文摘

背景。Nrf2最近报道调节抗氧化基因和细胞氧化还原监管者内皮祖细胞中高度表达。然而,它的作用在ox-LDL-induced EPC氧化应激和细胞凋亡没有充分说明。方法。内皮祖细胞分离人外周血单核细胞治疗与不同浓度的ox-LDL, Keap1核,和一个特定p38 MAPK抑制剂SB203580然后用来测定胞质Nrf2,核Nrf2 NAD (P) H:醌氧化还原酶1 (NQO1)和伯灵顿/ bcl - 2水平与免疫印迹,NQO1 mRNA水平与rt - pcr、ROS水平与H2DCF-DA损失/中断与JC-1线粒体膜电位,细胞凋亡与膜联蛋白V和π,迁移transwell室,并与人工基底膜管的形成。结果。ox-LDL减少核Nrf2 /组蛋白H3细胞质Nrf2 / GAPDH比率,NQO1信使rna和蛋白质含量。ox-LDL增强活性氧产量,引起膜电位的损失,和增加细胞收缩,致密的核,和内皮祖细胞的细胞凋亡。Keap1 siRNA增加Nrf2核易位,NQO1 mRNA转录,蛋白质表达和阻止活性氧生成和JC-1单体的形成。ox-LDL增加p38的激活。SB203580显著消除ox-LDL诱导抑制Nrf2核易位,萧条NQO1 mRNA转录,ROS的生成,形成JC-1单体在内皮祖细胞。Keap1 siRNA下降的伯灵顿/ bcl - 2比例增加了ox-LDL内皮祖细胞。ox-LDL EPC迁移和下降管形成。Keap1 siRNA保存内皮祖细胞的迁移和管形成。结论。ox-LDL激活内皮祖细胞p38 / Keap1 Nrf2通路诱导氧化应激,障碍,和内皮祖细胞的细胞凋亡。

1。介绍

冠状动脉和脑动脉阻塞引起的动脉粥样硬化斑块形成和破坏的主要原因之一是死亡率和发病率在发达国家和现代社会。高胆固醇血症诱导损伤的血管内皮完整性被认为是最初引发动脉粥样硬化的发展(1]。脂质氧化,尤其是oxidized-low密度脂蛋白(ox-LDL),起着至关重要的作用在动脉粥样硬化的形成和发展。ox-LDL诱发动脉粥样硬化斑块的发展拘谨地通过增加氧化应激和内皮细胞损伤和减少恢复受损的内皮细胞在缺血组织(2]。

通过导航网站的内皮损伤,分化为成熟内皮细胞,并合并到内皮细胞,内皮祖细胞(epc)起源于造血干细胞被认为发挥重要作用内皮再生和血管修复。据报道,抗氧化蛋白高表达得多比在内皮细胞(内皮祖细胞3]。然而,最近的研究表明,内皮祖细胞和干细胞不同,仍容易受到环境危险因素,尤其是氧化应激,丰富的修复缺血环境(4]。

核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)控制许多基因的表达编码细胞氧化还原监管者和抗氧化蛋白的抗氧化反应元素绑定(是)5]。Nrf2中起关键作用的氧化还原平衡,调节脂质代谢,在动脉粥样硬化和泡沫细胞的形成6]。Nrf2最近已经作为一个新的潜在的药物目标治疗心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、癌症和呼吸道疾病(7]。Nrf2活动是由细胞内信号在多个层面,包括基因转录,kinase-mediated磷酸化,核走私、Kelch-like ECH-associated蛋白1 - (Keap1)依赖和Keap1-independent蛋白酶体降解,和DNA结合8]。然而,核易位对激活Nrf2至关重要和随后的抗氧化剂表达式(9]。在低氧化条件下,Nrf2保留在细胞质中通过结合Keap1和保持在低水平,Keap1-dependent泛素化和蛋白酶体降解系统。在某些细胞类型,ox-LDL报道规范Nrf2激活和抗氧化剂和氧化应激反应基因的表达(10]。然而,是否ox-LDL激活内皮祖细胞Nrf2及其相关信号的影响尚未完全。在这项工作中,我们调查的影响ox-LDL内皮祖细胞的激活Nrf2水平核和内皮祖细胞的生物学功能,包括迁移和血管生成,以及它与氧化应激和细胞衰老之间的关系。一个预印本曾发表(11]。

2。材料和方法

2.1。人类内皮祖细胞的制备

这项研究是在综合医院的机构审查委员会批准的中央剧院的命令。内皮祖细胞是准备我们的以前的报告12]。外周血单核细胞与健康志愿者外周血样本。隔离后,总单核细胞( 细胞/毫升)镀在培养皿中被涂上人类纤连蛋白(F0895;Sigma-Aldrich),然后保存在内皮基底介质(循证医学,cc - 3162;Lonza,瑞士)补充了能量法单”,10 ng / mL VEGF (orb178366;Biorbyt,密苏里州,美国)和20%胎牛血清的边后卫。培养基是每三天更换一次。经过8天的文化,贴壁细胞被贴上DiI-acLDL (L3484,表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记凝集素从ulex europaeus凝集素(L9006;Sigma-Aldrich;默克公司)。细胞被double-positive DiI-acLDL和FITC-labeled凝集素被确认为内皮祖细胞,先前报道。

2.2。ox-LDL准备

低密度脂蛋白是分开健康志愿者的等离子体禁食12小时后被用来ox-LDL做好准备。低密度脂蛋白的蛋白质含量是由洛瑞法修改。低密度脂蛋白与CuSO4孵化(10μ在37°C M) 24小时,然后透析的无菌溶液氯化钠(150毫米),EDTA(1毫米)和多粘菌素B (100μg / mL) (pH值7.4)两次。琼脂糖凝胶电泳和代硫代巴比土酸被用来证实ox-LDL的存在。

2.3。Keap1沉默的核

内皮祖细胞与核转染使用Lipofectamine™2000(英杰公司有限公司,卡尔斯巴德,CA)转染试剂根据制造商的指示。的目标序列Keap1-siRNA如下:strand-5感 - - - - - -GGAGUACAUCUACAUGCAU-3 ,和反义strand-5 - - - - - -AUGCAUGUAGAUGUACUCC-3 ,和炒核控制。Keap1-siRNA转染后6小时,取代培养基,然后内皮祖细胞培养另一个24小时到达沉默阶段。Keap1击倒效率是通过免疫印迹分析进行验证。

2.4。细胞质和核蛋白质提取

epc confluency增长到80%,受到各种治疗方法,然后用冰冷的磷酸盐(PBS)洗。内皮祖细胞的细胞质蛋白质和核酸蛋白质提取使用核蛋白质制备装备和胞质蛋白制备工具包(P1200;北京Applygen技术有限公司,北京),分别根据制造商的指示。与3毫升冰冷的PBS轻轻刮后,内皮祖细胞种植在10厘米盘在600 g离心10分钟在4°C。小心地吸气上层清液,epc resuspended 200μL冰冷CEB-A混合和蛋白酶抑制剂,孵化15分钟在冰上允许内皮祖细胞膨胀,然后添加11μL冰冷的CEB-B。内皮祖细胞是大力涡10和16岁离心机,000 g 5分钟在4°C。上层清液(细胞质分数)是仔细地吸气和储存在-80°C。球团矿resuspended 200μL冰冷的内混合和蛋白酶抑制剂,积极漩涡。悬架是放在冰16岁40分钟,然后离心,000克15分钟在4°C。上层清液(核提取物)也存储在-80°C整除。上层清液的蛋白质浓度测定的比色测定(Bradford)。

2.5。免疫印迹分析

细胞质和核蛋白质样本解决12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和在硝化纤维膜electrotransferred (IPFL00010;微孔)。膜是孵化主要抗体的稀释1:100 - 1:1000年在4°C为12小时,洗了TBS / T (Tris-buffered盐水含有0.2%渐变20),暴露于HRP-conjugated抗体或anti-mouse二级抗体(1:5000)1小时,分别然后可视化增强化学发光检测试剂。分析了蛋白质的相对强度乐队Image-Pro + 6.0(美国马里兰州银泉的媒体控制论)。抗体用于本研究如下:anti-Nrf2 (Ab62352;Abcam), anti-Histone H3 (PAB33309;BIOSWAMP)、anti-glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH FNab03345;武汉好生物科技有限公司),anti-NAD (P) H:醌氧化还原酶1 (NQO1) (Ab80588;Abcam), anti-Bax (FNab00810;武汉好生物科技有限公司),anti-Bcl-2 (658701; BioLegend), anti-Keap1 (Ab139729; Abcam), anti-p-p38 (4511 T; Cell Signaling Technology), anti-p38 (622403; BioLegend), and anti-beta-actin (PAB36265; BIOSWAMP).

2.6。rt - pcr分析

收集每一组的治疗内皮祖细胞总RNA提取使用试剂盒。总执行rt - pcr反应体积的10μ0.25 L,包括10 ng cDNA、μ正向和反向引物,和5μL SYBR-Green qPCR掌握混合。放大的基因和所使用的引物如下:NQO1(前进,CGCAGACCTTGTGATA和扭转,TGGCAGCGTAAGTGTA)和GAPDH(前进,ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG和扭转,GCCATCACGCCACAGTTTC)。所需数量的周期来生成一个给定阈值的信号(Ct)被记录为每个样本。每个样本的mRNA转录水平进行了分析使用2 -ΔΔCq。

2.7。测量细胞内活性氧(ROS)

细胞内ROS水平使用荧光探针检测到2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorofluorescin (DCFH-DA D6883;美国Sigma-Aldrich)如前所述13]。暴露在指定的治疗后,内皮祖细胞被孵化与5毫米DCFH-DA 37°C在黑暗中20分钟,然后洗了三次与血清EGM-2媒介。代表ROS生成的图像捕获使用徕卡DMIL LED-inverted荧光显微镜(德国徕卡)。样品没有干预作为消极的控制。ROS水平的治疗组表示为相对荧光强度与对照组相比。

2.8。分析线粒体跨膜电位(MMP)

MMP的分析是使用5,执行5 ,6、6 - - - - - -tetrachloro-1 1 ,3,3 - - - - - -tetraethyl-imidacarbocyanine碘(JC-1)的聚合反映内线粒体膜电位。当MMP的减少,JC-1选择性地进入线粒体,可逆地改变它的颜色从红色变为绿色。治疗后,内皮祖细胞与10孵化μg / mL JC-1 (T4069;美国Sigma-Aldrich)在37°C 15分钟,然后用无血清EGM-2介质三次。荧光色是监控使用徕卡DMIL LED-inverted荧光显微镜(德国徕卡)。分析从六个随机领域Image-Pro + 6.0(美国马里兰州银泉的媒体控制论),ΔΨ米每组计算与绿色荧光细胞的比例与红+绿荧光细胞。

2.9。细胞凋亡检测

内皮祖细胞的细胞凋亡是量化使用膜联蛋白V-FITC / propidium碘(π)凋亡工具包(40302 es20;美国Yeasen)根据制造商的指示。干预后,内皮祖细胞收获和清洗,然后悬浮在1×绑定缓冲和100μ5 L细胞悬液的混合μL(π和5μL的膜联蛋白V-FITC。在黑暗中孵化15分钟后,内皮祖细胞的细胞凋亡是衡量使用流式细胞分析仪(美国贝克曼CytoFLEX年代)。

此外,核的形态变化凋亡内皮祖细胞被4量化 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI D9542;美国Sigma-Aldrich)染色。治疗后,加入一定量100 ng / mL DAPI文化媒体和孵化20分钟的37°C。DAPI-staining后,可行的细胞显示正常核大小和均匀核荧光,而凋亡内皮祖细胞显示浓缩,骨折,或扭曲的细胞核。核固缩的手动计算在6个随机在每个字段和记录为总epc核数的百分比。

2.10。内皮祖细胞的迁移分析

EPC迁移与Boyden室被transwell趋化作用分析。在每个24-well板, 内皮祖细胞是聚碳酸酯的顶面上镀transwell过滤器(8μ孔隙大小,MCEP24H48;美国马萨诸塞州微孔)。EBM-2中含有10%的边后卫被添加到众议院。然后,生长介质被新的取代包含ox-LDL或Keap1 siRNA……。经过24小时的文化,nonmigrative细胞室上部轻轻擦洗,细胞在膜表面的底部和4%多聚甲醛固定,沾0.5%结晶紫溶液(PAB180004;Bioswamp,武汉,中国),然后计算显微镜下(德国徕卡DMIL LED,徕卡公司)。迁移后的内皮祖细胞的数量是决定从5随机100 x字段为每个组,并且每个实验进行了一式三份。

2.11。EPC管形成分析

使用人工基底膜管的形成进行分析(356237;康宁,德国)。基底膜基质溶解在4°C, 100μL加入48-well每口井的盘子,然后孵化为30分钟37°C。干预后, 每被播种到人工基底膜和内皮祖细胞培养在4小时37°C的5%的股份有限公司₂。capillary-like结构的图像捕获在显微镜下5点为每组随机100 x放大字段。分枝点的平均数字显示的形成管数,而使用Image-Pro + 6.0(美国马里兰州银泉的媒体控制论)。

2.12。统计分析

所有的数据都表示为 或百分比。统计分析多个组之间用单向方差分析,并比较两组进行使用未配对的学生的 - - - - - -测试。 被认为是统计学意义。

3所示。结果

3.1。EPC形态学和识别

循证医学文化、细胞24小时后开始坚持板墙。殖民地被观察到在48小时内,和大多数的殖民地出现在4天。8天后文化、纺锤形或cobblestone-like附着细胞观察。大多数这样的贴壁细胞uptook Dil-ac-LDL并积极沾UEA-I(数字1(一)- - - - - -1 (d))。

3.2。ox-LDL抑制Nrf2核易位

调查的影响ox-LDL Nrf2核易位在内皮祖细胞,细胞质Nrf2 (c-Nrf2)水平和核Nrf2 epc (n - Nrf2)水平治疗后不同浓度的ox-LDL测定免疫印迹。核20 Nrf2下降到21.9%的水平μ12小时(g / mL ox-LDL治疗数据2(一个)和2 (b))。分析n-Nrf2和c-Nrf2可能进一步确定Nrf2位置的影响,从而确定ox-LDL Nrf2保护和核易位。比较n-Nrf2 /组蛋白H3 c-Nrf2 / GAPDH比率在所有实验小组表明,10μ克/毫升,20μg / mL ox-LDL分别减少Nrf2核引起的水平66.1%和71.9% ( ,图2 (b)),类似c-Nrf2水平。然而,Nrf2的mRNA水平没有影响ox-LDL治疗,表明ox-LDL已故n-Nrf2水平可能增加的赖氨酸乙酰化和Nrf2泛素化。评估是否Keap1-dependent Keap1-independent蛋白酶体降解的Nrf2涉及ox-LDL诱导,差别Nrf2对这些击倒Keap1的小干扰rna进行Keap1的转染。Keap1蛋白水平有效地减少70%的治疗24小时后Keap1-siRNA免疫印迹试验(数据就证明了这一点2 (c)和2 (d))。ox-LDL-treated组相比,核Nrf2水平大幅增加Keap1击倒+ ox-LDL治疗组(数字2 (e)和2 (f))。这些结果表明ox-LDL可能减少Nrf2核级Keap1-dependent Nrf2退化和抑制核易位。

3.3。在epc Nrf2介导ox-LDL-Induced NQO1抑郁

NQO1基因的一个典型的直接目标Nrf2施加在减轻内皮祖细胞损伤保护作用[14]。找出的影响ox-LDL在epc Nrf2目标基因的表达,我们集中特征——和时间调节ox-LDL NQO1 mRNA的内皮祖细胞通过rt - pcr。结果表明,在10μg / mL ox-LDL治疗,NQO1转录水平急剧下降到67.9%在6小时,达到至少39.4%的18个小时,回到控制水平48小时后(图2 (g))。一致,NQO1转录水平达到一个最低水平后20μ(图g / mL ox-LDL治疗18个小时2 (h))。此外,预处理的epc Keap1 siRNA ox-LDL前24小时治疗导致显著增加NQO1转录相比那些没有Keap1核(图2(我))。

确定ox-LDL NQO1蛋白表达水平的影响,我们进行了免疫印迹分析NQO1蛋白质。在epc挑战20μg / mL ox-LDL 24小时,NQO1蛋白质水平显著降低,预处理的小干扰rna转染内皮祖细胞与Keap1 ox-LDL治疗前24小时(水平显著提升NQO1数字2 (j)和2 (k))。这些结果表明,ox-LDL NQO1水平降低在转录和蛋白质水平的时间-浓度的方式在内皮祖细胞,这可能是涉及Nrf2 Keap1-dependent监管。

3.4。ox-LDL抑制Nrf2通过p38信号激活

先前的研究表明,内皮祖细胞氧化还原是由几个信号转导途径。增殖作用的蛋白激酶(MAPK) p38最近确认为一个调制器体外增殖的祖细胞扮演着原始的角色在细胞氧化还原的变化(15]。在各种人类细胞系,MAPK p38据报道,抑制Nrf2激活通过促进稳定Keap1之间的交互和Nrf2 Nrf2崩溃的增加(16]。阐明分子机制的抑制Nrf2 / NQO1 ox-LDL,我们评估的影响ox-LDL MAPK的磷酸化p38内皮祖细胞与免疫印迹。结果表明,20μg / mL ox-LDL治疗2小时显著增加p38的激活(数字2(左)和2(米))。进一步了解p38 MAPK在内皮祖细胞氧化还原调控的作用,我们调查的影响p38 MAPK在epc Nrf2核易位和NQO1表达式,使用特定p38 MAPK抑制剂SB203580。结果表明,1μM SB203580预处理明显消除ox-LDL-induced抑制Nrf2核转位(数字2 (n)和2 (o))和NQO1 mRNA转录水平在内皮祖细胞(图2 (p))。然而,Keap1的信使rna和蛋白质水平尚未受到SB203580。这些结果表明ox-LDL抑制Keap1 / Nrf2抗氧化防御通路可能通过激活信号通路。

3.5。Nrf2 ox-LDL-Induced EPC介导的氧化应激和细胞凋亡

确定Nrf2的角色和p38 MAPK在epc ox-LDL-induced氧化应激,ROS生成被检测评估的氧化预处理后在荧光显微镜下DCFH-DA epc和Keap1 siRNA SB203580 ox-LDL治疗前。DCFH-DA染色显示,内皮祖细胞的治疗与ox-LDL 6小时显著增强内皮祖细胞的活性氧产量。然而,预处理和小干扰rna或SB203580 Keap1显著预防ox-LDL诱导内皮祖细胞ROS生成。小干扰rna或预处理的epc Keap1 SB203580显著降低内皮祖细胞的活性氧水平(从301.2%减少到121.6%和142.1%,分别比较ox-LDL集团, ,数据3(一个)和3 (b))。这些结果表明ox-LDL刺激后内皮祖细胞的活性氧产量的增加主要归因于Nrf2的失活和p38的激活。

早期细胞凋亡的关键事件之一是MMP的损失/中断,最终导致的启动和激活凋亡级联(17]。ox-LDL的影响内皮祖细胞MMP与JC-1染色荧光显微镜下进行评估。治疗内皮祖细胞与20μg / mL ox-LDL显著增加形成的单体的JC-1线粒体绿色荧光,表明膜电位的损失(图3 (c))。小干扰rna和Keap1 SB203580预处理降低JC-1单体(图的形成3 (d)),这表明Nrf2激活和抑制p38保护内皮祖细胞凋亡。

ox-LDL对内皮祖细胞的影响生存与手动检查计数DAPI染色固缩的核和流量仪分析膜联蛋白V和π。膜联蛋白V / PI双染色显示,内皮祖细胞治疗与20μg / mL ox-LDL 6小时凋亡比例从9.13%上升到44.30%(图4(一)),同时增加细胞收缩和致密的原子核(数字4 (b)和4 (c))。然而,预处理SB203580 ox-LDL-induced EPC凋亡比例降低到22.03%(数据4(一)- - - - - -4 (c))。

凋亡通路是否涉及ox-LDL-induced EPC凋亡,proapoptosis因子的表达,伯灵顿,和prosurvival因素,bcl - 2,与免疫印迹检测。如数据所示4(一)和图4 (b)ox-LDL增加2倍的伯灵顿表达式,同时降低30%的bcl - 2表达,最终导致一个近似的伯灵顿/ bcl - 2比4倍增加内皮祖细胞,而这些影响都被小干扰rna转染Keap1的预处理(数据4 (d)和4 (e))。这些结果表明,激活Nrf2显著抑制ox-LDL-induced ROS生产,线粒体膜电位降低,激活凋亡通路和细胞凋亡。

3.6。通过Nrf2 ox-LDL抑制EPC迁移和管形成通路

内皮祖细胞的迁移活动后ox-LDL刺激使用transwell室试验检测。transwell钱伯斯是37°C孵化器孵化24小时。迁移后的内皮祖细胞沾1%结晶紫溶液和计入5随机大功率(100×)显微镜领域。结果表明,治疗ox-LDL显著降低内皮祖细胞的迁移能力(图4 (f))。测试的角色Nrf2信号损失的EPC迁移活动,Keap1 siRNA了0.5小时前预处理的ox-LDL EPC文化媒体。结果表明,Keap1 siRNA保存内皮祖细胞的迁移能力(图4 (h))。

本研究调查的影响ox-LDL和Keap1 siRNA内皮祖细胞的血管生成执行管形成试验。管状结构的形成是减少ox-LDL-treated内皮祖细胞,而预处理Keap1 siRNA显著增加内皮祖细胞(数据的管形成4 (g)和4(我))。结果表明,激活p38减毒的抑制ox-LDL EPC管形成。

4所示。讨论

动脉粥样硬化导致许多血管疾病被认为是启动和促进血管内皮损伤和氧化应激(18]。内皮细胞通常工作作为第一防线在血管与血液中的有害物质。然而,当血管内皮细胞暴露于过多的外部刺激,他们的结构和功能受损(19]。内皮祖细胞分化为成熟内皮细胞的固有能力发挥重要作用在缺血后血管修复(20.]。ox-LDL积累在血管壁促进动脉粥样硬化斑块的形成和发展,诱导血管内皮细胞凋亡和EPC功能受损21]。据报道,抗氧化基因高表达得多比内皮细胞(内皮祖细胞22]。然而,在一些病理条件下,内皮祖细胞中活性氧的生产过剩导致氧化应激,促进脂质过氧化反应,然后导致EPC衰老和功能障碍23]。然而,在目前的研究中,我们发现ox-LDL EPC活性氧产量的增加,线粒体功能障碍,和细胞凋亡。线粒体呼吸链被认为是细胞中活性氧的主要来源(24]。一般来说,从线粒体复合物泄露电子部分减少氧气O₂^{- - - - - -}并将约1 - 2%的总耗氧速率成ROS (25]。细胞的氧化还原体内平衡是取决于之间的平衡的生产从线粒体活性氧和抗氧化基因的表达。在目前的研究中,ox-LDL氧化应激诱导的内皮祖细胞可能通过线粒体功能障碍和抑制抗氧化系统。此外,受损的内皮祖细胞之间的平衡影响内皮细胞的损伤和修复,加速动脉粥样硬化的形成。这些结果与先前的报道一致,ox-LDL产生了有害影响内皮祖细胞的生存能力和通过活性氧生成和功能障碍的抗氧化酶(26]。

Nrf2广泛表达在细胞与动脉粥样硬化发病机制密切相关(27]。在内皮细胞,激活Nrf2据报道,改善生存,内皮细胞的增殖,血管生成函数体内和体外28]。激活Nrf2现在被广泛认为是由Keap1它充当一个细胞内的传感器为内生和外生亲电试剂和氧化剂29日]。氧化应激条件下,Nrf2释放Keap1的细胞质,把进入细胞核,结合,诱导抗氧化基因的表达,如NQO1和HO-1 [30.]。许多研究表明,这些抗氧化基因的增加同步激活后Nrf2通路(31日]。然而,HO-1降低氧化应激通过减少细胞中血红素(32)可能不是内皮祖细胞的主要抗氧化途径,由于内皮祖细胞的低血红素的生产。NQO1作为胞质氧化还原酶起着至关重要的作用在调节ROS水平。NQO1催化氧化NAD (P) H NAD (P) +和压低了ROS水平通过抑制醌类进入一个电子减少ROS和半醌自由基(33]。这强大的抗氧化蛋白迅速消除活性氧积累和维护细胞氧化还原平衡。在目前的研究中,我们发现ox-LDL减少核易位Nrf2也NQO1内皮祖细胞的转录和蛋白质水平的表达时间和浓度。这些结果与以前的报告中一致ox-LDL诱导内皮功能障碍通过抗氧化蛋白的抑郁症(34]。然而,我们还发现,ox-LDL Nrf2 mRNA转录水平没有影响,这表明ox-LDL可能抑制Nrf2不是通过抑制Nrf2 mRNA转录。进一步定义的角色Keap1 Nrf2活动的监管,我们使用小干扰rna调节Nrf2 Keap1的信号。结果表明,Keap1 siRNA增加NQO1 mRNA转录和蛋白表达水平。它建议Keap1-dependent Nrf2退化和抑制Nrf2核易位参与的抑制Nrf2 /由ox-LDL系统。然而,在生理条件下,抗氧化基因的高表达和内皮祖细胞中活性氧的产量很低,Nrf2的ROS-driven离解Keap1可能不是主要的通路调节Nrf2在内皮祖细胞的活性。

的MAPK p38信号通路激活的许多生理刺激和细胞外环境因素在动脉粥样硬化的发病机制中起着重要作用[35]。MAPK信号p38据报道,诱导内皮细胞凋亡和炎症(36]。据报道,ox-LDL引起的增加p38 MAPK磷酸化和巨大的ROS生成人类脐静脉内皮细胞(37),而之前的研究显示,p38 MAPK抑制Keap1 / Nrf2 /通过Nrf2稳定的监管途径(38]。在目前的研究中,我们发现ox-LDL显著激活p38和p38 MAPK逆转的抑制抑郁症Nrf2核易位和NQO1 ox-LDL mRNA转录的内皮祖细胞。这些结果表明,ox-LDL抑制Keap1 / Nrf2抗氧化防御通路可能通过激活信号通路。本研究还发现,在内皮祖细胞的抑制p38 MAPK显著逆转ox-LDL-induced ROS生成,线粒体功能障碍,和细胞凋亡。结果表明,p38 / Keap1 / Nrf2通路中发挥核心作用的控制ox-LDL-induced EPC氧化应激和细胞凋亡。p38 / Keap1 / Nrf2通路可以被认为是一个不同的通路ox-LDL监管Nrf2活动这类抗氧化基因高表达的细胞。它解释了为什么抗氧化防御系统不工作时ox-LDL诱导内皮祖细胞中活性氧的生产过剩。

几项研究表明,内皮祖细胞的迁移和管形成受损在许多病理条件(39]。氧化应激一直参与调节内皮祖细胞的细胞凋亡和功能障碍40]。先前的研究表明,ox-LDL-induced EPC氧化应激通过特定受体的激活和促炎因子(41]。炎症通路和氧化应激是两个重要的因素在EPC的规定功能和命运42]。p38的参与途径和ROS在炎症反应在许多研究报道(43]。可以推测,在ox-LDL治疗后内皮祖细胞,升高的炎症可能增加活性氧的生产和细胞凋亡。然而,这些间接影响不应该ox-LDL EPC氧化应激诱导的原则途径,为其长期的传导过程,也没有在本研究进行测试。从理论上讲,ox-LDL-induced EPC可以对抗氧化应激激活的抗氧化防御系统。但在目前的研究中,我们发现ox-LDL抑制抗氧化信号Nrf2 / Keap1的upregulation Nrf2通过Keap1击倒EPC减少ROS生成和线粒体功能障碍和改善内皮祖细胞的迁移能力和管形成。这些结果与ox-LDL改变之间的均衡氧化损伤和抗氧化防御系统的活动而且诱导活性氧的积累和内皮祖细胞的细胞凋亡。这些结果与先前的报道一致,缺乏Nrf2减毒生存、增殖和血管生成的函数内皮祖细胞(44]。

伯灵顿和bcl - 2已确定参与细胞凋亡的控制或执行(45]。伯灵顿permeabilizes线粒体的外膜和成功proapoptotic分子细胞色素c的释放。胞质细胞色素c与许多proapoptotic因素结合,创建一个被称为apoptosome蛋白质复合体。bcl - 2然而,伯灵顿的影响可能被抑制,所以伯灵顿/ bcl - 2比率与线粒体功能障碍导致的内在凋亡途径(46]。此外,伯灵顿/ bcl - 2比例的增加导致caspase-3的激活,从而决定了细胞的敏感性进行细胞凋亡(47]。在凋亡细胞,caspase-3可以激活内在(线粒体)和外在(死亡配体)途径48]。目前的研究表明,ox-LDL增加伯灵顿表达和减少bcl - 2表达,导致内皮祖细胞内伯灵顿/ bcl - 2比例明显增加。在目前的研究中,证实了内皮祖细胞的细胞凋亡流仪分析膜联蛋白V和π,和ox-LDL-induced EPC细胞凋亡的机制被证明是内在的激活凋亡通路伯灵顿/ bcl - 2。这些影响被部分屏蔽Keap1击倒。这些结果表明,upregulation Nrf2信号抑制proapoptotic信号通路的激活被ox-LDL诱导。

5。结论

这些结果表明,ox-LDL诱导EPC Keap1依赖Nrf2退化和抑制氧化应激的核易位。治疗ox-LDL抑制Keap1 / Nrf2抗氧化防御通路可能通过激活信号通路。p38 / Keap1 / Nrf2通路中发挥了核心作用ox-LDL-induced ROS生产,降低线粒体膜电位和细胞凋亡,凋亡通路的激活伯灵顿/ bcl - 2。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

这项研究是在综合医院的机构审查委员会批准的中央剧院的命令。

同意

诊所和研究使用的知情同意签署的献血者血液样本。低密度脂蛋白和内皮祖细胞制备的血液标本从健康志愿者禁食12小时以后。红细胞从样本中提取了诊所使用。外周血单核细胞和血浆得到从剩下的样品制备内皮祖细胞和低密度脂蛋白。

信息披露

这项工作已发表的预印本研究广场(https://www.researchsquare.com/article/rs-348365/v1)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Qijun江和乔陈了同样的工作。Qijun江和乔陈co-first作者。这项研究是由Qijun江和什邡叮。陈Qijun江和乔进行实验,进行了统计分析,准备手稿。Chengpeng李,李中国锣,中国贡献了一些实验和统计分析。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。

确认

这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国青年科学家(81600318)。