孟加拉国家畜Q热的血清学和分子证据

摘要

本研究的目的是了解孟加拉国某些特定地区家畜中Q热的兽群和动物水平流行情况。随机采集牛、绵羊和山羊的111份散装乳和94份血清，采用间接ELISA (iELISA)检测。对23例流产胎膜提取的DNA进行实时荧光定量PCR分析。散装奶和单个动物血清中iELISA阳性临界值分别为≥30%和≥40%。Q热在奶牛群体中的总体流行率为15.6%。Sirajganj地区奶牛Q热流行率明显高于Satkhira地区()．Q热在家畜中的血清总流行率为5.06%。Q热在绵羊中的血清流行率(9.52%)高于山羊(3.33%)和牛(3.57%)，差异无统计学意义。23例流产胎膜中，只有1例胎盘在rt PCR中呈阳性。Q热在孟加拉国所有三种重要的家养反刍动物中都存在。其血清阳性率较高，且有1只羊胎盘为rt PCR阳性，可能对绵羊流产有一定作用。

1.介绍

Q热是一种普遍存在的人畜共患病，由专性细胞内细菌引起柯克斯氏体属（C。）burnetii．除了南极洲，可能还有新西兰，世界各地都有报道[1，2］．主要储集层贝纳特氏立克次c .是牛，绵羊和山羊。然而，其他哺乳动物(人、猫、狗、啮齿动物、兔子、马、猪、骆驼、水牛和海洋哺乳动物)、蜱和其他节肢动物、鸟类、鱼类和爬行动物也报告了感染[3.，4］．反刍动物Q热的常见表现为流产、死产、早产和弱仔分娩[2］．事实上，这些临床表现通常在绵羊和山羊中观察到，Q热在牛中大多无症状。临床上感染的牛可能会发生不孕症、子宫炎和乳腺炎[5］．

在人类中，Q热大多无症状，但可能导致持续感染患者的急性或慢性疾病，如流感样疾病、肺炎、肝炎、脑膜脑炎、心肌炎、心内膜炎和慢性疲劳综合征，并可能导致孕妇流产和死产[2，6］．

动物Q热的诊断是基于细菌、细菌DNA或抗体的检测[7］．虽然这些细菌可以在无菌(无宿主细胞)培养基中生长，但分离是费时的，并且对实验室工作人员是危险的[8］．此外，Q热分离技术需要生物安全3级实验室(BSL-3)。大多数情况下,贝纳特氏立克次c .动物暴露可通过血清学试验间接筛查。CFT (OIE推荐试验)和ELISA(欧盟推荐试验)是用于此目的最常用的两种血清学试验。然而，CFT方案复杂，无法检测绵羊或山羊体内的抗体[9］．据报道，ELISA对Q热诊断具有高度敏感性和特异性[10］．此外，ELISA还可用于检测散装奶和单个动物血清中的抗体。细菌的DNA可以通过PCR检测[11］．

尽管Q热在世界各地都存在，但它在动物、人类、节肢动物、鸟类、野生动物和孟加拉国其他宿主中的状况尚不清楚，只有一份关于牛和山羊血清学证据的报告[12］．然而，奶牛的生殖疾病[13- - - - - -15是孟加拉国特有的。因此，本文的目的是确定奶牛和山羊的群体级Q热患病率，估计来自有流产史的牛、绵羊和山羊的群体级Q热患病率，并进行检测贝纳特氏立克次c .牛、山羊和绵羊流产胎膜的DNA。

2.材料和方法

2．1.牛奶样品

这项研究使用了之前两项研究的牛奶样本，这两项研究是在BAU的医学系进行的，Mymensingh 2202。在一项研究中，399个随机收集的散装牛奶样本进行了体细胞计数检查，其中94个样本用于本研究。所选奶牛群中繁殖失败的历史尚不清楚。在另一项研究中，17个牛奶环测试阳性的样本被送往比利时进行隔离布鲁氏菌，本研究也使用了。图中显示了这项研究中包括的孟加拉国各区1．

2．2．血清样本集合

血清样本从Mymensingh BAU医学系的血清库中收集。这些样本是随机收集的，用于研究2007年和2008年孟加拉国不同地区牛、绵羊和山羊的布鲁氏菌病[16］．我们从缅门辛格和舍尔普尔区的40头牛中收集了94份血清样本，其中58头牛在去年进行了流产(从牛主那里得知)。

2．3.胎盘DNA样本

从流产胎膜中提取23个DNA样本(5个来自牛，10个来自山羊，8个来自绵羊)用于检测布鲁氏菌spp也用于本研究。使用DNeasy旋转柱试剂盒(QIAGEN)根据制造商的方案提取DNA。

２.４.牧群和动物水平数据收集

动物级别的年龄、品种、性别和妊娠状态的数据和群体级别的群体规模、群体组成和群体位置的数据从可用的血清样本数据库中收集。

牛奶样品从牛乳房炎数据库中收集农场位置和奶牛群中泌乳奶牛数量。

2．5．间接ELISA试验

2.5.1。牛奶和血清样品的制备

牛奶和血清样品根据商用试剂盒的说明书制备。简单地说，从每个选定的牛群中收集10毫升牛奶，用于检测抗体贝纳特氏立克次c .曝光。样品离心，脱脂部分在−20°C保存，直到检测抗贝纳特氏立克次c .．检测前，牛乳样品用1:10的洗涤液稀释至1:5的浓度。将所选动物血清从血清库中取出，用稀释的洗涤液稀释至1:40 0。

2.5.2。测试程序

使用前将所有试剂取至18-26℃。这些试剂是通过轻轻地摇动来混合的。所有样品进行重复检测，取样品的光密度(OD)平均值，并减去阴性对照的OD值进行校正。牛奶和血清基础测试均使用CHEKIT Q Fever Antibody ELISA Test Kit (IDEXX, Liebefeld-Bern, Switzerland)进行贝纳特氏立克次c .第1期及第2期灭活抗原[10］．散装奶和动物个体血清中iELISA阳性临界值(S/P比)分别为≥30%和≥40%。

2.6。实时聚合酶链反应

real time (rt) PCR检测采用7500 rt PCR系统(Applied Biosystems)。当周期阈值(Ct) < 40时，视为阳性[17］．它是在比利时布鲁塞尔的兽医农化研究中心(CODA-CERVA)进行的。

2.7。统计分析

分析了畜群和动物水平因素与Q热流行的关系使用R 3.1.0 (The R Foundation for Statistical Computing 2014)进行测试。

3.结果

３．１．描述性统计

血清样本采集自40头牛群，这些牛群在过去一年中有三种家畜反刍动物中的任何一种的流产史。兽群规模从1只到20只不等，中位数为3只。13只牛，13只山羊，8只牛和山羊，6只绵羊。55.0%(22/40)畜群的流产物质被掩埋，其余畜群的流产物质被丢弃在田间或附近水体中。约35%(14/40)的农民晚上在家里养绵羊(7.5%)或山羊(27.5%)。

牛的年龄从4个月到12岁不等，中位数为6岁。山羊和绵羊的年龄范围和中位年龄分别为2.5个月至4岁和2年、1个月至4岁和8个月。牛中82.0%为母羊和本地羊，绵羊全部为本地羊，其中母羊占74.2%，山羊为母羊和黑孟加拉羊分别占80.0%和94.0%。牛群S/P阳性范围为41.4 ~ 123.0。

３.２．奶牛Q热的群级流行

总结了酶联免疫吸附试验存在的结果贝纳特氏立克次c .牛乳中的抗体见表1．Q热在奶牛群体中的总体流行率为15.6%(95%置信区间(CI): 9.4-23.8)1)．Q热在奶牛群中的分布情况见表2．Sirajganj地区Q热流行率(34.6%)明显高于Satkhira地区()．尽管统计上不显著，但与Sahiwal杂交(13.7%)相比，只有Friesian杂交(13.7%)和Sahiwal和Friesian杂交(27.8%)的牧群Q热患病率相对较高。

３．３．Q热在牛、山羊和绵羊中的血清流行病学

总结了酶联免疫吸附试验存在的结果贝纳特氏立克次c .血清样本中抗体见表3.．在检测的94份血清样本中，15岁(10只绵羊和5只山羊)动物的血清低于6个月(2只血清阳性)，这在血清流行率(孕产妇免疫)的估计结果中被排除。Q热在家畜中的血清总流行率为5.06% (95% CI: 1.63-13.14)。Q热疑似病例占3.79%，Q热阴性病例占91.13%。阳性S/P范围为42.70 ~ 49.80%。家畜Q热血清流行率分布见表4．羊Q热的血清流行率(9.52%，95% CI: 1.67 ~ 31.83)高于山羊(3.33%，95% CI: 0.17 ~ 19.05)和牛(3.57%，95% CI: 0.18 ~ 20.24)，但差异无统计学意义。Q热的血清流行率因性别、妊娠情况和研究地区而异，但无统计学意义。

4种Q热血清阳性家养反刍动物的人口学特征见表5．两个血清阳性的羊来自同一个地方(union / subupazila of Mymensingh Sadar Upazila/分区)。

3．4．实时PCR结果

伯纳特氏立克次氏体仅从一只羊的胎盘中检测到DNA。其余22个样本均为阴性。

4.讨论

本研究采用间接ELISA法测定了牛、山羊和绵羊群体Q热流行率和Q热血清流行率。Q热在散装牛奶中的总体流行率为15.6%，表明Q热是孟加拉国奶牛群体中存在的一种疾病。研究中的牛群来自孟加拉国的主要奶区，如Sirajganj、吉大港和Satkhira区(见图)1)．样本量非常小，样本不代表孟加拉国的奶牛场。这也是本研究的局限性。由于缺乏资金，本研究无法纳入更多的样本。因此，我们获得的Q热牧群水平流行率可能不能代表该研究地区奶牛群体中该疾病的真实状况。来自世界不同角落的报告显示，Q热的群体流行程度差异很大，但要高得多(57.8至78.6%)[18- - - - - -21］．奶牛通常是慢性感染Q热和脱落贝纳特氏立克次c .在牛奶里[22］．此外，受慢性感染的奶牛是人类感染的最主要来源[1］．人类感染的另一个重要来源是在没有安全保护措施的情况下对流产小反刍动物的胎儿及其体液和胎盘的操纵。由于Q热是一种人畜共患疾病，它存在于孟加拉国的动物中，因此也应该存在于人类中。由于缺乏报告、认识和人类中这种疾病的非特异性流感样症状，它可能被忽视，在人类诊断实验室中仍未得到诊断。由于缺乏来自动物的报告，医生也不知道这种疾病在人类。因此，医生通常不会将流感样病例转诊为Q热诊断。在人类和动物中，吸入环境中存在的细菌是感染的主要途径。因此，乳制品工人、动物饲养员和来历不明的发热病例应定期检测Q热。此外，食用受污染的生奶可能会引致人类感染[1］．事实上，孟加拉人很少喝生奶。

我们只检测了散装牛奶，这并不允许识别单个奶牛感染了Q热。但是，在疾病监测系统中对畜群的筛选是非常有用的。一项包括孟加拉国代表性奶牛群的大型流行病学研究将有助于揭示孟加拉国该病的牛群水平状况。在三个研究区域中，Sirajganj的奶牛群Q热流行率明显高于Satkhira区。Sirajganj地区的牛管理系统与孟加拉国其他地区略有不同。在旱季，牛自由地吃草，并在牧场(“巴坦”)呆近6个月(12月至5月)。因此，在这一时期，不同主人的牛之间发生了大量的混种。来自不同饲养者的牛的混种可能会促进该地区奶牛群的感染传播。在一些牧群中，羊的存在在那个时期也被注意到。旱季的环境条件可能对细菌的存活起作用，也会促进细菌在动物之间的传播。 Similarly, higher prevalence of Q fever in loose housing system was also reported by Paul et al. [10］．卡普阿诺等人[23[也报道了冬季饲养但春季饲养的猪群的Q热血清流行率相对高于长期饲养的猪群。与其他传染病一样，据报告Q热与群体规模增加显著相关[23，24］．在本研究中，相比之下，Q热的流行率在较小的群体中略高。然而，这种差异在统计学上并不显著。有弗里斯杂交的牧群和同时有萨希瓦尔和弗里斯杂交的牧群Q热患病率较高，但差异无统计学意义。其他作者也报告了荷斯坦犬Q热流行水平显著较高[10，23］．

我们已经观察到相对较高的Q热血清流行绵羊比牛和山羊。其他作者也报告了类似的观察结果[25，26］．据报告，Q热的流行率随着动物年龄的增加而显著升高[27- - - - - -29］．我们还观察到血清阳性动物的年龄≥10个月。

在我们的研究中，动物的血清样本来自于前一年有流产史的兽群。4例血清阳性病例中2例为羊，提示Q热可能在羊流产中起一定作用。我们的rt PCR结果也支持这一假设。胎盘的rt PCR Q热阳性表明与该细菌有接触。证实由…引起的流产伯纳特氏立克次氏体对流产胎儿和胎盘的组织病理学检查是必要的。Berri等人也报道了羊Q热的血清流行率显著升高[30.］．怀孕的免疫抑制作用可能是增加胎盘中有机体的增殖，从而提高血清流行率的原因[31］．

本研究表明，Q热在孟加拉国三种重要的家反刍动物中均存在。其血清阳性率较高，且有1只羊胎盘为rt PCR阳性，可能对绵羊流产有一定作用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

本研究得到了BAU动物育种遗传司和NST管理局种牛生产项目(SPGR)的资助。作者感谢Mymensingh BAU医学系的Taohidul Islam教授提供了大量牛奶样品，并感谢比利时布鲁塞尔兽医农化研究中心的David Fretin博士在实时PCR方面的支持。

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