - - Δ Δ CT 公式。引物序列描述在早期研究[ 6, 7]。所有实验都至少执行在每组重复的技术复制。

 2.6。细胞遗传学分析

转基因rMAPC清洗去除死细胞和resuspended 10毫升培养基。细胞被送往明尼苏达大学的细胞遗传学核心实验室进行分析。简单,细胞治疗与秋水仙胺3小时,然后根据标准的细胞遗传学协议收获。大约100中期被G-banding评估在400 - 425区间水平分辨率。

 2.7。复苏的集成网站

G418-resistant克隆cotransfection后被孤立的细胞类型pKT2 /唠叨+ pCMV-Luc pCMV-SB或pCMV-Int。基因组DNA (gDNA)使用Puregene DNA分离净化设备(Gentra系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。基因组的复苏方法用于识别PhiC31 integrase-mediated染色体插入。高分子量DNA (2 μ g)是消化 新人道我, Spe我和 Xba我(生成兼容5′末端;示意图如图 1)在100%乙醇沉淀和回收DNA的结扎稀释条件下(500 μ L)和4单位的T4 DNA连接酶(美国新英格兰生物学实验室,贝弗利,质量)。的结扎的DNA与100%异丙醇沉淀,颗粒状microcentrifugation和被resuspended 10前用70%乙醇洗净 μ L无菌H2o·2毫升的DNA electroporated进DH10B electrocompetent 大肠杆菌(美国威斯康星州麦迪逊Promega),使细菌细胞恢复SOC媒体通过孵化风潮在37°C / 200 rpm Luria电镀前1小时/ Bertania琼脂包含50 μ 克/毫升卡那霉素。质粒DNA孤立并使用引物测序,侧面 attB网站(如图 1 (b)): attB- f(5′标签GGC棉酚GG亚美大陆煤层气有限公司GG TGG-3′) attB- r (5′ggc TTC GAG ACC GTG ACC TA-3′)。SB-mediated集成事件,linker-mediated PCR技术被用来恢复transposon-chromosome结序列描述( 54)和示意图如图表示 1。基因组DNA (2 μ g)是消化 论坛我和结扎链接器。主要进行PCR引物5′gta ATA CGA CTC ATA GGG C - 3′, 5′玻纤棉酚TTT太极拳亚美大陆煤层气有限公司CTG TTT AAA GGC ACA GTC AAC-3′在下列条件:94°C 2分钟,然后25 94°C的周期为15秒,60°C 30秒和72°C 90秒。PCR产品稀释和嵌套PCR是在相同条件下使用引物5′gg GCT 20亚美大陆煤层气有限公司总部GGA颈- 3′,5′广汽TTG TGT猫GCA CAA AGT AGA TGT CC-3′。嵌套的产品反应通过2%琼脂糖凝胶电泳分离。特定的产品被切除,纯化使用Qiaquick凝胶萃取装备(美国加州试剂盒,瓦伦西亚),和克隆到pGEM-T向量(美国威斯康星州麦迪逊Promega)使用ElectroMax DH10B(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)转换。所有恢复集成事件在先进的基因测序分析中心明尼苏达大学并受BlastN分析对使用运用老鼠基因组数据库。

 3所示。结果 3.1。人工培养的成纤维细胞基因转移和稳定表达

某人, ϕ C31可都需要自己的独特的识别序列和催化组件来调解基因序列插入染色体。相比我们直接集成的有效性和长期使用单一双组分质粒表达,是内部控制整合序列(图 1(一))。的模式整合到宿主基因组由某人和催化 ϕ C31图表示 1 (b)。

功能测试内部控制向量(pKT2 /唠叨)cotransfected每个重组酶时,我们进行了克隆形成实验在培养人类男性纤维肉瘤HT1080细胞。该细胞系的基础上选择一个相对正常核型细胞遗传学分析(46,XY 5 p + 11 +) ( 55]。的影响的剂量codelivered recombinase-encoding稳定的基因转移和表达质粒是由G418-resistant集落形成和GFP荧光。pKT2 /唠叨(500 ng)是cotransfected一式三份,150,500,或1500 ng CMV-regulated荧光素酶(pCMV-Luc)转座酶(pCMV-SB),或整合酶(pCMV-Int)表达质粒(图 2(a))。流仪结果两天后GFP的表达了几乎相当于转染效率(20% - -25%的细胞GFP阳性;数据未显示)。类似于以前的研究( 20., 50, 56),我们的数据显示,经常观察到的抑制作用随着剂量的transposase-encoding质粒。的最低剂量pCMV-SB10 (150 ng)产生最大的增加(20倍大于没有转座酶控制)G418-resistant集落形成,而产生的最高剂量(1500 ng)只有5倍比没有转座酶控制殖民地(图 2(b))。为 ϕ C31整合酶,增加的浓度pCMV-Int改善G418-resistant集落形成(从3 - 7倍)相比没有整合酶控制pKT2 /唠叨(图 2(b))。

稳定表达由 某人转座酶和 ϕ C31integrase在人工培养的成纤维细胞。(一)原理图质粒cotransfected HT1080细胞克隆形成试验。将向量(pKT2 /唠叨)在图描述 1。Recombinase-encoding质粒由巨细胞病毒即早期启动子转录监管(CMV)。萤火虫荧光素酶编码表达载体(Luc)作为控制随机重组而产生的群体形成稳定的基因转移由某人转座酶(某人)或 ϕ C31整合酶(Int)。(b)克隆形成试验集成效率。HT1080细胞(4 - 5×105在一式三份)cotransfected pKT2 /唠叨(500 ng)和150 ng, 500 ng,或1500 ng的卢克,某人,或Int节中描述编码表达质粒 2。每3×10 G418-resistant殖民地的数量4镀细胞显示为每个组( n = 3 )。值报告为±SE。(c)在转基因HT1080细胞GFP的表达。流式细胞仪图所示的例子为unmanipulated HT1080细胞(左面板;GFP -)或扩大G418-resistant克隆(右面板;GFP阳性)。(d) GFP-positive细胞百分比取决于流仪分析10个独立G418-resistant从HT1080细胞克隆扩大cotransfected pKT2 /唠叨和500 ng(开环)或1500 ng(实心圆)的卢克,某人,或Int表达式向量。为每个条件GFP-positive细胞的百分比是用实线表示。

十G418-resistant克隆生成的cotransfection 500 ng或1500 ng某人转座酶或 ϕ C31整合酶在G418-containing媒介独立扩展一个额外的4周上游的描述表达GFP记者通过流式细胞术(数字 2(c)和 2(d))。三耐药克隆生成的随机重组(+ pCMV-Luc)显示GFP的表达(> 60%),但绝大多数未能表达绿色荧光蛋白(GFP阳性6/10 < 10%)。相比之下,GFP表达被某人保持所有克隆呈现耐药——或PhiC31-mediated集成但与增加细胞转染效率500 ng和1500 ng的重组酶。这些结果表明,单一双官能构造适当的重组酶的存在可以调解整合到宿主基因组造成持久的转基因表达。

 3.2。病毒性MAPC集成效率和稳定的基因表达

骨骨髓来源干细胞自我更新和增殖能力的文化是重要的生物工具为研究细胞和分化命运。确定集成效率由某人转座酶(某人)和 ϕ C31整合酶(Int)成体干细胞,我们评估稳定基因转移在MAPC源自新生大鼠的骨髓(产后2 - 5天)。Nucleofection作为基因转移的方法是基于以前的研究证明这些细胞基因转移效率和低毒性( 52, 53]。

整合向量pKT2 /唠叨codelivered与重组酶的来源1:1质量比(剂量证明有效地渲染HT1080细胞抵抗G418筛选)为未分化MAPC使用Amaxa Nucleofector技术(部分中描述 2。2),转染效率从15%到20%不等的流仪分析GFP阳性细胞24小时后(数据没有显示)。经过7到10天的文化,增长我们发现G418-resistance是某人在背景增加了30倍和10倍Int MAPC允许时形成不同的殖民地(图 3(一个))或联合耐药克隆亚文化时保持细胞密度在100 - 500细胞/厘米2(图 3 (b))。这些克隆扩张进一步分析包括基因整合位点(图的决心 3 (c))。

病毒性MAPC集成效率。Nucleofected rMAPC镀和中补充了G418 (400 μ g / mL)一天后。(一)克隆形成试验。后10 - 12天的增长在选择性条件下,细胞被固定和染色的频率来确定G418-resistant集落形成。G418-resistant殖民地的数量( n = 3 )显示了每组±道。(b)细胞收获到悬架和活细胞数量由台盼蓝排斥在指定的天,细胞的总数文化报道意味着±SE。(c)基因组DNA的孤立个体克隆与某人获得和Int受到限制性内切酶消化、质粒序列救援和恢复片段进行测序确定基因的整合。

 3.3。转基因MAPC保持分化的能力

基因工程的核型的影响MAPC在细胞遗传学水平评估G418-resistant汇集克隆,维持在100 - 500细胞的密度/厘米2。大多数的利差(> 80%)与正常二倍体核型unmanipulated鼠细胞以及细胞经历了随机整合在cotransfection与荧光素酶表达载体或由稳定的集成 ϕ C31integrase或某人转座酶(图 4(一))。

MAPC维持干细胞的性格和能力区分基因工程。(一)集中G418-resistant细胞核型分析;有丝分裂传播包含的数量的染色体表示横坐标表示。没有非整倍体和二倍体细胞表明你没有总值核型异常或异常细胞循环分析细胞的活动。(b) MAPCs小纺锤状细胞培养在非常低的密度。形态变化后分化成肝和内皮节中描述了两个星期 2显示细胞之间的显著差异LUC、Int或SB-treated细胞。(c)分化细胞的rt - pcr分析显示存在的甲胎蛋白(AFP)和转体基因(竞技场队伍)肝脏分化,和血管内皮生长因子receptor-1 (Flt1)和endothelial-derived基因1(烤箱)分化成内皮。大鼠肝脏被用作积极控制肝脏和血管内皮标记和未分化MAPC用作负控制。

MAPC具有分化成多种细胞类型的能力。细胞工程G418-resistance使用控制Luc某人转座酶或PhiC31整合酶在降低血清中维护文化(2 - 5%)和血管内皮生长因子(VEGF)的存在或纤维母细胞生长因子4 (FGF4) +肝细胞生长因子(HGF)。后14天的分化,不同形态的变化纺锤状MAPC被观察到。形态Luc之间无显著差异,某人,Int(图就非常明显 4 (b))。进一步量化和比较不同方法之间的分化水平,终点rt - pcr和存在分析RNA分离这些细胞阳性表达内皮(Flk-1、Flt1 Eg1)或肝细胞(HNF3b,法新社和竞技场队伍)特定的标记(图 4 (c)和表 1)。这些结果说明利用某人或MAPC转基因 ϕ C31维持干细胞的性格和能力在诱导分化成多种细胞谱系。

qRTPCR分化rMAPC分析。和肝脏内皮标记Flk1 Flt1, Eg1标记HNF3b法新社,测量和Ct值归一化GAPDH竞技场队伍水平来确定 Δ Ct。成年大鼠肝脏作为积极的控制-控制和相应的未分化细胞。相对表达式是由决定 Δ Ct值和比较表达水平的积极控制样本。

FIk1 FIt1 Eg1
Δ Ct SD Rel实验 Δ Ct SD Rel实验 Δ Ct SD Rel实验
MAPC 20.13 4.95 0.00006 15.23 11.81 0.00071 4.46 0.7 0.23982
卢克 8.34 0.35 0.22298 2.42 0.69 5.09824 1.79 0.69 1.52626
Int 10.13 0.15 0.0647 2.61 0.34 4.46915 2.28 0.33 1.08673
某人 8.84 0.63 0.15822 2.46 0.06 4.95883 1。8 0.13 1.51572
成人rLiver 6.18 1.23 1 4.77 0.45 1 2。4 0.1 1
HNF3b 法新社 竞技场队伍
Δ Ct SD Rel实验 Δ Ct SD Rel实验 Δ Ct SD Rel实验
MAPC 3.27 0.21 1.38992 22.03 0.5 0 13.34 0.57 0
卢克 2。6 0.16 2.21914 16.42 0.32 0.0002 13.22 0.25 0
Int 2.51 0.14 2.35381 10.99 6.1 0.00867 3.95 1.96 0.0003
某人 1.78 0.35 3.90413 6.43 0.26 0.20448 1.95 0.2 0.0012
成人rLiver 3.75 0.22 1 4.14 0.15 1 neg7.76 0.09 1

核factor-3-beta HNF3b:肝细胞;法新社:甲胎蛋白;竞技场队伍:转体基因肝脏分化,Flk1:血管内皮生长因子受体2;Flt1:血管内皮生长因子receptor-1;烤箱endothelial-derived分化成内皮基因1。总RNA分离成年大鼠肝组织(rLiver)用作肝脏和积极控制内皮标记和未分化MAPC (MAPC)作为消极的控制。

 3.4。在MAPC基因表达强度

GFP基因表达强度决定的记者。24耐药克隆被随机孤立的某人和 ϕ C31扩大在G418-containing中额外增加3 - 4周。GFP表达的水平为每个独立的克隆,流式细胞术测定(图 5(一个))。尽管所有克隆人的G418抗性,GFP大多数克隆强度很低,只有很少比例的细胞表现出表达以上背景。克隆被分成三类根据百分比(%)的细胞GFP表达高于背景:低GFP≤5%+;中级:10 - 20% GFP+;GFP和高≥20%+。使用这些标准,我们发现大多数G418-resistant克隆中含有较低或中间的百分比GFP-expressing细胞,包括23/24克隆生成的随机整合,PhiC31整合酶,23/24和18/24某人转座酶,只有1的SB-mediated克隆表现出更高水平的GFP的表达。

在MAPC基因表达的稳定性。(a) GFP阳性细胞百分比取决于流仪结果24个独立的G418-resistant克隆扩大从MAPC cotransfected pKT2 /唠叨和卢克,某人,或Int表达式向量。每个条件意味着GFP +细胞百分比由黑条表示。(b)某人的杂交分析和南部 ϕ C31-mediated集成事件。6709个基点的顶部显示了一个示意图表示环形质粒nucleofected成鼠MAPC和绿色荧光蛋白探针的位置。看到的传奇人物 1为解释序列元素中包含向量。 Spe我和 Bam嗨限制性位点被用于消化高分子量从每个G418-resistant克隆基因组DNA分离。的 Spe我的网站位于2.4 kb的断点 attB网站。的 Bam嗨站点位于3.5 kb的红外/博士。下面的图显示了基因组DNA的杂交图像消化 Spe我( ϕ C31)和 Bam嗨(某人)与绿色荧光蛋白探针杂交。克隆号码是显示在顶部,沿两侧和标记位置指示。(c)流式细胞术代表稳定G418-resistant克隆展示GFP表达HT1080人类成纤维细胞和鼠多功能成年祖细胞(rMAPCs)集成向量(左面板),整合向量加上 ϕ C31整合酶(中间面板)和集成向量加上某人转座酶(右面板)模拟相比,转染细胞的类型(黑)。(d)流式细胞仪分析个体克隆也测量和平均% GFP +细胞决定。条形图显示的平均表达GFP % HT12080(黑暗酒吧)和rMAPC(光棒)。误差棒表示标准偏差。

确定每个重组酶的影响要素拷贝数,我们研究了平均每个MAPC克隆的要素数量印迹分析。基因组DNA分离随机选择10的24 G418-resistant MAPC克隆与酶切消化后在整合向量序列,生成GFP-hybridizing大小不同的片段,每个要素和提供一个评估的数量稳定的转座酶或插入由某人 ϕ C31整合酶(图 5 (b))。要素的数量在SB-mediated稳定克隆6±3,与一个G418-resistant克隆(7号)显示至少有12个独立的要素。这个值高出三倍比先前描述的SB10-mediated插入人工培养的成纤维细胞(1 - 2转座子要素/克隆)( 50, 56, 57]。有趣的是,每个克隆人类成纤维细胞1 - 2基因要素表现出稳定的基因表达,而MAPC以增加数量的要素显示弱的转基因表达。有更少的要素/克隆的情况 ϕ C31 integrase-mediated基因转移(3±1),可能造成这个向量的site-preferred角色系统。

MAPC克隆的有趣的是,转基因表达显著降低相比,克隆获得相同的构造在HT1080(图 5 (c))。分析个体克隆获得的平均GFP +细胞HT1080 rMAPC进一步证实这个观察(图 5 (d))。这些结果表明低拷贝数集成,表观遗传的抑制promoter-transgene元素( 58),或集成在一个基因组的网站不支持活跃转录。

 3.5。分子分析集成网站孤立MAPC克隆

几个要素进一步特征序列层面上使用linker-mediated PCR(某人)或质粒拯救( ϕ C31)技术(见部分 2。7)。某人,我们恢复30独特的转座子:染色体连接序列映射到独立的染色体(图17日立场 6和表 2)。我们也获得了27截然不同 ϕ C31要素分布在染色体(图11 6和表 3)。MAPC克隆生成使用某人表现出相对随机分布的集成 ϕ C31对待MAPC透露特定序列在染色体X的浓缩,9岁和17(表 2和 4)。这些网站在多个独立的克隆,我们决定测试三个克隆证明高、中或低的GFP表达对要素数量和基因组位置(表 3)。这一分析显示,每个克隆的要素数量和基因组的位置要素与GFP表达水平有关。绿色荧光蛋白的克隆表现出更高的比例+细胞有4个要素,而克隆具有中等或低水平的表达特征2和3要素,分别。此外,克隆证明增加GFP的表达(嗨)包含插入染色体X和17类似克隆证明减少GFP表达(Lo),而集成9号染色体上没有检测到。同样,另外分析了克隆超过5要素/细胞没有表现出高水平的GFP的表达。这些数据表明,要素或要素单独的基因位置可能不会决定坚持转基因的表达,但这些以及其他的组合表观遗传因素可能起着关键的决定作用。

ϕ C31和某人染色体连接序列从老鼠MAPC中恢复过来。大约每个耐药克隆获得PhiC31整合酶和某人转座酶是随机确定的基因组整合。大多数克隆了多个集成事件,与印迹结果一致。确切的基因位点的测定比较染色体结与老鼠的基因组序列。

ϕ C31整合酶
克隆 染色体的乐队 位置
1 4 q42 158791838
9的时候 51217205
2 2 q44 236122145
9的时候 51217122
15 q11 58645720
17 q12.1 57593447
3 2 q26 141365031
3温度系数 51055488
7问题 32562140
15日12 66145915
20日12 4538590
4 2 q34s 199022700
7问题 32562264
9的时候 51217198
20日12 5244926
5 4 q41 139277121
6日12 11098254
9的时候 51217202
Xq12 18543448
6 17 q12.1 57594096
Xq35 134407720
7 1 q41 193493175
17 q12.1 57593343
Xq35 134407720
8 1 q41 193493175
9的时候 51217207
9 17 q12.1 57593353
某人Transposase
克隆 染色体的乐队 位置
1 2 q33 171779390
13 q11 32001139
13 q11 39927168
20日12 44445336
2 16好 13906741
3 1赛 34991484
7问 94455924
9 q36 97344920
4 6问 128228570
8抓起 59559434
15抓起 104110283
16 q12.1 57613884
5 5 q35 128927150
11 q23处 77290939
6 3 q35 102093005
4的时候 59940513
4 q23处 71432455
5 q35 134761715
16 q12.2 60379119
7 6个问题 23449543
17日的事情 49437069
8 7日12 16815756
8抓起 77171774
9的事情 7186249
9 9 q36 90439317
12 p12 2500679
10 2 q11 6206693
5温度系数 48519577
7问题 28888887
10 q26 75143457

绿色荧光蛋白表达的相关性和集成网站 ϕ C31整合酶。三个克隆选择基于GFP的表达水平(高、中、低)。质粒救援进行了确定表达水平与要素数量或基因组的位置。

克隆 %绿色荧光蛋白 染色体的乐队 位置
罗 < 5%< 5%< 5% 5 1217 q12.1Xq35 1803556057593963134407720
地中海 10 - 20%10 - 20% 1 q4117 q12.1 19349317557594096
嗨 > 20%> 20%> 20%> 20% 8问10问17 q12.1Xq35 937751928725934057594096134407720

热点的 ϕ 在老鼠的基因组MAPC C31-mediated集成。九个耐药克隆和一个额外的三个克隆选择GFP表达进行了分析的基础上,对要素数量和基因组的位置。所有的集成网站发现,17号染色体上的位置(17 q12.1)被发现有针对性的最高频率的12个克隆(7)其次是染色体位置9的时候(5个中的12个克隆)和Xq35 12个克隆(4)。确切基因要素的位置和最近的基因整合的网站列出每个染色体热点。

铬。 克隆 染色体的乐队 位置 最近的基因
17 2 17 q12.1 57593447
6 57594096
7 57593343
9 57593353 ATI4B59334046 - 59457079
罗 57593962
地中海 57594096
嗨 57594096
9 1 9的时候 51217205
2 51217122
4 51217198 SDPR47373044 - 47385061
5 51217202
8 51217207
X 6 Xq35 134407720
7 134407720 Xpnpep2134474700 -134501921
罗 134407720
嗨 134407720

染色体分布的某人 ϕ C31要素。基因组的要素与旁侧序列恢复MAPC通过linker-mediated PCR(某人;灰色酒吧)或质粒拯救( ϕ C31;黑条);显示的频率和分布相互独立事件。

 4所示。讨论

在这项研究中,我们使用了一个内部控制的双功能提供磁带编码绿色荧光蛋白表达质粒或新霉素磷酸转移酶的两个组件 ϕ C31和某人集成系统为人工培养的成纤维细胞和鼠多功能成年祖细胞(rMAPC)。两个系统通过recombinase-mediated整合有效介导产生稳定的基因转移外源序列。转基因rMAPC维持其干细胞特性,证明了能够分化成内皮细胞和肝组织的特定的细胞因子。沉默的观察GFP每个系统当G418-resistant rMAPC扩大在文化。印迹分析表明,要素的数量在SB-transposed稳定克隆6±3而更少的独立要素被检测到 ϕ C31整合酶工程细胞系(3±1)。

病毒性,dna介导基因转移一直探讨的潜在基因疗法针对各种不同的细胞类型 在体外和 在活的有机体内。一个远程目标是测试病毒性载体系统集成能力协调稳定、dna介导基因转移在造血干细胞(HSC)。基因工程的HSC的能力来完成长期的重新造血系统曾被使用来完成集成病毒载体和报道使用某人转座子系统( 36, 37]。与HSC MAPC文化长期自我更新能力,可以与特定的细胞因子诱导分化形成多种细胞类型。这些特征提供了独一无二的资源用于测试:(i)病毒性基因转移在原始干细胞,(2)基因工程的影响在维持干细胞特性,(3)稳定的转基因表达分化后,和(iv)插入站点配置文件在一个基因组广泛,与潜在的功能筛选原始和分化细胞系统。

应用干细胞治疗遗传病的修正可能需要长期的新引入的治疗基因的表达,最有效地通过转基因的整合。然而,随着外源元素整合到染色体DNA的插入突变带来的不利影响。集成可能导致管制的肿瘤抑制基因的表达,致癌基因或细胞循环监管基因导致癌症( 59- - - - - - 63年]。因此,全基因组分析insertion-site偏好集成各种目标向量是在探索细胞和组织( 60, 61年, 64年, 65年]。

某人转座子在哺乳动物基因组呈现出一个相对随机集成模式( 66年- - - - - - 68年),不太可能融入转录基因或转录监管区域比其他集成向量如逆转录病毒和慢病毒( 66年, 67年, 69年]。有一个类似的基因转移效率, ϕ C31整合酶显示偏好一个看似有限数量的插入目标网站在哺乳动物的基因组,受益于“伪的顺序要求 attP”网站。事实上,一些分析 ϕ C31-mediated集成事件表明,优惠网站集成在老鼠和人类基因组存在符合最多30 - 40%部分野生型噬菌体序列同源性 attP目标( 20., 40, 42]。这些数据表明, ϕ C31 integrase-mediated DNA插入是一个相对site-preferred通过集成方法实现持久的基因表达。

病毒的共同限制或plasmid-based集成在未分化的细胞是基因沉默,发生在扩张或差异化的目标人群。这种淬火的表达可能引起的表观遗传的影响,如转录调控序列的甲基化或抑制转录因子结合通过染色质缩合和基因组改造。我们的研究结果表明,当某人转座酶实现多个集成/克隆, ϕ C31整合酶介导的平均2 - 4集成/克隆。这是比已报道了老鼠和人类细胞(平均1集成网站克隆 42, 43]),可能是由于使用的整合质粒的浓度或比例的整合质粒 ϕ C31整合酶。交替,老鼠细胞或干细胞如MAPC特别是可能有一个更开放的染色质结构,从而暴露出更多的“伪 attP由PhiC31整合酶”网站的目标。

唯一的其他研究报告成功使用PhiC31整合酶在大鼠细胞都使用了老鼠胚胎成纤维细胞细胞系(Rat2)首先确定优惠网站的基因组整合。基于这些优惠网站,pcr方法被开发来形容 ϕ C31-mediated集成事件后视网膜色素上皮细胞直接注入和后续 在活的有机体内电穿孔( 70年]。从这个方法,三个网站染色体12杆子有着1 q41, 2 q26被确定为优先目标,每个显示水平有限的序列同源性的 ϕ C31 attP网站。我们的结果证实发现优惠 ϕ C31目标存在于1 q41和2 q26和扩展这个观察发现了3个新的目标代表更高频率的整合染色体17 q12.1事件,9的时候,Xq35。可能这些基因组热点PhiC31集成中确定鼠MAPC独特由于染色质的性质在这些未分化的细胞。

 5。结论

我们在这里报告一个相对高效的病毒性修改MAPC使用某人转座子和PhiC31噬菌体整合酶,在某人可以用来实现更高的基因表达和PhiC31减少集成网站但表达水平降低。虽然两个系统提供另一种病毒的基因转移方法到成人多能祖细胞以及其他类型的干细胞,仍然需要比较研究旨在描述维护分化后的基因表达。

 确认

作者感谢共济会癌症中心细胞遗传学核心设施明尼苏达大学进行细胞遗传学分析。这项工作是Fanconi贫血研究基金会赠款支持格兰特(美国Lakshmipathy),淋巴瘤和白血病社会翻译格兰特(美国Lakshmipathy),阿诺德和梅布尔贝克曼基金会(r . s . McIvor),美国培训批准号T32 GM08347,明尼苏达大学博士论文奖学金(a·威尔伯)。答:威尔伯和f·蒙托亚的贡献同样这项工作。

 江 Y。 Jahagirdar b . N。 莱因哈特 r . L。 施瓦兹 r·E。 基恩 c, D。 Ortiz-Gonzalez x R。 雷耶斯 M。 Lenvik T。 隆德 T。 Blackstad M。 杜 J。 奥尔德里奇 年代。 Lisberg 一个。 低 w . C。 Lergaespada d . A。 Verfaillie c . M。 成人骨髓间充质干细胞的多能性来自 自然 2002年 418年 6893年 41 49 2 - s2.0 - 0037019337 10.1038 / nature00870 雷耶斯 M。 Verfaillie c . M。 描述的多功能成年祖细胞,间充质干细胞的族群 纽约科学院上 2001年 938年 231年 235年 2 - s2.0 - 0034937823 赵 l R。 段 w·M。 雷耶斯 M。 Verfaillie c . M。 低 w . C。 免疫组织化学鉴定多功能成年后从人类骨髓祖细胞移植到老鼠的大脑 大脑研究协议 2003年 11 1 38 45 2 - s2.0 - 0037356193 10.1016 / s1385 - 299 x (03) 00014 - x 江 Y。 亨德森 D。 Blackstad M。 陈 一个。 米勒 r F。 Verfaillie c . M。 Neuroectodermal从鼠标多功能成年祖细胞分化 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 2003年 One hundred. 1 11854年 11860年 2 - s2.0 - 0141817748 10.1073 / pnas.1834196100 基恩 c, D。 Ortiz-Gonzalez x R。 江 Y。 Largaespada d . A。 Verfaillie c . M。 低 w . C。 神经来源于多功能成人的骨祖细胞的分化和整合在单一细胞移植到小鼠胚胎囊胚阶段 细胞移植 2003年 12 3 201年 213年 2 - s2.0 - 0038363452 雷耶斯 M。 杜德克 一个。 Jahagirdar B。 Koodie l 标记 p . H。 Verfaillie c . M。 在人类产后骨髓来源的内皮祖细胞 《临床研究杂志》上 2002年 109年 3 337年 346年 2 - s2.0 - 0036171009 10.1172 / JCI200214327 施瓦兹 r·E。 雷耶斯 M。 Koodie l 江 Y。 Blackstad M。 隆德 T。 Lenvik T。 约翰逊 年代。 胡 w·S。 Verfaillie c . M。 多功能成人从骨髓祖细胞分化成功能性hepatocyte-like细胞 《临床研究杂志》上 2002年 109年 10 1291年 1302年 2 - s2.0 - 0036106054 10.1172 / JCI200215182 塞拉菲尼 M。 Dylla 美国J。 冲电气 M。 Heremans Y。 托拉尔 J。 江 Y。 巴克利 s M。 Pelacho B。 伯恩斯 t . C。 Frommer 年代。 罗西 d . J。 因此他们 D。 Panoskaltsis-Mortari 一个。 O ' shaughnessy m·J。 Nelson-Holte M。 细 g . C。 斯曼 i L。 耀变体 b R。 Verfaillie c . M。 通过多功能成年祖细胞造血重建:长期造血干细胞的前兆 实验医学杂志 2007年 204年 1 129年 139年 2 - s2.0 - 33846437812 10.1084 / jem.20061115 Aranguren x L。 麦丘 j . D。 亨德里克斯 B。 多功能成年祖细胞维持小鼠缺血性四肢的函数 《临床研究杂志》上 2008年 118年 2 505年 514年 2 - s2.0 - 38849199383 10.1172 / JCI31153 Pelacho B。 中村 Y。 张 J。 罗斯 J。 Heremans Y。 Nelson-Holte M。 Lemke B。 Hagenbrock J。 江 Y。 繁荣 F。 Luttun 一个。 Verfaillie c . M。 多功能成年祖细胞移植增加多血管,改善心肌梗死后左心室功能 组织工程和再生医学杂志》上 2007年 1 1 51 59 2 - s2.0 - 34548171601 10.1002 / term.7 托拉尔 J。 王 X。 Braunlin E。 McElmurry r·T。 中村 Y。 贝尔 年代。 夏 l 张 J。 胡 Q。 Panoskaltsis-Mortari 一个。 张 J。 耀变体 b R。 宿主的免疫反应是必不可少的成体干细胞在心肌缺血的有益作用 实验血液学 2007年 35 4 682年 690年 2 - s2.0 - 33947331495 10.1016 / j.exphem.2006.12.005 Dimomeletis 我。 Deindl E。 Zaruba M。 Groebner M。 学院 年代。 Laslo s M。 大卫 R。 Kostin 年代。 多伊奇 m·A。 阿斯曼 G。 Mueller-Hoecker J。 Feuring-Buske M。 弗朗茨 w·M。 评估人力MAPCs干细胞移植和心脏再生在SCID小鼠心肌梗死后 实验血液学 2010年 38 11 1105年 1114年 2 - s2.0 - 78650252427 10.1016 / j.exphem.2010.06.013 Kovacsovics-Bankowski M。 斯特里特 p R。 Mauch k。 弗雷 m·R。 Raber 一个。 霍夫 w·V。 院长 R。 Maziarz r·T。 临床规模扩大成人多能干细胞预防移植物抗宿主病 细胞免疫学 2009年 255年 1 - 2 55 60 2 - s2.0 - 59349085292 10.1016 / j.cellimm.2008.10.004 Highfill s . L。 凯利 r·M。 O ' shaughnessy m·J。 周 Q。 夏 l Panoskaltsis-Mortari 一个。 泰勒 p。 托拉尔 J。 耀变体 b R。 多功能成年祖细胞可以通过前列腺素E2合成和抑制移植物抗宿主病只有局部allopriming网站 血 2009年 114年 3 693年 701年 2 - s2.0 - 70149119503 10.1182 / - 2009 - 03 - 213850血 Plasterk r·h·A。 Izsvak Z。 Ivics Z。 居民外星人Tc1 /转位因子的水手总科 遗传学趋势 1999年 15 8 326年 332年 2 - s2.0 - 0033179759 10.1016 / s0168 - 9525 (99) 01777 - 1 Ivics Z。 哈科特 p . B。 Plasterk r·H。 Izsvak Z。 睡美人的分子重建Tc1-like从鱼,转座子及其在人类细胞中换位 细胞 1997年 91年 4 501年 510年 2 - s2.0 - 0030662074 Izsvak Z。 Ivics Z。 Plasterk r·H。 睡美人,宽为遗传trensformation脊椎动物宿主范围转座子向量 分子生物学杂志 2000年 302年 1 93年 102年 2 - s2.0 - 0034623009 10.1006 / jmbi.2000.4047 威尔伯 一个。 Frandsen j·L。 吉尔茨 j·L。 Largaespada d . A。 哈科特 p . B。 McIvor r S。 RNA的转座酶用来睡觉Beauty-mediated基因插入和表达在体细胞和组织 分子治疗 2006年 13 3 625年 630年 2 - s2.0 - 32944463921 10.1016 / j.ymthe.2005.10.014 匡威 答:D。 Belur l R。 戈里 j·L。 刘 G。 Amaya F。 Aguilar-Cordova E。 哈科特 p . B。 McIvor r S。 Counterselection和co-delivery转座子转座酶功能睡觉Beauty-mediated换位在培养的哺乳动物细胞 生物科学报告 2004年 24 6 577年 594年 2 - s2.0 - 24744461545 10.1007 / s10540 - 005 - 2793 - 9 Ehrhardt 一个。 徐 H。 黄 Z。 断 j . A。 凯 m·A。 直接比较两种病毒的基因治疗载体的体细胞集成: 在活的有机体内噬菌体整合酶的评价 φC31和睡美人转座酶 分子治疗 2005年 11 5 695年 706年 2 - s2.0 - 17644425657 10.1016 / j.ymthe.2005.01.010 米凯尔森 j·G。 纹身 s R。 默兹 l 黄 Z。 徐 H。 凯 m·A。 Helper-independent睡美人transposon-transposase向量有效的病毒的基因传递和持久的基因表达 在活的有机体内 分子治疗 2003年 8 4 654年 665年 2 - s2.0 - 0142213094 10.1016 / s1525 - 0016 (03) 00216 - 8 蒙提 E。 举行 p K。 诺尔 M。 Morcinek N。 Al-Dhalimy M。 Finegold M。 纹身 s R。 凯 m·A。 Grompe M。 在活的有机体内调整dna介导的小鼠酪氨酸血症类型我换位 分子治疗 2002年 6 6 759年 769年 2 - s2.0 - 0036932834 10.1006 / mthe.2002.0812 Ohlfest j . R。 Frandsen j·L。 弗里茨 年代。 Lobitz p D。 Perkinson s G。 克拉克 k·J。 Nelsestuen G。 关键 n S。 McIvor r S。 哈科特 p . B。 Largaespada d . A。 表型的校正和长期表达因素八世在嗜血鼠immunotolerization和病毒基因转移使用睡美人转座子系统 血 2005年 105年 7 2691年 2698年 2 - s2.0 - 20144386644 10.1182 / - 2004 - 09 - 3496血 分数 p R。 Belur l R。 Frandsen j·L。 Guerts j·L。 山口那津男 T。 Somia n V。 哈科特 p . B。 Largaespada d . A。 McIvor r S。 睡觉beauty-mediated换位和长期表达 在活的有机体内:使用LoxP / Cre重组酶系统来区分transposition-specific表达式 分子治疗 2006年 13 3 617年 624年 2 - s2.0 - 32944458256 10.1016 / j.ymthe.2005.10.015 纹身 s R。 默兹 l 赵 W。 Ivics Z。 Izsvak Z。 凯 m·A。 体细胞融合和长期的转基因表达在正常和嗜血老鼠使用DNA转座子系统 自然遗传学 2000年 25 1 35 41 2 - s2.0 - 0034103009 10.1038/75568 Ortiz-Urda 年代。 林 Q。 纹身 s R。 基恩 D。 凯 m·A。 Khavari p。 通过transposon-mediated可持续校正交界表皮松解大疱病毒基因转移 基因治疗 2003年 10 13 1099年 1104年 2 - s2.0 - 0037587235 10.1038 / sj.gt.3301978 Belur l R。 Frandsen j·L。 Dupuy称:"现在 a·J。 Ingbar d . H。 Largaespada d . A。 哈科特 p . B。 McIvor r S。 基因插入和长期表达在肺睡美人转座子介导的系统 分子治疗 2003年 8 3 501年 507年 2 - s2.0 - 0141744705 10.1016 / s1525 - 0016 (03) 00211 - 9 刘 l Mah C。 弗莱彻 b S。 持续FVIII表达式和表型修正血友病新生儿老鼠使用endothelial-targeted睡美人转座子 分子治疗 2006年 13 5 1006年 1015年 2 - s2.0 - 33645882508 10.1016 / j.ymthe.2005.11.021 刘 l Sanz 年代。 Heggestad 答:D。 Antharam V。 Notterpek l 弗莱彻 b S。 在肺内皮针对睡美人的转座子 分子治疗 2004年 10 1 97年 105年 2 - s2.0 - 3042712919 10.1016 / j.ymthe.2004.04.006 黄 X。 威尔伯 a . C。 保 l 盯上了 D。 托拉尔 J。 果园 p . J。 莱文 b . L。 6月 c . H。 McIvor r S。 耀变体 b R。 周 X。 稳定的基因转移和表达在人类主要由睡美人转座子系统T细胞 血 2006年 107年 2 483年 491年 2 - s2.0 - 30444432097 10.1182 / - 2005 - 05 - 2133血 罗 G。 Ivics Z。 Izsvak Z。 布拉德利 一个。 染色体换位Tc1 /水手喜欢元素的老鼠胚胎干细胞 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 1998年 95年 18 10769年 10773年 2 - s2.0 - 13144261694 10.1073 / pnas.95.18.10769 Yusa K。 武田 J。 崛江 K。 增强的睡美人换位CpG甲基化:异染色质的形成可能的作用 分子和细胞生物学 2004年 24 9 4004年 4018年 2 - s2.0 - 1942453798 10.1128 / mcb.24.9.4004 - 4018.2004 威尔伯 一个。 Linehan j·L。 田 X。 沃尔 p S。 莫里斯 j·K。 Belur l R。 McIvor r S。 考夫曼 d S。 高效和稳定的转基因表达在人类胚胎干细胞的使用transposon-mediated基因转移 干细胞 2007年 25 11 2919年 2927年 2 - s2.0 - 36248983231 10.1634 / stemcells.2007 - 0026 班 t . I。 Apati 一个。 Nemeth 一个。 应用“内涵”启动子识别心肌细胞分化人类胚胎干细胞后transposon-based基因传递 干细胞 2009年 27 5 1077年 1087年 2 - s2.0 - 66149170086 10.1002 / stem.45 托拉尔 J。 奥斯本 M。 贝尔 年代。 McElmurry R。 夏 l 谜题 M。 Panoskaltsis-Mortari 一个。 江 Y。 McIvor r S。 合作 c . H。 纹身 s R。 凯 m·A。 Verfaillie c . M。 耀变体 b R。 实时 在活的有机体内通过换位成像后的干细胞转基因技术 分子治疗 2005年 12 1 42 48 2 - s2.0 - 20844447232 10.1016 / j.ymthe.2005.02.023 雪 X。 黄 X。 Nodland s E。 伴侣 l 马 l Izsvak Z。 Ivics Z。 LeBien t·W。 McIvor r S。 瓦格纳 j·E。 周 X。 稳定的基因转移和表达绳血液CD34 +造血干细胞和祖细胞的活跃睡美人转座子系统 血 2009年 114年 7 1319年 1330年 2 - s2.0 - 70349320475 10.1182 / - 2009 - 03 - 210005血 伴侣 l Chuah m . k . L。 拴牢 E。 Jerchow B。 Manoj N。 Acosta-Sanchez 一个。 Grzela d . P。 施密特 一个。 贝克尔 K。 Matrai J。 马 l Samara-Kuko E。 Gysemans C。 Pryputniewicz D。 Miskey C。 弗莱彻 B。 Vandendriessche T。 Ivics Z。 Izsvak Z。 分子进化的小说活跃睡美人转座酶使健壮稳定在脊椎动物基因转移 自然遗传学 2009年 41 6 753年 761年 2 - s2.0 - 67349250885 10.1038 / ng.343 索普 h . M。 史密斯 M . c . M。 体外特定站点集成噬菌体的DNA重组酶的催化the-resolvase /蔗糖酶家族 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 1998年 95年 10 5505年 5510年 2 - s2.0 - 0032510752 Groth a . C。 集中政策 e . C。 Thyagarajan B。 卡洛 m P。 噬菌体整合酶指导有效的特定站点集成在人类细胞 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 2000年 97年 11 5995年 6000年 2 - s2.0 - 0034705105 10.1073 / pnas.090527097 Thyagarajan B。 集中政策 e . C。 霍利斯 r P。 金斯伯格 d S。 卡洛 m P。 特有的基因在哺乳动物细胞由噬菌体集成 φC31整合酶 分子和细胞生物学 2001年 21 12 3926年 3934年 2 - s2.0 - 0035008830 10.1128 / mcb.21.12.3926 - 3934.2001 Groth a . C。 卡洛 m P。 噬菌体整合:生物学和应用程序 分子生物学杂志 2004年 335年 3 667年 678年 2 - s2.0 - 1542397137 10.1016 / j.jmb.2003.09.082 Chalberg t·W。 Portlock j·L。 集中政策 e . C。 Thyagarajan B。 科比 p . J。 希尔曼 r·T。 Hoelters J。 卡洛 m P。 集成的特异性噬菌体 φC31整合酶在人类基因组中 分子生物学杂志 2006年 357年 1 28 48 2 - s2.0 - 33644767178 10.1016 / j.jmb.2005.11.098 举行 p K。 集中政策 e . C。 阿基拉 c·P。 Finegold M。 卡洛 m P。 Grompe M。 在活的有机体内修正的小鼠遗传酪氨酸血症I型 φC31 integrase-mediated基因传递 分子治疗 2005年 11 3 399年 408年 2 - s2.0 - 14044257947 10.1016 / j.ymthe.2004.11.001 集中政策 e . C。 霍利斯 r P。 Chalberg t·W。 默兹 l 凯 m·A。 卡洛 m P。 特有的基因组整合生产治疗老鼠IX因子水平 自然生物技术 2002年 20. 11 1124年 1128年 2 - s2.0 - 0036842502 10.1038 / nbt753 Ortiz-Urda 年代。 Thyagarajan B。 基恩 d·R。 林 Q。 卡洛 m P。 Khavari p。 φC31 integrase-mediated病毒基因修正交界表皮松解大疱 人类基因治疗 2003年 14 9 923年 928年 2 - s2.0 - 0038618975 10.1089 / 104303403765701204 Quenneville s P。 Chapdelaine P。 卢梭 J。 比尤利 J。 卡洛 n . J。 Skuk D。 米尔斯 P。 集中政策 e . C。 卡洛 m P。 加拿大 j . P。 Nucleofection的肌源性干细胞和成肌细胞 φC31整合酶:full-length-dystrophin融合基因的稳定表达人的成肌细胞 分子治疗 2004年 10 4 679年 687年 2 - s2.0 - 4644292834 10.1016 / j.ymthe.2004.05.034 Belteki G。 Gertsenstein M。 噢 d . W。 伊 一个。 特定场地盒与小鼠胚胎干细胞表达交换和生殖系传输 φC31整合酶 自然生物技术 2003年 21 3 321年 324年 2 - s2.0 - 0037337299 10.1038 / nbt787 刘 Y。 Thyagarajan B。 Lakshmipathy U。 雪 H。 代替 P。 丰特斯 一个。 麦克阿瑟 C . C。 Scheyhing K。 饶 m . S。 Chesnut j . D。 代平台的人类胚胎干细胞系,使有效的针对一个预先确定的基因的位置 干细胞与发展 2009年 18 10 1459年 1471年 2 - s2.0 - 71949108136 10.1089 / scd.2009.0047 崔 Z。 吉尔茨 a . M。 刘 G。 考夫曼 c, D。 哈科特 p . B。 结构分析的末端反向重复睡美人转座子 分子生物学杂志 2002年 318年 5 1221年 1235年 2 - s2.0 - 0036317929 10.1016 / s0022 - 2836 (02) 00237 - 1 吉尔茨 a . M。 杨 Y。 克拉克 k·J。 刘 G。 崔 Z。 Dupuy称:"现在 a·J。 贝尔 j·B。 Largaespada d . A。 哈科特 p . B。 人类细胞的基因转移到基因组睡美人转座子系统 分子治疗 2003年 8 1 108年 117年 2 - s2.0 - 0042700227 10.1016 / s1525 - 0016 (03) 00099 - 6 威尔伯 一个。 Frandsen j·L。 Wangensteen k·J。 埃克 s . C。 王 X。 McIvor r S。 动态系统交付后基因表达质粒DNA所决定 在活的有机体内生物荧光成像 人类基因治疗 2005年 16 11 1325年 1332年 2 - s2.0 - 27744574725 10.1089 / hum.2005.16.1325 Lakshmipathy U。 Pelacho B。 Sudo K。 Linehan j·L。 Coucouvanis E。 考夫曼 d S。 Verfaillie c . M。 高效的胚胎和成体干细胞转染 干细胞 2004年 22 4 531年 543年 2 - s2.0 - 3543001036 Lakshmipathy U。 锤 l Verfaillie C。 分手方法使转染病毒的基因转移方法多功能成年祖细胞(MAPC) 基因治疗和监管 2004年 2 4 301年 312年 2 - s2.0 - 21344473449 10.1163 / 1568558043967481 科利尔 l S。 卡尔森 c . M。 Ravimohan 年代。 Dupuy称:"现在 a·J。 Largaespada d . A。 癌症基因的发现在固体肿瘤使用transposon-based体细胞突变的老鼠 自然 2005年 436年 7048年 272年 276年 2 - s2.0 - 22444444402 10.1038 / nature03681 拉希德 年代。 纳尔逊•里斯 w·A。 托斯 e . M。 描述新派生人类肉瘤细胞系(HT 1080) 癌症 1974年 33 4 1027年 1033年 2 - s2.0 - 0016373845 鲍起静 J。 刘 l Heggestad 答:D。 Sanz 年代。 弗莱彻 b S。 极度活跃的睡美人转座子的转座酶突变体 分子治疗 2005年 12 6 1148年 1156年 2 - s2.0 - 28444479786 10.1016 / j.ymthe.2005.06.484 纹身 s R。 公园 J。 黄 Y。 米凯尔森 j·G。 凯 m·A。 突变分析睡美人转座酶的氨基端DNA结合域:临界残留在哺乳动物细胞DNA结合和多动症 分子和细胞生物学 2004年 24 20. 9239年 9247年 2 - s2.0 - 4744374701 10.1128 / mcb.24.20.9239 - 9247.2004 Emerman说 M。 > h . M。 逆转录病毒载体的基因启动子可以独立抑制的表观遗传机制 细胞 1984年 39 3,第2部分 459年 467年 2 - s2.0 - 0021709420 Hacein-Bey-Abina 年代。 冯•勒• C。 施密特 M。 麦科马克 m P。 Wulffraat N。 Leboulch P。 Lim 一个。 奥斯本 c·S。 Pawliuk R。 Morillon E。 索伦森 R。 福斯特 一个。 弗雷泽 P。 科恩 j . I。 德圣巴西 G。 亚历山大 我。 Wintergerst U。 Frebourg T。 Aurias 一个。 Stoppa-Lyonnet D。 和平 年代。 Radford-Weiss 我。 总值 F。 瓦伦西 F。 Delabesse E。 麦金太尔 E。 Sigaux F。 Soulier J。 莱瓦 l E。 Wissler M。 普林茨 C。 洛夫 t·H。 勒自然神论者 F。 费舍尔 一个。 Cavazzana-Calvo M。 LMO2-associated克隆后,两名患者T细胞增殖基因治疗SCID-X1 科学 2003年 302年 5644年 415年 419年 2 - s2.0 - 0142084745 10.1126 / science.1088547 米切尔 r S。 Beitzel b·F。 施罗德 答:美国 希恩 P。 陈 H。 浆果 C . C。 埃克 j . R。 布什曼 f . D。 bushman@mail.med.upenn.edu 逆转录病毒DNA整合:alsv、艾滋病毒和MLV显示不同的目标站点首选项 公共科学图书馆生物学 2004年 2 8条e234 10.1371 / journal.pbio.0020234 施罗德 a·r·W。 希恩 P。 陈 H。 浆果 C。 埃克 j . R。 布什曼 F。 hiv - 1整合在人类基因组中有利于活跃基因和当地的热点 细胞 2002年 110年 4 521年 529年 2 - s2.0 - 0037162715 10.1016 / s0092 - 8674 (02) 00864 - 4 奥特 m·G。 施密特 M。 Schwarzwaelder K。 斯坦 年代。 赛勒 U。 Koehl U。 Glimm H。 Kuhlcke K。 Schilz 一个。 Kunkel H。 Naundorf 年代。 Brinkmann 一个。 Deichmann 一个。 费舍尔 M。 球 C。 Pilz 我。 邓巴 C。 杜 Y。 詹金斯 n。 科普兰 n G。 Luthi U。 哈桑 M。 打谷机 a·J。 Hoelzer D。 冯•勒• C。 塞格尔 R。 Grez M。 校正和x染色体相关慢性肉芽肿性疾病的基因治疗,增强MDS1-EVI1插入激活,PRDM16或SETBP1 自然医学 2006年 12 4 401年 409年 2 - s2.0 - 33645734405 10.1038 / nm1393 杜 Y。 詹金斯 n。 科普兰 n G。 插入突变识别基因促进初级骨髓祖细胞的不灭 血 2005年 106年 12 3932年 3939年 2 - s2.0 - 27944449787 10.1182 / - 2005 - 03 - 1113血 Narezkina 一个。 Taganov k·D。 Litwin 年代。 Stoyanova R。 哈亚希 J。 西格 C。 斯加尔卡 a . M。 卡茨 r。 禽肉瘤病毒的全基因组分析集成的网站 病毒学杂志 2004年 78年 21 11656年 11663年 2 - s2.0 - 6344270072 10.1128 / jvi.78.21.11656 - 11663.2004 吴 X。 李 Y。 经济危机 B。 伯吉斯 s M。 人类基因组转录启动地区MLV集成是攻击的首选目标 科学 2003年 300年 5626年 1749年 1751年 2 - s2.0 - 0037841763 10.1126 / science.1083413 纹身 s R。 吴 X。 黄 Y。 驻军 B。 伯吉斯 s M。 凯 m·A。 转座子的高分辨率全基因组映射集成在哺乳动物中 分子和细胞生物学 2005年 25 6 2085年 2094年 2 - s2.0 - 14844355218 10.1128 / mcb.25.6.2085 - 2094.2005 卡尔森 c . M。 Dupuy称:"现在 a·J。 弗里茨 年代。 Roberg-Perez k·J。 弗莱彻 c F。 Largaespada d . A。 转座子突变的老鼠生殖系 遗传学 2003年 165年 1 243年 256年 2 - s2.0 - 0141566659 Vigdal t·J。 考夫曼 c, D。 Izsvak Z。 丹尼尔 d F。 Ivics Z。 常见的物理性质影响目标站点选择睡美人的DNA和其它Tc1转位因子/海员 分子生物学杂志 2002年 323年 3 441年 452年 2 - s2.0 - 0036404918 10.1016 / s0022 - 2836 (02) 00991 - 9 鲍姆 C。 Kustikova O。 Modlich U。 李 Z。 Fehse B。 染色体插入诱变和肿瘤形成的基因转移载体 人类基因治疗 2006年 17 3 253年 263年 2 - s2.0 - 33645451483 10.1089 / hum.2006.17.253 Chalberg t·W。 Genise h·L。 Vollrath也指出 D。 卡洛 m P。 φC31整合酶授予基因组整合和长期表达的转基因鼠的视网膜 调查眼科及视觉科学 2005年 46 6 2140年 2146年 2 - s2.0 - 22144464502 10.1167 / iovs.04 - 1252