一种2009 -bp DNA缺失的鉴定与定位六章遗传性血统患者的患者

摘要

我们报告了杂合，2,009对（BPS）基因组DNA缺失六章在I型遗传性血管水肿(HAE)病例中尚未报道的基因。患者为居住在香港的28岁汉族女性，从青春期开始就患有复发性血管性水肿，进入成年后发作频率增加;过去，每年发生一次，但现在每两到三个月发生一次。受影响的区域不发痒，包括常见的部位，如左前臂和右前臂，但没有喉咙受累。患者也有胃脘痛。病人的母亲也有类似的症状。丝氨酸蛋白酶抑制剂G分支成员1的突变(六章）基因与Hae相关。HAE类型的患者通常携带小缺失六章或截断的成绩单。我们在我们的编重患者上进行了多重结扎依赖性探针扩增（MLPA）测定。我们的结果表明，在外显子5和6中跨越了2,009个BPS删除六章．虽然较早的文献描述了其他大的DNA缺失包裹外显子5和6 in六章，这些DNA重排的大小在4到6 kbps之间较大，并且由于技术限制通常不确定断点位置（Pappalardo等，2000; Duponchel等，2001; Roche等，2005; LOULS ETal。，2018;和哥βWein等人，2008)。我们的报告描述了这2009 bps的映射六章．使用分子技术的组合，我们能够确认和定位该大型杂合子基因组DNA缺失，包括外显子5和6六章．

1.介绍

遗传性血统（HAE）是一种罕见的天生障碍，其特征在于身体不同部位的水肿，包括四肢，脸和喉咙[1]．当肿胀阻塞气道时，这种疾病可能会危及生命。发作期间，患者可能会出现严重的腹痛和恶心，这是由肠壁炎症引起的。发作可以由各种因素引发，包括压力和药物。

HAE can be broadly divided into two groups, with the first group being associated with C1 inhibitor (C1-INH) deficiency (i.e. C1-INH-HAE), while the second group is independent of C1-INH abnormality and is commonly referred to as “HAE with normal C1-INH” [2那3.]．在前者中，C1-Inh-Hae可以进一步分类为I和II类型，它们是临床上无法区分的，其只能通过实验室测试来区分。C1-Inh-Hae是一种常染色体显性疾病，并且平均频率为约1％（50,000）[3.-5.]．I型和II型HAE是由于丝氨酸蛋白酶抑制剂G分支成员1 (六章）基因编码用于C1-INH蛋白，一种蛋白酶抑制剂，属于Serpin Superfamily，其主要功能抑制补体C1和血浆Kallikrein [6.-8.]．前杏仁蛋白的激活导致生成Bradykinin（即，有效的血管扩张剂），导致血管模型攻击[9.]．两种类型的HAE是由杂合突变引起的六章11号染色体上q。虽然非常罕见，纯合突变在六章基因也有记录[10.-13.]．大多数Hae患者是I型（80-85％），并且通常表现出血清C1-INH水平，比正常少35％[14.]．在II型Hae中，血清中的C1-INH水平是正常的，甚至升高，但蛋白质是功能障碍。HAE患者还记录了正常的C1-INH水平和功能，并被统称为“HAE具有正常的C1-INH”[2]．这一群体已经确定了几个基因靶标，包括编码XII因子的基因[15.),而16.]，纤溶酶原[17.]或未知。这些基因中的突变导致血管渗透性的增加，导致HAE发作，有时可以解释具有正常C1-INH水平或功能的HAE病例。

本报告描述了一个病例I型生活在香港的28岁汉族妇女，其母亲患有类似症状。患者的诊断是通过C1-INH浓度研究和功能检测确定的，随后通过多重连接探针扩增(MLPA)检测和远程聚合酶链反应(PCR)进行基因确认。扩增子的基因组测序允许绘制一个2009 bps以内的大的DNA缺失六章尚未有报道，这就解释了患者(及其母亲)的I型HAE。

2.案例介绍

我们的索引患者是一位居住在香港的28岁汉族女性，她从青春期开始就反复发作血管性水肿，随着她进入成年期，发作次数越来越多。这些事件在过去每年发生一次，但现在增加到每两到三个月发生一次。水肿不发痒，受影响的区域包括常见的肿胀部位，如左前臂和右前臂;没有喉咙受累。病人也诉说有上腹痛。患者的母亲也有类似的症状(尽管比患者更严重)，这表明患者的疾病有遗传成分。患者血清C1-INH水平(患者:<0.03 mg/mL，参考文献:0.240 ~ 0.387 mg/mL)和C1-INH功能(患者:0.12 U/mL，参考文献:0.7 ~ 1.3 U/mL)均较低;由于患者血清C1-INH浓度较低，C1-INH功能预计会减弱。患者的C3水平正常，但C4水平也较低，这可以解释为C1-INH的丢失，加速了C4的消耗。这些结果共同表明C1-INH缺乏，表现为I型HAE。

我们开始分析病人的六章Sanger测序的基因，但发现没有异常;我们怀疑我们的结果可能是由于Sanger测序可能无法检测到的大型DNA缺失，因为变异等位基因不会是可扩大的。为了研究这一点，我们使用MLPA测定，一种敏感的测定，允许检测在一个相对简单，半定量的PCR基反应中检测多达45个基因座的DNA拷贝数变化。使用这种技术，我们发现外显子5和6的DNA拷贝数是其他外显子的一半六章基因（图1（a）)，表明这两个外显子均存在杂合缺失。因为HAE是一种常染色体显性疾病，我们发现其为杂合子六章MLPA测定删除证实了患者的临床历史。

外显子5和6的序列都短（分别为204和140bps）。鉴于他们体积小，靠近（它们仅为194个BPS），我们推断出缺失很可能是跨越这些外显子（即，）跨越这些外显子的大型基因组DNA缺失（即，CIS.，而不是在不同的DNA链上分别缺失第5和第6外显子(即，trans阶段）。总长度，包括外显子5和外显子6之前的内含子为9,547 bps。该段太大而无法通过常规PCR扩增，因此，为了确认缺失，我们使用远程PCR扩增外显子4和7之间的区段。如凝胶电泳，我们观察到不同的PCR产品长度;一个是预期的分子大小约为10,000bps，而另一个较小的PCR产物约为8,000bps（数据未显示）。该较小的PCR产物可能是通过缺失的变异等位基因提供的。值得注意的是，这两种PCR产物的存在支持我们预测患者携带大型DNA突变，涵盖外显子5和6CIS.相，而不是缺失外显子5和外显子6的缺失在单独的DNA链上，因为这将产生两个较小的PCR产物而不是一个。不幸的是，Sanger测序只能处理约1,000bps或更短的序列，因此大约8,000bp的PCR产物太大而无法通过这种方法直接测试。为了精确定位删除的边界，我们首先在外显子4和7之间的不同区域中设计了几个底漆对，以扫描删除。一对这些引物（补充表1)从患者基因组DNA中产生杂合子PCR产物(图1（b））。使用凝胶纯化方法，然后分离较小的PCR产物并进行Sanger测序（图2）。从该较小的PCR产物预期来自变异等位基因，我们能够确定缺失为2,009个BPS，在基因组DNA上的位置12,156和14,164之间（即Ng_009625.1：G.12156_14164DEL2009）。这种大型基因组DNA缺失损失了外显子5和6，导致500-氨基酸蛋白截短到252-氨基酸蛋白中（即，缺失272个氨基酸和24个胡说氨基酸的取代）（图3.）。根据ACMG 2015指南，这种变异被认为是“致病”[18.]．虽然有些报道已经讨论了外显子5和/或外显子6的缺失，但这些报告的缺失较大，大小约为4-6 kbps [19.-23.]并且这种特殊的2,009bps删除变体包括我们检测到的外显子5和6，尚未描述。基本上，我们的分子结果解释了患者低C1-INH水平和功能的原因。

患者的母亲有类似症状(但比患者严重)，并显示与患者相同的实验室结果(即，血清C1-INH水平，母亲:<0.03 mg/mL，参考文献:0.224-0.387 mg/mL;和C1-INH功能，母亲:0.09 U/mL，参考:0.7-1.3 U/mL)。母亲的基因组DNA也受到MLPA化验和桑格排序,和相同的病人中发现的变异也发现母亲(即NG_009625.1: g.12156_14164del2009),表明患者的突变是遗传自母亲,发现突变不是新创对于患者。但是，母亲的突变是德诺维随着来自祖父母或母亲的兄弟姐妹的样本无法进一步调查，仍然不确定。

3.讨论

六章突变是高度异质的，直到写入本报告中，已经针对该基因描述了超过500个突变（http://www.hae.enzim.hu，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/和http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac）。The majority of the reported cases (i.e., approximately 70-75%) had point mutations that led to missense mutations or short insertions/deletions that caused frame-shift alterations, whereas larger structural mutations, such as indels, make up around 15-20% of all cases. Finally, the remainder 10% was splice-site and regulatory mutations. The data presented in this study illustrate the identification of a large DNA deletion of 2,009 bps that is carried by both the patient and her mother and provide insight into the etiology of their type I HAE.

基因六章含有称为“alu元素”的高密度，称为“alu元素”，已知通过插入介导的缺失或重组相关缺失来促进缺失的转换序列[24.那25.]．因为大多数ALU元素都在内含子4和6中找到[14.]，我们也研究了我们检测到的外显子5-6缺失是否与这些Alu元素有关。我们定位了NG_009625.1:g附近的Alu序列。1215.6._14164del2009, but neither 5′ nor 3′ ends of the deletion breakpoints are intersected by Alu element sequences. The 5′ end of the deletion breakpoint is 16 bps from the nearest Alu element, but the 3′ end is approximately 1 kbps away from the adjacent Alu sequence (Figure4.）。鉴于删除断点的3'末端的偏离偏离alu序列，是否参与了NG_009625.1的形成：G.12156_14164DEL2009删除仍然难以捉摸，导致这项2,009个BPS删除的机制将需要进一步调查。

外显子5和6(共编码115个氨基酸)的截断显然对C1-INH的表达及其功能具有破坏性后果。这些涉及外显子5和/或外显子6的大型杂合缺失的有害影响得到了先前在HAE患者中发现的其他类似突变的支持[19.-23.]．有趣的是，这些早期报告中描述了影响外显子5和/或外显子6的大缺失的大部分报告没有确定这些删除的断点位置，而是仅注意到删除的近似尺寸，并且这些删除也比我们的尺寸更大detected variant (i.e., 4-6 kbps) [19.-23.]．没有在这些队列中进一步评估的这些缺失的扩展是由于技术和资源的限制。事实上，解剖大的DNA突变通常是具有挑战性的，因为即使只是评估一个病例的过程也可能是耗时、劳动密集和昂贵的。显然，技术已经发展，有了新的方法，如下一代测序(NGS)，应该有助于调查这些突变的边界位置。Loules等人最近的一份报告．讨论了一个定制的NGS平台的实现六章基因在临床环境中[22.]．然而，除剩下相对昂贵的外，NG还需要高度专业人员进行操作和数据分析，这使得在大多数临床实验室中难以实施。而且，NGS并不完美;据报道，它难以检测中等大小的缺失和插入[26.]．另一种方法称为外显子定量技术(EQT)用于检测大规模基因重排六章也曾被描述[27.]．该方法基于定量多路复用PCR短荧光片段方法，该方法旨在增强对难以检测的大型衬底的搜索，难以通过Sanger测序[20.]．作者讨论了EQT测定，以敏感，便宜，快速，更直接的方法，用于研究大型DNA改变，呈现为对大型诱惑的有吸引力的方法六章．在我们的情况下，我们花了几个月的几个月通过常规PCR和Sanger测序对许多引物进行了测试，以对缺失进行解剖。重要的是，我们的报告是第一个精确地定义了2,009个BPS删除的边界周围的外显子5和6六章．

对于我们索引的患者和她的母亲，尽管他们都有相同的基因突变，但他们的疾病进展似乎不同，母亲表现出更严重的症状，包括肠水肿和喉咙肿胀发作，这些症状在索引的患者中是缺席的。也许这与他们的年龄差异有关，但患者和她的母亲没有表现出相同程度的疾病表型的确切原因尚不清楚。在早期的文献中已经记载了HAE的临床表达六章突变可以很大差异，表明除了突变之外的其他因素六章有助于临床表现的多样性[8.]．此外，一些研究试图确定临床表型和六章基因突变;然而，结果在很大程度上是相互矛盾的[1那8.那16.那28.那29.[基于的尝试解释临床演示六章突变并没有成功。其他因素如环境刺激、激素效应和表观遗传变化已被认为与疾病基因型相互作用，从而指导疾病的表现。此外，激肽分解代谢水平也被认为是HAE严重程度的一个潜在预测参数[30.]．因此，引起HAE症状的确切机制仍不清楚，需要进一步研究。

发现这种大型DNA缺失需要不同分子方法的混合物。来自我们研究的另一个学习点是，只有Sanger测序，该毛突变均不会检测到这种毛损，这是一种广泛使用的方法，通常认为遗传研究中的金标准。Sanger测序在划定长长的重复序列中是无效的，在检测大DNA突变方面是不可靠的，并且只能使用约1,000bps的小DNA片段。在我们的情况下，成功的遗传检查需要正确使用其他分子技术，例如MLPA测定和适当的引物组合，以适当地定义2,009-BP DNA缺失。调查人员需要充分意识到其方法的优势和局限性，以准确地检测某些类型的遗传异常。

总之，我们的结果进一步扩展了已知的谱六章突变并将有助于更好地理解C1-Inh-Hae。

利益冲突

提交人声明没有利息披露的冲突。本工作未收到公众，商业或非营业部门的任何资助机构的具体授予。

致谢

作者感谢患者和她的母亲，容易提供过去的病史及其同意发布这种情况。我们还要感谢Crystal Lam博士对我们的稿件建议。

补充材料

本节介绍该研究中使用的方法和材料，包括各种PCR中的引物序列。（补充材料）

参考

1. A. Agostoni, E. Aygören-Pürsün, K. E. Binkley, A. Blanch, K. Bork, L. Bouillet et al., “Hereditary and acquired angioedema: problems and progress: proceedings of the third C1 esterase inhibitor deficiency workshop and beyond,”过敏与临床免疫学杂志，卷。114，没有。3，pp。S51-S131，2004。视图:出版商的网站|谷歌学术
2. B. L.苏拉夫，“遗传性血统和正常的C1抑制剂：四种类型和数量，”过敏与临床免疫学杂志(第141卷第1期)3, pp. 884-885, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. M. Maurer, M. Magerl, I. Ansotegui, E. Aygören-Pürsün, S. Betschel, K. Bork等人，“国际WAO/EAACI治疗遗传性血管水肿指南——2017年修订和更新，”过敏：欧洲过敏和临床免疫学杂志，卷。73，没有。8，pp。1575-1596,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
4. A. Bygum, C. R. Fagerberg, D. Ponard, N. Monnier, J. Lunardi, C. Drouet，“C1抑制剂缺乏导致遗传性血管性水肿的丹麦家族的突变谱和表型”，过敏：欧洲过敏和临床免疫学杂志，卷。66，没有。1，pp。76-84，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. A. Zanichelli, F. Arcoleo, M. P. Barca, P. Borrelli, M. Bova, M. Cancian等人，“意大利一项因C1抑制剂缺乏而导致的遗传性血管性水肿的全国性调查”orphanet罕见疾病杂志，卷。10,2015。视图:谷歌学术
6. A. Ghannam, D. Ponard, and C. Drouet，“C1 Inhibitor，”in补充素材簿巴纳姆(S. Barnum)和希因(T. Schein, Eds.)那pp. 241–249, Academic Press, New York, NY, USA, 2nd edition, 2017.视图:谷歌学术
7. D. Charignon，A. Ghannam，D. Ponard和C. Drouet，“遗传性C1抑制剂缺乏与高自发酰胺酶活性相关，”分子免疫学，卷。85，pp。120-122,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术
8. M. Piñero-Saavedra和T. González-Quevedo，《遗传性血管性水肿的遗传学:综述》，罕见病研究与治疗杂志，第2卷，第14-19页，2017。视图:谷歌学术
9. Z.L.M.Hofman，A. Relan，S. Zeerleder，C. Drouet，B.苏锯和C. E. Hack，“遗传性血统的患者的血管内膜攻击：局部活化过程的局部表现形式”过敏与临床免疫学杂志，卷。138，不。2，pp。359-366,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
10. M.Rijavec，P.Korošec，M.Šilar，M. Zidarn，J.Miljković和M.Košnik，“斯洛文尼亚的遗传性血统Edema全国范围内研究筛选了四种新的突变，”普罗斯一体，卷。8，不。2，2013年物品ID e56712,2013。视图:谷歌学术
11. V.Bafunno，C. Divella，F.Sessa，G.L.L.Tiscia，G.Castellano，L.Gesualdo等，“遗传性血统的患者中的C1抑制剂基因的Novo纯合突变”，过敏与临床免疫学杂志(第132卷第1期)3, pp. 748e3-750e3, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. A. Blanch，O. Roche，I.乌鲁鲁特，P.Gamboa，G. Fontan和M.López-Trascasa，“纯合C1抑制剂缺乏的第一个案例”过敏与临床免疫学杂志，卷。118，没有。6，PP。1330-1335,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术
13. A. López-Lera, B. Favier, R. M. De La Cruz, S. Garrido, C. Drouet，和M. López-Trascasa，“一个新的纯合子c1抑制剂缺陷病例表明Arg378在激肽通路激活控制中的作用，”过敏与临床免疫学杂志，卷。126，没有。6，PP。1307E3-1310E3，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
14. A. E. Germenis和M. Speletas，“遗传性血管性水肿的遗传学再访”，过敏与免疫学临床综述第51卷，没有。2，页170-182,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
15. S. CICHON，L. Martin，H.C.C.HENENIES，F.Müller，K.Van Driessche，A. Karpushova等，“凝血因子XII（Hageman因子）的活性增加导致遗传性血统的III型”美国人遗传学杂志，卷。79，没有。6，PP。1098-1104,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术
16. V.Bafunno，M. Bova，S. Loffredo，C. Divella，A.Petraroli，G. Marone等，C1抑制剂基因的“C1抑制剂基因的突变谱”在遗传性血统血统的群体群中的“C1抑制剂基因”：九种新突变的描述，“人类遗传学，卷。78，没有。2，第73-82,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. K.Bork，K.Wulff，L.Steinmüller-Magin，I. Braenne，P. Staubach-Renz，G. Witzke等，“遗传性血管内膜，纤溶酶原基因突变，”过敏：欧洲过敏和临床免疫学杂志，卷。73，没有。2，pp。442-450,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
18. S. Richards，N.Aziz，S. Bale，S. Das，J.Gastier-Foster等，“解释序列变体的标准和指南：美国医学遗传学和基因组学学院的联合共识建议和分子病理学协会，“药物的遗传学第17卷，没有。5，pp。405-423,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
19. E. Pappalardo, M. Cicardi, C. Duponchel, A. Carugati, S. Choquet, A. Agostoni等，“血管性水肿患者C1抑制剂基因的频繁新生突变和外显子缺失，”过敏与临床免疫学杂志，卷。106，没有。6，pp。1147-1154,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术
20. C. Duponchel，C. D. Rocco，M.Cicardi和M. TOSI，“遗传性血管后期患者C1抑制剂基因的荧光多重PCR的快速检测”人类基因突变第17卷，没有。1，页61-70,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术
21. O. Roche，A. Blanch，C. Duponchel，G.Fontán，M. Tosi和M.López-Trascasa，遗传性血统密瑟：大西班牙队列中的筛选1 / C1NH的突变谱，“人类基因突变，卷。26，不。2，pp。135-144,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术
22. G. loules，M.Zamanakou，F.Carsopoulou，S.Vatsiou，F.Psarros，D.Csuka等人，“靶向下一代测序，由于C1抑制剂缺乏，遗传性血统的分子诊断的下一代测序”基因，卷。667，第76-82,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
23. T.Gösssein，A. Kocot，G. Emmert，W.Kreuz，I. Martinez-Saguer，E.Aygören-Pürsün等，“遗传性血统血统患者的C1Inh（六种）基因的突变谱”，细胞遗传学和基因组研究，卷。121，没有。3-4，第181-188,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
24. P. E. Carter，C.Duponchel，M. TOSI和J.E.Fothergill，“具有异常高密度的人C1抑制剂基因的完全核苷酸序列，具有异常高密度的Alu元素”欧洲生物化学杂志，卷。197，没有。2，pp。301-308,1991。视图:出版商的网站|谷歌学术
25. S. Kim，C.0.Cho，K. Han和J. Lee，“Alu元素和人类疾病的结构变异”基因组学和信息学，卷。14，不。3，pp。70-77,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
26. R. Daber，S. sukhadia和J. J. D. Morrissette“了解下一代测序信息学的局限性，使用人工数据集的临床管道验证方法”癌症遗传学第206卷，第2期。12, pp. 441-448, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术
27. P. Nicolicht, D. O. Faria, L. Martins-Silva, L. S. Maia, A. S. Moreno, L. K. Arruda et al., “Gene mapping strategy for Alu elements rearrangements: detection of new large deletions in the SERPING1 gene causing hereditary angioedema in Brazilian families,”基因，卷。685，pp。179-185,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术
28. Y.Y.徐，y.-x.Zhi，J. Yin，L.-1.王，L.-P.Wen，J.-Q.古等人，“具有遗传性血统的中国家庭的突变谱和种族表型相关性”过敏，第67卷，否。11页，1430-1436,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
29. M. Cugno, A. Zanichelli, F. Foieni, S. Caccia和M. Cicardi，“c1 -抑制剂缺乏和血管性水肿:分子机制和临床进展”，分子医学发展趋势，卷。15，不。2，pp。69-78，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
30. C. Drouet，A.Désormeaux，J. Robillard，D. Ponard，L. Buillet，L.Martin等，“遗传性血统的金属肽酶活性”：雄激素预防对血浆氨基肽酶P的影响，“过敏与临床免疫学杂志，卷。121，没有。2，pp.209-433，2008。视图:出版商的网站|谷歌学术

版权

版权所有©2019 Wai-Yu Wong等。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中的不受限制使用，分发和再现。