遗传性血管性水肿(已经)是一种罕见的先天疾病,其特征是在身体的不同部位水肿,包括四肢,脸,和喉咙 1]。这种疾病阻碍气道肿胀时可能危及生命。袭击期间,病人可能患有严重的腹痛和恶心,是由炎症引起的肠道壁。事件可以由各种因素引起的,包括压力和药物。

已经可以大致分为两组,第一组与C1抑制剂(C1-INH)缺乏症(例如C1-INH-HAE),而第二组是独立于C1-INH异常,通常被称为“有正常C1-INH”[ 2, 3]。在前者,C1-INH-HAE可以进一步subcategorized为第一种和第二种,临床上难以区分,只能分化的实验室测试。C1-INH-HAE是一种常染色体显性遗传疾病,平均频率大约发生在50000 3- - - - - - 5]。I型和II型有丝氨酸蛋白酶抑制剂是由于突变,进化枝G,成员1 ( SERPING1)基因,编码的C1-INH蛋白质、蛋白酶抑制剂属于serpin总科的主要功能抑制补充C1和血浆激肽释放酶 6- - - - - - 8]。激活prekallikrein导致代缓激肽(即。强有力的血管舒张药)导致血管性水肿攻击( 9]。这两种类型的是杂合的基因突变造成的 SERPING111号染色体上q。虽然非常罕见,纯合突变 SERPING1基因也被记录( 10- - - - - - 13]。大多数患者都是I型(80 - 85%)和一般展览血清C1-INH水平低于正常(35% 14]。在II型,C1-INH水平正常血清或甚至升高,但蛋白质功能失调。有患者表现出正常C1-INH水平和功能也被记录和集体被描述为“有正常C1-INH”[ 2]。几个基因的目标已确定,在这组人中,包括基因编码因素十二世( 15),而 16)、纤溶酶原(物 17),或未知。这些基因的突变会导致血管通透性增加,导致有发作,有时可以解释有正常C1-INH水平或功能的情况下。

目前的报告描述了一个类型的我已经28岁汉族妇女住在香港的母亲患有类似的症状。病人的诊断建立了C1-INH集中研究和功能分析,其次是遗传确认使用多路复用结扎探测器放大(MLPA)分析和远程聚合酶链反应(PCR)。基因组测序的扩增子映射允许大量DNA内删除2009个基点 SERPING1尚未报道,占患者的我和她母亲的类型。

我们的病人索引是一个28岁的汉族女性住在香港受到反复发作的血管性水肿自青春期以来,越来越多的攻击,她进入成年。每年这些事件发生在过去,但现在已经增加到每两到三个月。水肿不痒,受影响的地区包括共同肿胀等网站左和右前臂;没有喉咙参与。病人还抱怨上腹疼痛。患者的母亲患有类似症状(尽管比病人更严重),表明病人的疾病的遗传组成部分。病人的血清C1-INH水平(病人:< 0.03毫克/毫升,参考:0.224 - -0.387毫克/毫升)和C1-INH功能(病人:0.12 U /毫升,参考:0.7 -1.3 U /毫升)都低;衰减C1-INH功能预计由于病人的血清C1-INH浓度较低。病人的C3水平正常但C4水平也较低,这可能是由于C1-INH的损失,加快了C4的消费。这些结果共同表明C1-INH不足,体现在我有类型。

我们开始分析病人的 SERPING1桑格测序基因,但没有发现异常;我们怀疑我们的结果可能是由于大量DNA缺失可能不是被桑格不会amplifiable等位基因测序以来变体。研究这个问题,我们采用MLPA试验,一个敏感试验,允许检测45位点的DNA拷贝数的变化在一个相对简单的,半定量的pcr反应。使用这种技术,我们发现外显子5和6的DNA拷贝数的一半其他外显子一样 SERPING1基因(图 1(一)),这表明这两个外显子的杂合的删除。因为已经是一种常染色体显性遗传疾病,我们找到的杂合的 SERPING1删除的MLPA化验证实病人的病史。

外显子5和6都是短的序列(分别为204和140个基点)。鉴于其体积小,近距离(他们相距只有194个基点),我们推断这个删除是最有可能的一个大基因组DNA缺失跨在这两个外显子(即, 独联体阶段),而不是两个独立的外显子缺失5和6在不同的DNA链(例如, 反式阶段)。总长度,包括外显子后的前外显子内含子5和6,9547个基点。这段太大被常规PCR,放大,因此,确认删除,我们使用远程PCR扩增外显子4和7之间的部分。通过凝胶电泳来解决,我们观察到在不同长度两个PCR产品;一个是预期的分子大小的约10000个基点,而其他小PCR产品大约是8000个基点(数据未显示)。这个小PCR产品可能造成的变异等位基因的删除。值得注意的是,这两个PCR产品支持我们的存在预测病人携带大量DNA突变,包括外显子5和6 独联体阶段,而不是删除第5外显子,外显子6的删除单独的DNA链,这样会产生两个小PCR产品而不是一个。不幸的是,桑格测序只能处理大约1000个基点或序列短,所以大约8000 - bp PCR产品太大直接由这种方法进行测试。为了精确定位删除的边界,我们首先设计若干对引物在不同地区之间的外显子4和7扫描删除。一对引物(补充表 1)产生的杂合的PCR产品从病人的基因组DNA(图 1 (b))。使用这种凝胶净化方法,较小的PCR产物被孤立,受到Sanger测序(图 2)。从这个小PCR产品,预期从变异等位基因,我们能够确定删除职位之间的2009个基点,在基因组DNA(即12156年和14164年。NG_009625.1: g.12156_14164del2009)。这个大基因组DNA缺失已经失去了两个外显子5和6,导致的截断为252 - 500 -氨基酸蛋白质氨基酸蛋白质(即。删除272氨基酸和氨基酸替换24无意义)(图 3)。这种变化被认为是“致病”根据ACMG 2015指南( 18]。虽然一些报告已经讨论了外显子5和/或外显子6删除,这些报告删除大,大约4 - 6 kbps的大小( 19- - - - - - 23],这个特殊的2009个基点删除变体包括外显子5和6,我们尚未发现先前描述。从本质上说,分子的发现解释病人的C1-INH水平低的原因和功能。

患者的母亲患有类似症状(但更严重的病人相比)和显示实验室发现相媲美的病人(即。、血清C1-INH水平、母亲:< 0.03毫克/毫升,参考:0.224 - -0.387毫克/毫升;和C1-INH功能,母亲:0.09 U / mL,参考:0.7 - -1.3 U /毫升)。母亲的基因组DNA也受到MLPA化验和桑格排序,和相同的病人中发现的变异也在母亲(即发现。,NG_009625.1: g.12156_14164del2009),表明患者的突变是遗传自母亲,发现突变 不是新创对病人。然而,母亲的突变是否 新创仍然不确定样本的祖父母或母亲的兄弟姐妹没有可供进一步调查。

SERPING1突变高度异构,直到撰写的这份报告,超过500人已经描述了这种基因突变(http://www.hae.enzim.hu, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/和http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac)。大部分的报告病例(即。,approximately 70-75%) had point mutations that led to missense mutations or short insertions/deletions that caused frame-shift alterations, whereas larger structural mutations, such as indels, make up around 15-20% of all cases. Finally, the remainder 10% was splice-site and regulatory mutations. The data presented in this study illustrate the identification of a large DNA deletion of 2,009 bps that is carried by both the patient and her mother and provide insight into the etiology of their type I HAE.

的基因 SERPING1含有高密度的重复单元叫做“Alu元素”,一个转座的序列,是促进通过insertion-mediated删除或删除recombination-associated删除( 24, 25]。因为大多数Alu元素是内含子中发现4和6 ( 14),我们还研究了外显子5 - 6是否删除,我们发现可能与这些合金元素。我们位于周围的Alu序列NG_009625.1: g。121年56_14164del2009, but neither 5′ nor 3′ ends of the deletion breakpoints are intersected by Alu element sequences. The 5′ end of the deletion breakpoint is 16 bps from the nearest Alu element, but the 3′ end is approximately 1 kbps away from the adjacent Alu sequence (Figure 4)。鉴于Alu序列的偏僻的3′端删除断点,合金元素是否参与NG_009625.1的形成:g。12156 _14164del2009删除仍然难以捉摸,机制导致这2009个基点删除需要进一步调查。

外显子5和6的截断(总共一起编码115个氨基酸)显然造成了灾难性的后果C1-INH随后的表达其功能。这些大的有害影响杂合的删除涉及外显子5和/或外显子6支持其他类似突变之前被发现有患者( 19- - - - - - 23]。有趣的是,大部分的这些报道,早些时候描述大型删除影响外显子5和/或外显子6没有查明这些删除的断点位置,而是只有近似大小的删除一被发现,这些缺失也出现较大的规模比我们(即检测变体。,4 - 6 kbps) 19- - - - - - 23]。这些缺失的扩展没有进一步评估这些军团是由于技术和资源的限制。事实上,解剖大DNA突变通常是具有挑战性的,因为这个过程评估只是一个案例可以耗费时间,劳动密集型和昂贵的。显然,技术发展和获得更新的方法,比如下一代测序(门店),应该促进这种突变的边界位置的调查。最近的一份报告来自Loules et al 。讨论了自定义的实现门店测序整个平台 SERPING1基因在临床设置( 22]。然而,除了剩下的相对昂贵,门店也需要高度专业化的人员操作和数据分析,这使得它难以实现在大多数临床实验室。此外,上天是不完美的;它还被报道有困难在检测架带删除和插入 26]。此外,一个名为外显子的方法量化技术(EQT)检测大量基因重组 SERPING1也被描述( 27]。这种方法是基于定量复合PCR荧光短片段的方法,旨在提高搜索大型indels可能很难检测到Sanger测序( 20.]。作者讨论了EQT化验是敏感的,便宜,快速,更直接的方法研究大量DNA的改变,表现为一个有吸引力的大型indels方法调查 SERPING1。在我们的例子中,我们已经花了几个月的时间来测试许多被传统的双引物PCR和桑格测序解剖删除。重要的是,我们的报告是第一个精确定义的边界周围2009个基点删除外显子5和6 SERPING1。

为我们索引的病人和她的母亲,尽管它们共享相同的基因突变,他们的疾病进展似乎不同,与母亲表现出更严重的症状包括肠道水肿和情节的喉咙肿胀,这些是没有症状的,病人索引。也许这与他们的年龄差距,但确切原因为什么病人和她的母亲不显示相同的疾病表型程度尚不清楚。早些时候已经被记载在文学有相同的临床表现 SERPING1突变可以相差很大,这表明突变”以外的因素 SERPING1为临床表现的多样性( 8]。此外,一些研究试图确定临床表型和之间的相关性 SERPING1基因突变;然而,结果很大程度上是相互矛盾的 1, 8, 16, 28, 29日),试图解释临床表现基础上 SERPING1突变还没有成功。其他因素如环境刺激,荷尔蒙的影响,已经提出和表观遗传变化与疾病基因型交互直接疾病表现。此外,细胞分裂素分解代谢水平也被牵连作为一个潜在的预测参数有严重的 30.]。因此,导致有症状的确切机制仍然模糊,需要进一步检查。

发现这个大DNA缺失需要不同的分子方法的混合物。从我们的研究是另一个学习点总DNA突变就不会检测只有Sanger测序,一种广泛使用的方法,通常被认为是黄金标准的遗传研究。桑格测序是无效的描述很长一段的重复序列,在检测大型DNA突变是不可靠的,只能使用小的DNA片段的约1000个基点。在我们的例子中,成功的基因检查所需的其他分子技术的正确使用,如MLPA试验,正确和适当的底漆组合定义2009 - bp DNA缺失。调查人员需要充分意识到自己的长处和局限性的方法准确地检测某种基因的异常。

总之,我们的研究结果有进一步扩大的光谱 SERPING1的基因突变,并将有助于更好地理解C1-INH-HAE。