乳酸链球菌素生产ž由野生株乳球菌从巴西(意大利型)发酵香肠中分离得到

抽象

本研究中，五种细菌素的产生乳球菌菌株从不同的自然发酵香肠巴西鉴定。离子交换和反相色谱法被用来从五种菌株的培养物上清液纯化细菌素。质谱（MALDI-TOF / TOF）显示bactericoins的分子量从乳酸乳球菌ID1.5,ID3.1,ID8.5,PD4.7,和PR3.1were 3330.567 Da, 3330.514 Da, 3329.985 Da, 3329.561 Da, and 3329.591 Da, respectively. PCR product sequence analysis confirmed that the structural genes of bacteriocins produced by the five isolates are identical to the lantibiotic nisin Z. Optimal nisin Z production was achieved in tryptone and casein peptone, at pH 6.0 or 6.5. The most favorable temperatures for nisin Z production were 25°C and 30°C, and its production was better under aerobic than anaerobic condition. The type of carbon source appeared to be an important factor for nisin Z production. While sucrose was found to be the most efficient carbon source for nisin Z production by four乳酸乳球菌分离物中，果糖是最好的分离物。乳糖也是nisin Z生产的良好能量来源。令人惊讶的是，葡萄糖显然是nisin Z生产中最糟糕的碳源。这五种分离物产生了不同数量的细菌素，乳酸乳球菌ID1.5和ID8.5是最好的nisin Z生产者。DNA序列分析未发现任何序列差异nisZ和nisF启动子区域可以解释nisin Z产生的差异，这表明可能有其他因素导致分离株产生不同的nisin Z。

1.简介

乳酸菌（LAB）构成产生乳酸作为己糖发酵的主要终产物的细菌的一个不同的小组。它们被广泛用于生产许多发酵食品作为发酵剂[1]。适当的文化已经从天然发酵食品中分离在工业生产中使用。使用发酵剂是基于独特的感觉和技术素质，他们加入到发酵产品。除了其在食品生产中的作用，发酵剂培养物产生抗菌物质，如细菌，可用于防止食源性疾病和通过降低/消除发酵食品致病菌和腐败菌，以增加食物的保质期，例如如香肠[2,3.]。细菌素是由革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌产生的核糖体合成的抗菌肽和蛋白质[4]。一类细菌素是l抗生素，它们体积小、耐热、翻译后修饰的细菌素[5]。羊毛硫抗生素的最佳例子是nisins，其最常用的产生乳球菌菌株和包括nisins A，F，H，J，Q，U，和Z [6- - - - - -13]。

乳酸链球菌素生产乳球菌在发酵食品（主要是乳制品）被应用，它通常被认为是安全的。乳链菌肽A是第一个批准细菌素和商业上用作食品防腐剂[14]。nisin A基因座由11个基因组成(nisABTCIPRKFEG)分为三个操纵子[13]。乳链菌肽基因的转录是由三个启动子，其中所述启动子调控前nisRK是组成型的，而nisABTCIP和nisFEG发起人受双成分监管系统NisRK [15]。该NisRK介导的监管体系响应环境因素的变化[16]。

鉴于这种细菌素的广泛应用，其应用的一个重要因素是生产成本。众所周知，发酵系统中细菌素的产生受多种因素的影响，如碳水化合物的种类、氮源、pH值、温度等营养和理化性质[11,17- - - - - -19]。选择优良的发酵剂菌株的标准还包括它们在发酵过程中生长条件下产生细菌素的能力。

大多数nisin-producing乳酸乳球菌菌株已经从干酪，原奶，谷物，鱼和蔬菜发酵[分离6,10,13,20.- - - - - -22]。从肉类和发酵肉制品中分离出来的最常见的细菌源性实验室是片球菌属和乳酸杆菌物种(23- - - - - -26]。

在我们之前的研究中，在位于巴西巴拉那州印比图瓦市和普鲁登托波里斯市的两个产业加工的香肠(意大利型)自然发酵过程中分离出细菌素实验室[27]. 本研究的目的是鉴定5株实验室菌株产生的细菌素，并考察它们在不同生长条件下的分批培养生产细菌素的性能。

2。材料和方法

2.1。细菌菌株和培养条件

在这项研究中使用的所有LAB在30℃下在肉汤LAPT生长[28]。产素乳球菌从自然发酵香肠(意大利型)中分离得到菌株(21)。敏感菌株微球菌ATCC 10240被用作指示菌株为细菌素的活性。It was grown at 30°C in basal media containing (per liter): animal peptone (10 g), yeast extract (4 g), meat extract (8 g), NaCl (5 g), Na₂HPO₄(2.5 g)葡萄糖(10 g)

2.2条。产Nisin菌株的鉴定

乳链菌肽生产分离物通过部分16S rRNA基因序列分析，鉴定到种的水平。基因组DNA用Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega，USA）分离。将PCR通过使用引物的组合，进行FD-^5′CCGAATTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG^3ʹ和MD-^5ʹCCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGA-TCCAGCC^3ʹ(29]，在以下条件下:初始变性温度为95°C，变性2 min，然后进行30个95°C变性2 min, 58°C退火30 s，延伸72°C，延伸2 min，最后延伸72°C，延伸5 min。PCR产物纯化并测序，利用美国国家生物技术信息中心在线提供的BLAST软件与GenBank数据库中的序列进行比对，确定分离株部分16S核糖体基因序列的最近已知亲缘关系。

2.3条。Nisin结构基因及两个启动子的序列分析

核苷酸测序对用特定的引物从基因组DNA的扩增所得到的PCR产物进行尼萨结构基因和尼萨和nisF启动子(根据nisin A regulon设计，GenBank: HM219853.1)。PCR热循环程序包括94°C的初始变性2分钟，然后94°C的变性1分钟，40°C的退火，48°C的退火，68°C的退火30 s的引物set nqf^5ʹCGTTCGAAGGAACTACAAAATAAATT^3ʹ/ naqzr^5ʹACAGACCAGCATTATATTTCTGC^3ʹ，pnisAf公司^5ʹTTGAGTCTTAGACATACTTGAAC^3ʹ/ pnisAr^5ʹCAATGACAAGTTGCTGTTTTCA^3ʹ和pnisFf^5ʹTCCTAAAAGGGGGCAGAGT公司^3ʹ/ pnisFr^5ʹGCCTCGATTAAGGCTCCAAGT^3ʹ， 分别 [30.]，并在72℃延伸1分钟。最后在72℃条件下延长7min。对扩增子进行纯化和测序，并与上述GenBank数据库中的扩增子进行比较。

2.4。固化的质粒

质粒的固化是为了确定这5个细菌素生产的遗传决定因素乳酸乳球菌菌株位于质粒上。乳酸乳球菌菌株在LAPT肉汤和10中生长 μ克毫升⁻¹溴化乙锭在30°C下放置24小时。在孵育后，同样的程序重复几次。存活下来的培养物被稀释，涂布在LAPT琼脂上，在30°C下培养24小时。菌落进一步筛选细菌素生产。采用EZ N. A.™质粒自旋协议(Omega, USA)检测野生型和变异质粒。

2.5。细菌素抗菌活性测定

采用琼脂孔扩散法定量测定细菌素的抗菌活性[31]. 将无细胞培养上清液（煮沸中和）和纯化细菌素的制备物连续稀释，并对指示菌株进行检测。一个任意单位（AU·mL⁻¹)被定义为最高稀释倍数的倒数，表明在直径至少5毫米的抑制区域。

2.6。细菌素纯化和质谱

细菌素是从五种细菌的培养上清中纯化出来的乳酸乳球菌菌株使用离子交换和尊敬相色谱法。所述细菌素通过使用硫酸铵（40％），溶解在水中沉淀，将pH调节至3.5。的preparation was then passed through SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Biosciences, Uppsala) equilibrated with 10 mmol·L⁻¹醋酸。的column was eluted with a stepwise gradient consisting of 10 mL of each 0.1, 0.3, and 1.0 mol·L⁻¹1ml·min NaCl⁻¹流速。利用Äkta纯化器快速蛋白质液相色谱系统，在与水中0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）平衡的反相柱（资源15 RPC；法玛西亚生物技术）上对细菌素活性最高的部分进行分离。用0-100%异丙醇（含0.1%（v/v）TFA）的线性梯度进行洗脱。活性组分与1 ： 1和15 mg溶液混合α氰基-4-羟基肉桂酸在50％乙腈，49.9％乙醇和0.1％TFA，和沉积在地面钢基质辅助激光解吸电离目标。Mass spectra were recovered in a positive reflector mode with an Ultra Flex TOF/TOF (Bruker Daltonics GmBH, Bremen, Germany) by using a pulsed ion extraction duration of 40 ns and an acceleration voltage of 25 kV.

2.7。营养源和生理条件对细菌素生产的影响

试验碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖和浓度为10 g·L的果糖⁻¹。文化标准化(OD_600海里= 0.6)在添加葡萄糖、乳糖、蔗糖或果糖的LAPT肉汤中培养，在30°C下孵育24小时，不搅拌。每小时取样检查细菌生长情况(OD)_600海里），在培养物中的pH值，以及细菌素的生产变化。

为了研究不同氮源对细菌素生产的影响，在LAPT培养基中添加不同氮源(胰蛋白酶、酵母提取物、肉汁提取物、动物蛋白胨、大豆蛋白胨和酪蛋白蛋白胨，浓度为35 g·L)⁻¹)。通过调节LAPT肉汤初始pH至ph4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，用无菌的1nhcl处理，确定培养基pH对细菌素生产的影响。温度对细菌素生产的影响是通过在20、25、30、35和40℃的培养基中培养细菌素24小时来确定的。在厌氧(密封的厌氧管)和好氧(搅拌)条件下，在LAPT培养基中培养细菌素。所有供试菌均接种标准(OD)_600海里 = 0.6) bacteriocinogenic cultures for 24 h. After the incubation, the final pH, bacteriocin production, and bacterial growth (OD at 600 nm) were determined for all conditions described above.

2.8条。统计

关于细菌生产的所有实验一式三份进行，重复两次。当误差线图中分别获得，他们指的是平均值的标准差。

3。结果与讨论

本文报道了实验室从意大利型香肠中分离得到的细菌素的鉴定和生产情况。BLAST分析每个分离物的16S rRNA基因的部分序列(约1500个核苷酸)，发现99%的核苷酸与的16S rDNA序列一致乳酸乳球菌CV56，乳酸乳球菌SL3，和乳酸乳球菌KLDS（GenBank登录号：CP002365.1，AY675242.1，和DQ340068.1）（数据未示出），这表明产生细菌素的分离物乳酸乳球菌。

目的是为了纯化五种细菌产生和分泌的细菌素乳酸乳球菌菌株从无细胞上清液中进行三步纯化。所有菌株的细菌素的最高活性部分用30%至40%的异丙醇洗脱(数据未显示)。纯化后的馏分的分子质量乳酸乳球菌ID1.5、ID3.1、ID8.5、PD4.7、PR3.1分别为3330.567 Da、3330.514 Da、3329.985 Da、3329.561 Da、3329.591 Da(图)1)，与nisin Z（3330）的分子质量相似。93 达）[32]。

从五个的基因组DNA的扩增所得到的PCR产物乳酸乳球菌用引物特异于乳链菌肽的结构基因的菌株进行核苷酸测序。结果表明，从五个菌株乳链菌肽基因序列是相同的乳链菌肽ž基因（GenBank：AB375441）（图2(一个))，其在位置27处有天冬酰胺残基，而不是在nisin A中发现的组氨酸[12]。初步试验表明，不同分离株之间的抑制活性存在差异[27];然而，这些差异并没有被基因结构所解释。Nisin Z是一种细菌素，对致病性革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有潜在的抑制作用[33,34]。此外，De Vos等人[21]报道了His27Asn替代导致nisin Z的高扩散速率，进而导致nisinz在琼脂扩散试验中产生较大的抑制区。

从五个基因组DNA中获得的启动子的DNA序列分析乳酸乳球菌菌株证实，乳链菌肽的结构基因的所有启动子分别为100％相同的公开序列nisZ和尼萨启动子(GenBank: Y13384.1和Z18947.1)(图22（b）)。启动子序列nisZ的五种菌株的基因含有部分保守的区域中，TCT-N₈-TCT基序，存在于-39位置到-26，转录起始位点上游nisZ(图2（b）)，可能参与转录控制功能。钱德拉帕蒂和奥沙利文[35]报道，该motif可能参与了NisRK双组分调节系统的NisR响应调节因子的协同结合。

他们还报告了第二个TCT-N₈-TCT基序出现在−107至−94的位置，这在本研究中也得到了证实(图1)2（c）)。此TCT重复，连同第一个，是参与最佳由半乳糖代谢的leloir途径的某些组件在感应NisR的结合，并且还[36]。因此，已经报道，半乳糖和乳糖可从诱导的转录尼萨启动子[35,36]。在前面的启动子的另一种nisFEG在五个菌株中发现了基因;它与nisin A regulon (GenBank: HM219853)相同(图)2（c）)。的上游序列nisFtranscription start site included a single TCT direct repeat with an 8 bp spacer region similar to the TCT-N₈-TCT基序位于转录起始位点上游-39到-26的相同位置nisZ(数据2（b）和2（c）)。的nisZ和nisF从所有菌株获得的启动子序列都是相同的(图)2（b）和2（c）)。

质粒的五株被发现乳酸乳球菌(数据没有显示)。观察到，所有菌株的固化衍生物都能产生细菌素，这表明编码细菌素的基因位于染色体上。许多研究人员发现，nisin基因存在于一些质粒或染色体上[6,22,37,38]。此外，nisin基因簇已被证明位于结合的大转座子上(∼70kb) [38，也含有蔗糖代谢的遗传决定因素。有趣的是，有人提出，一个遗传调控系统或一个共同的代谢控制系统负责蔗糖发酵和nisin的生产能力[19,38]。

五种微生物的生长和乳酸链球菌素的产生动力学乳酸乳球菌分离物以数字表示3.和4。细菌素的活性随生长的增加而增加，在静止期达到最大活性(图2)3.和4)。通过使用果糖，乳糖和蔗糖作为碳源（图获得的乳链菌肽的生产的高水平3（b）和4(一))。总的来说，分离菌ID 3.1在除果糖外的糖存在的情况下似乎产生较少的细菌素。在四个分离株中，蔗糖似乎是细菌素活性最高的糖(但不是ID3.1)。对于所有分离物，葡萄糖产生的细菌素活性比其他糖最小(图)3.和4). 所有菌株培养6-8小时后，nisin的产生量都有所下降；但是，当乳酸乳球菌ID 3.1补充有果糖（图3（b）)。

在一般情况下，株展出明显不同细菌的活动。这两种菌株乳酸乳球菌ID1.5和ID8.5显示出很强的抗菌活性(图)3.和4)。碳源选择已被报告为在由于其对细胞生长和乳链菌肽的生物合成[作用乳链菌肽的生产的关键控制步骤19]。例如，蔗糖和乳糖被确定为用于生产乳链菌肽有效碳源乳酸乳球菌NIZO 22186 [19]乳酸乳球菌ATCC 11454号[39),而乳酸乳球菌A164 [18]，而果糖是最有效的碳源乳酸乳球菌LL27 [40]葡萄糖乳酸乳球菌IO-1 [11]。有趣的是，在葡萄糖的存在下观察到的生产乳链菌肽差的Z。总之，这些结果表明，以提高乳链菌肽的生产测试不同的碳水化合物的重要性。

五个乳酸乳球菌分离株以胰蛋白酶和酪蛋白蛋白胨为唯一氮源，高效生产nisin Z，但在添加其他氮源的培养基中生长相似。Simsek等人以前的工作。[40]表明酵母抽提物和肉抽提物是产nisin A最有效的氮源乳酸乳球菌LL27。然而，我们的结果表明，酵母和肉类提取物导致最低的细菌素活性的氮源测试。因此，日新Z的生产由五人完成乳酸乳球菌株是由蛋白胨和酪蛋白胨刺激，而不是由酵母和肉类提取物。

我们的研究结果表明，乳链菌肽Z ^生产由五个乳酸乳球菌菌株受温度、pH、好氧和厌氧条件的影响(表2)1)。所有乳酸乳球菌菌株在初始pH值为4.5 ~ 7.0，温度为30 ~ 40℃时均能生长并产生细菌素(表2)1). 然而，当这些菌株在初始pH 6.0和6.5下培养，并在25°C和30°C下培养时，可获得较高的nisin Z产量（表1)。当所有菌株在pH7.0中培养，并在35℃温育达到高生长速率，但细菌素生产在这些条件下降低（表1). 相比之下，Matsusak等人。[11[英语泛读材料据报道，nisin的产量增加了乳酸乳球菌碘-1的pH值由5.0至5.5不等。

结果还表明，高温（40°C）对5株nisin产生菌的生长没有影响，但降低了nisin Z的产生。温度可以通过干扰细菌素的翻译后修饰、对细胞的吸附和蛋白水解来影响肽的稳定性[41]。此外，温度对其生物合成具有重要的调控作用。Diep等人发表了一个对温度敏感的细菌素生物合成的例子。[32]，其中sakacin A的生物合成发生在25°C和30°C，但不发生在更高的温度（33.5-35.0°C）。sakacin A生物合成的温度调节发生在转录水平，高温下细菌素的产生减少与诱导肽的合成减少有关。此外，众所周知，高温会增强携带细菌素基因的质粒的遗传不稳定性[42,43]。但是，日新Z的生产损失了五分之一乳酸乳球菌在35°C和40°C分离的菌株并不是由于它们的遗传决定不稳定性，因为质粒的固化结果表明，这5个菌株中编码nisin Z的基因位于染色体上。

如在该工作显示，乳链菌肽Z的结构基因在五种菌株，其以可变的安装件产生乳链菌肽z为鉴定。我们分析nisF和nisZ启动子序列，因为这些启动子被控制以同样的方式;然而，这些序列在所有菌株类似，表明有应负责差动生产乳链菌肽Z的其他因素

4。结论

总之，细菌素的结构基因和分子质量产生五个乳酸乳球菌菌株与nisin Z完全相同，说明各菌株产生的细菌素均为nisin Z。两株菌株在分批培养条件下获得了最大的nisin Z产量乳酸乳球菌ID1.5和ID8.5（未ID3.1），在初始pH为6.0和6.5，在25温育温度℃和30℃，需氧条件下，并且当使用蔗糖作为唯一碳源。LAPT肉汤蛋白胨和酪蛋白胨的补充五个增加了生产乳酸链球菌素的Z乳酸乳球菌株。这些参数对于乳酸链球菌素ž优化生产，这对于使用这些菌株或他们作为biopreservation代理细菌的不可缺少的重要。

据我们所知，这是由乳酸链球菌素ž生产的第一次报告乳酸乳球菌在巴西发酵香肠隔离。我们的研究也是第一次研究显示，生产不同层次和多样化的条件下，相同的细菌中，通过不同的野生菌乳酸乳球菌与相同的环境隔离。我们认为，鉴定产生更多抗菌素的本地菌株将有助于将其作为保存食品的启动剂，并可能进一步有助于增强传统食品的原创性。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通信作者处获得。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

致谢

这项研究是基于博士玛格丽特爱丽丝丰特斯萨莱瓦，谁是从Conselho国立DesenvolvimentoCientíficoËTecnológico（的CNPq巴西）的奖学金支持和Coordenação德Aperfeiçoamento德Pessoal德NIVEL高级（CAPES-PDEE进程内的论文。没有。5061-10-5 / 2011-巴西）。这项研究已经Fundação日安帕罗àPesquisa了部分资金做斯卡德米纳斯吉拉斯州（FAPEMIG巴西）。

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