液源自脐带间充质干细胞缓解Mifepristone-Induced人类子宫内膜基质细胞损伤

文摘

人类子宫内膜基质细胞(hEndoSCs)可以维持子宫内膜内稳态和修复子宫内膜损伤中发挥重要作用。间充质干细胞(msc)显著增加受损hEndoSCs的扩散和防止细胞凋亡。最近的研究表明,液源自干细胞可以招募受损组织再生,这表现出潜在的干细胞疗法治疗向量。在这项研究中,我们孤立的人脐带间充质干细胞液(hUCMSC-Exos)和调查的影响在mifepristone-induced hUCMSC-Exos hEndoSC受伤。外来体吸收、细胞增殖和细胞凋亡受损hEndoSCs对待hUCMSC-Exos被检测到。我们也评估apoptosis-related蛋白质的表达和PTEN / AKT信号通路。我们发现hUCMSC-Exos改善受损hEndoSCs的增殖和保护hEndoSCs mifepristone-induced细胞凋亡。hUCMSC-Exos调节bcl - 2水平以及表达下调裂解Caspase-3水平和激活PTEN / AKT信号通路调节扩散和antiapoptosis。这些结果表明hUCMSC-Exos保护hEndoSCs mifepristone-induced凋亡和发挥了积极作用在修复受损hEndoSCs PTEN / AKT信号通路在体外。hUCMSC-Exos可能蕴含着巨大的希望颗粒治疗子宫内膜损伤。

1。背景

子宫内膜再生组织是一个高度,进行月度增长,分化,脱落在女性的生育年龄。人类子宫内膜基质细胞发挥重要作用在维持子宫内膜内稳态(1]。研究支持,hEndoSCs负责子宫内膜decidualization,血管重建、免疫细胞招聘、和丰富的分子生产发挥重要作用在修复子宫内膜损伤(2]。子宫内膜损伤可能导致hEndoSC细胞凋亡和hEndoSCs生存能力下降,诱发子宫内膜萎缩,子宫内膜内稳态的失败(3]。子宫内膜损伤激活凋亡信号通路,抑制子宫内膜血管生成,并影响子宫内膜的再生。

间充质干细胞(msc)自我更新和multipotential分化特性,被广泛应用于干细胞疗法(4]。msc来源于脐带,msc的丰富来源之一,提供一个安全、低免疫原性替代来源的组织再生后子宫内膜损伤(5,6]。干细胞疗法治疗子宫内膜损伤开辟了新的视角。msc移植在Asherman综合征小鼠模型,结果显示,msc可以提高受伤的子宫内膜的生育率(7,8]。受损后hEndoSC coculturing msc在体外,msc显著增加的速度增殖和细胞凋亡的减少9]。和许多病人已经怀孕msc移植后与胶原蛋白支架(10,11]。

液、膜囊泡(直径30 - 150 nm),作为细胞内的货物运送蛋白质、脂质、核酸以及细胞表面标记(12]。最近的研究表明,液源自干细胞可以再生的细胞和组织的功能作为旁分泌因子,表现出潜在的干细胞疗法治疗向量(13]。液分泌的干细胞不仅包含特定多能转录因子也包含丰富的非编码rna在受体细胞调节相关基因的表达,促进受体细胞的修复和再生14,15]。液,作为细胞间交流的介质,可以上调抗凋亡基因表达下调,proapoptotic基因,从而抑制受损细胞或组织的细胞凋亡和促进组织修复和再生16,17]。许多研究证明hUCMSC-Exos可以协调调节炎症反应和免疫系统受损组织,激发新的途径治疗许多疾病(游离18]。然而,机制协调干细胞治疗子宫内膜损伤仍不清楚。在这项研究中,我们研究的恢复潜力液源自hUCMSCs治疗人类子宫内膜基质细胞和hUCMSC-Exos机制受损修复子宫内膜损伤在体外。

2。材料和方法

2.1。hUCMSCs隔离和表征

hUCMSCs孤立的结缔组织人类脐带(描述19]。在扩张培养基培养酶消化后,hUCMSCs组成的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) / F-12补充10% ( )胎牛血清(美国Gibco的边后卫)。hUCMSCs被检测到的典型标记流式细胞分析仪(美国BD FACSCalibur),如具体的CD34抗体(Abcam 1: 1000年,英国),CD45 (Abcam 1: 1000年,英国),CD73 (Abcam 1: 1000年,英国),CD90 (Abcam 1: 1000年,英国),CD105 (Abcam 1: 1000年,英国),和HLA-DR (Abcam 1: 1000年,英国)共轭FITC和APC,分别。multilineage分化潜能(成骨的脂肪形成的,和chondrogenic分化)hUCM-MSCs具备干细胞进行检查。

2.2。隔离和表征hUCMSC-Derived液

hUCMSC-Exos分离培养介质使用ExoQuick-TC exosome-free的边后卫(系统生物科学,美国)。因此,hUCMSC-Exos准备以下实验:液被负染色电镜的特点,根据其大小和免疫印迹表面标记表达式。液被加载到一个formvar /碳涂层网格,负面沾水phosphor-tungstic酸3% 1分钟,并观察通过透射电子显微镜(TEM、范、美国)加速电压120 kV。的典型标记液被西方墨点法确定,如CD63 (Abcam 1: 1000年,英国),PDCD6IP (Abcam 1: 1000年,英国),TSG101 (Abcam 1: 1000年,英国),和LC3A (Abcam 1: 1000年,英国)。此外,hUCMSC-Exos粒度分布是衡量高灵敏度流式细胞术(英国NanoFCM)。

2.3。hEndoSCs隔离和表征

子宫内膜组织中从患者获得一个正常的子宫内膜增殖的阶段。我们稍微挠的子宫内膜患者提高胚胎移植的成功。所有患者健康的女性正常月经周期的25 - 30天,没有使用激素避孕,子宫内避孕器,或接受激素治疗手术前至少3个月。子宫内膜周期和子宫内膜厚度(即。,the architecture of the lining and endometrial stripe) and pathology were determined according to the patient’s menstrual history, B-sonography, and histologic examination.

新鲜的子宫内膜标本在增殖阶段冲洗,碎成小块(1 - 2毫米³),然后在0.1%的I型胶原酶(σ,美国)。分散的子宫内膜细胞分离过滤通过连续尼龙筛子(180μm和40μ米尼龙筛)。hEndoSCs维护在DMEM / F-12 10%的边后卫(青霉素和链霉素美国Gibco)和1%(美国Hyclone) [20.]。

检测的典型标记hEndoSCs,细胞通过特定的CD34抗体(Abcam 1: 1000年,英国),CD44 (Abcam 1: 1000年,英国),和CD90 (Abcam 1: 1000年,英国)与PE / Cy5.5共轭,分别FITC和体育。在室温下孵化后,细胞用流式细胞分析仪检测(美国BD FACSCalibur)。

2.4。人类子宫内膜基质细胞损伤模型的建立

ESCs在章节3 - 5是收获,分发到文化板块,培养在DMEM / F-12 with10% 48小时的边后卫。改变了这种介质中没有的边后卫,并与60细胞治疗μ美国mol / L米非司酮(σ)48小时。治疗后,媒介改变了新鲜的培养基继续培养和米非司酮被撤回。受损的子宫内膜基质细胞模型成立在体外。

2.5。定量hUCMSC-Exos的吸收效率

PKH26(美国生活技术)是用于标签hUCMSC-Exos。hEndoSCs与米非司酮在96 -孔板培养48 h。米非司酮政府后,PHK26-labelled hUCMSC-Exos resuspended在无血清培养基和培养子宫内膜基质细胞的。后培养的细胞为0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, h, 14日和20 h,我们观察到的细胞通过激光共焦扫描显微镜(LSM800、蔡司、德国)和检测到的荧光强度PKH26。

2.6。扩散试验,细胞计数工具8化验(CCK8)

细胞增殖是由CCK-8工具包(Dojindo、日本)根据制造商的指示。短暂,hEndoSCs被播种在96孔板中含有10%的边后卫在湿润孵化器和孵化24 h为粘附在37°C;然后我们取代了媒介与无血清培养基添加60μmol / L米非司酮和培养48 h。媒介是取代DMEM / F-12加上hUCMSC-Exos使用DMEM / F-12控制。然后,450海里的吸光度测量标。

2.7。流仪分析细胞凋亡

hEndoSCs 6-well文化板块被收获,通过吸气终止培养上清液,在PBS和细胞被洗两次。细胞培养与FITC-conjugated膜联蛋白V和propidium碘(Vazyme生物技术有限公司,中国)在绑定缓冲在室温下15分钟没有光照和分析流式细胞仪(美国BD FACSCalibur)。这个测试是4细胞群体的歧视、完整的细胞(膜联蛋白V^{- - - - - -}/π^{- - - - - -}),早期凋亡细胞(膜联蛋白V⁺/π^{- - - - - -}(膜联蛋白V),坏死细胞^{- - - - - -}/π⁺),late-apoptotic(膜联蛋白V /坏死细胞⁺/π⁺)。经常获得一万个细胞,结果表示为凋亡的比例膜联蛋白V⁺和坏死π⁺细胞占总细胞数。结果分析与FlowJo软件。

2.8。胞内信号通过免疫印迹分析评价

适当时间的培养后,细胞被洗两次与PBS和刮到溶解产物缓冲区包含1毫米二硫苏糖醇(德勤),1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF), 1毫克/毫升亮抑酶肽2毫克/毫升抑肽酶,5毫米EGTA PBS。的细胞用声波降解器细胞分裂者,和sonicates然后离心机 10分钟。浮在表面的变性在样品缓冲和在沸水中加热5分钟。蛋白质分离10% sds - page和从凝胶转移electrophoretically聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)转移。2 h的膜被孵化屏蔽解决方案包含5%的脱脂牛奶,0.05% Tween-20在PBS (PBS-Tween)。膜清洗短暂在PBS-Tween bcl - 2和孵化(Abcam 1: 1000年,英国),Caspase-3 (Abcam 1: 1000年,英国),裂解Caspase-3(细胞信号1:1000年,美国),PTEN(细胞信号1:1000年,美国),一种蛋白激酶(细胞信号1:1000年,美国),和p-AKT(细胞信号1:1000年,美国)抗体在一夜之间在4°C。膜下洗3次在PBS-Tween通过使用旋转瓶。洗膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭anti-rabbit 1 h。发射极耦合逻辑的膜再次清洗和加工检测设备(美国Biosharp)根据制造商的方向想象抗体识别的蛋白质。

2.9。统计分析

所有的数据呈现的 从至少三个独立运行。所有统计分析使用学生的双尾配对 - - - - - -测试。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。星号( )表明 ,和两个星号( )表明 。

3所示。结果

3.1。描述hUCMSCs hUCMSC-Exos

的阳性标记来识别hUCMSCs间充质干细胞标记(CD73 CD90、和CD105)和负面标记(CD34、CD45和HLA-DR)被fluorescence-activated检查细胞排序(流式细胞仪)。结果表明,积极的标记,包括CD73, CD90和CD105高度表达。此外,负面标记(CD34、CD45和HLA-DR)(图中不表达1(一))。hUCMSCs成脂肪细胞的分化潜能,成骨细胞,内层是确认(图1 (b))。

描述hUCMSC-Exos,我们从hUCMSC提取液培养基使用ExoQuick-TC试剂。hUCMSC-Exos淡黄色物质沉淀在底部的管。外来体的形态和大小由TEM可视化,以及隔离液的直径是30 - 100纳米球形形状(图2(一个))。免疫印迹证实hUCMSC-Exos exosome-specific标记CD63表达,PDCD6IP TSG101,但不是负面标记自噬小体蛋白质LC3A(图2 (b))。流nanoanalyzer分析表明,平均直径 (图2 (c)),hUCMSC-Exos的浓度大约是 粒子/毫升。这些数据证明hUCMSC-Exos成功提取和纯化hUCMSC培养基。

3.2。表征hEndoSCs

hEndoSCs孤立从新鲜的子宫内膜标本在增殖阶段。的immunophenotypes hEndoSCs流式细胞分析仪进行了分析,分析结果显示,细胞CD34阳性,CD44, CD90(图3(一个))。图3 (b)显示hEndoSCs的形态。同时,细胞波形蛋白、角蛋白的表达进行了评估和免疫组织化学鉴定表明,角蛋白和波形蛋白表达的细胞(数字3 (c)和3 (d))。

3.3。有效吸收hUCMSC-Exos Mifepristone-Injured hEndoSCs

验证hUCMSC-Exos吸收hEndoSCs受损,我们贴上hUCMSC-Exos PKH26然后cocultured PHK26-labelled hUCMSC-Exos与mifepristone-induced hEndoSCs。激光共焦扫描显微镜是用来监控外来体吸收的效率实时hEndoSCs受损。图4(一)显示了典型PKH26-labelled阳性细胞在不同时间点(1 h, 4 h, 8 h, h 14日)后hUCMSC-Exos hEndoSCs被损坏。图4 (b)显示了不同时间点的统计结果(0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, h, 14日和20 h)。外来体吸收效率增加的数量hUCMSC-Exos(红色荧光)吸附或hEndoSCs吞没。与赫斯特hEndoSCs被贴上标签,我们发现hUCMSC-Exos聚集在细胞核周围细胞的内部(图4 (c))。

3.4。hUCMSC-Exos促进受损hEndoSCs扩散

hEndoSCs被分为三组:hEndoSCs培养在DMEM / F-12 10%的边后卫(新鲜组),mifepristone-induced hEndoSCs在无血清培养基(米非司酮组),和mifepristone-induced hEndoSCs cocultured与hUCMSC-Exos(外来体组)。图5(一个)显示了新鲜hEndoSCs在~ 70%汇合的培养。用米非司酮治疗后48 h,大量人口hEndoSCs死了和受损的confluency hEndoSCs ~ 30%。否则,损坏hEndoSCs恢复与hUCMSC-Exos共培养后的融合性的外来体组~ 50%。

确定的影响hUCMSC-Exos hEndoSCs受损,我们获得的扩散破坏hEndoSCs使用CCK-8工具包hEndoSCs hUCMSC-Exos处理后48 h。图5 (b)显示三组的扩散,扩散的外来体组显著高于米非司酮组。分析结果表明,有一个挂式组和米非司酮组之间的显著差异。我们的数据表明hUCMSC-Exos可以促进受损hEndoSCs的扩散。

3.5。hUCMSC-Exos防止hEndoSCs Mifepristone-Induced细胞凋亡在体外

进一步调查的影响hUCMSC-Exos hEndoSCs受损,我们评估了细胞凋亡流式细胞分析仪。由膜联蛋白V-FITC / PI染色和流式细胞仪分析,活细胞和凋亡细胞百分比的新鲜组分别为96.5%和2.1%。米非司酮组的活细胞率为73.8%,细胞凋亡率为21.9%,和相应的利率挂式组分别为87.0%和8.71%(图6(一))。hEndoSCs的米非司酮明显诱导凋亡,活细胞的比例显著降低米非司酮后管理。图6 (b)显示了活细胞的百分比挂式组与米非司酮组相比明显不同( )。与此同时,凋亡细胞的比例有显著差异之间的米非司酮组和挂式组( )如图6 (c)。这些结果表明,细胞凋亡率hEndoSCs米非司酮治疗后显著增加。和hUCMSC-Exos可以缓解mifepristone-induced hEndoSCs神经细胞凋亡。

3.6。hUCMSC-Exos缓解受损hEndoSCs通过AKT激活凋亡信号通路

进一步调查hUCMSC-Exos的影响,利用免疫印迹检测bcl - 2的表达,Caspase-3,裂解Caspase-3(图7(一))。的积极表达裂解Caspase-3米非司酮后政府增加,但Caspase-3的表达并没有受到影响。相反,bcl - 2表达被发现显著下降。然而,Caspase-3的表达和裂解Caspase-3挂式组减少hUCMSC-Exos添加后,和bcl - 2表达增加。这些发现表明,hUCMSC-Exos加强antiapoptosis和有一个健壮的hEndoSCs mifepristone-induced损伤的保护效应。

PTEN / AKT信号通路中起着重要的作用在细胞凋亡和血管生成。进一步评估hUCMSC-Exos的分子机制的保护,我们评估PTEN的水平,一种蛋白激酶,p-AKT四组(图7 (b))。挂式组,p-AKT表达显著增加。然而,这并不增加与增加总AKT表达式,也没有总AKT蛋白水平的变化。挂式组中PTEN / AKT通路抑制剂处理(LY294002) p-AKT的表达减少,仍高于与米非司酮组。观察PTEN和p-AKT表达之间的负相关。这些结果表明hUCMSC-Exos可能诱发p-AKT超表达和PTEN / AKT信号通路的激活可以调节细胞生长、迁移、血管生成,这种效应在一定程度上削弱了PTEN / AKT通路抑制剂。

4所示。讨论

先前的研究已经表明,hUCMSCs修复受伤的组织,防止细胞凋亡9,21]。然而,确切的机制尚不清楚。在这项研究中,我们提取液源自hUCMSCs和cocultured mifepristone-induced子宫内膜基质细胞。我们发现hUCMSC-Exos可以改善受损的生存hEndoSCs米非司酮和减轻hEndoSCs诱导的细胞凋亡。我们决定hUCMSC-Exos可以激活PTEN / AKT信号通路在mifepristone-injured hEndoSCs,并进一步调节bcl - 2表达下调Caspase-3分开。毕竟,我们的结果表明,hUCMSC-Exos发挥了积极作用在修复受伤的子宫内膜通过PTEN / AKT信号通路。

与正常子宫内膜相比,分子、形态和功能的受损的子宫内膜完全改变,和受损的子宫内膜细胞导致细胞凋亡。米非司酮抑制bcl - 2表达和诱导子宫内膜细胞凋亡(9]。米非司酮政府后,受损hEndoSCs已经建立的分子、形态和功能描述。我们获得的细胞生长抑制和凋亡诱导了米非司酮体外。免疫印迹显示表达式的裂解Caspase-3增加和bcl - 2表达的减少在mifepristone-induced hEndoSCs。和我们的研究结果表明,米非司酮可以促进子宫内膜细胞凋亡upregulation PTEN的表达。PTEN / AKT信号通路可以调节增殖,分化,子宫内膜细胞的迁移。先前的研究表明,PTEN / AKT信号通路的激活上调VEGF和VEGFR-2表达诱导修复受伤的子宫内膜(22]。msc可以改善子宫内膜受损细胞的恢复从压力和米非司酮诱导细胞凋亡在体外Caspase-3的差别和抑制细胞凋亡,对这些Caspase-8, Caspase-9 hEndoSCs [9]。

我们孤立hUCMSC液和证实了这一特征。免疫印迹分析液的蛋白质表达特征如CD63、PDCD6IP TSG101, LC3A。此外,观察到hUCMSC-Exos可以吸收hEndoSCs受伤在体外。我们cocultured受损的子宫内膜细胞hUCMSC-Exos和检查的影响hUCMSC-Exos hEndoSCs受损。bcl - 2的表达明显调节,裂解的表达Caspase-3 hUCMSC-Exos政府后表达下调。p-AKT表达水平显著增加,观察PTEN和p-AKT表达之间的负相关。我们建议hUCMSC-Exos保护hEndoSCs mifepristone-induced凋亡通过PTEN / AKT信号通路和AKT激活规范的bcl - 2和裂解Caspase-3表达式。

许多研究已经证明,各种各样的microrna在hUCMSC-Exos [23,24]。microrna是一系列小的非编码rna(~ 22个核苷酸长)在转录后的调控目标基因的表达水平。在这个过程中,microrna / miRNA-induced沉默复杂(miRISC)结合3 - - - - - -UTR目标通过平移mRNA表达抑制的镇压和/或信使rna降解[25]。发现microrna调节一种蛋白激酶的磷酸化通过PTEN的表达在不同组织和许多凋亡因素如Bcl-xL抑制凋亡通路的激活和提高细胞的抗氧化活性26,27]。液中含有丰富的microrna在受体细胞调节相关基因的表达,促进受体细胞的再生和修复。据报道,exosomal miR-32-5p抑制诱导多药耐药性的PTEN表达和激活PI3K / AKT通路(28]和miR-21-5p失调在液增强一种蛋白激酶激酶活性和再生活动受损29日]。我们将进一步研究小分子核糖核酸运输的机制液源自hUCMSCs子宫内膜损伤的修复和实践的液囊体内和在临床治疗子宫内膜损伤。

总之,我们发现hUCMSC-Exos可以促进细胞存活和增殖hEndoSCs受损和减轻hEndoSCs mifepristone-induced细胞凋亡。hUCMSC-Exos PTEN / AKT激活hEndoSCs凋亡信号通路和监管。本研究的结果为进一步研究奠定基础的潜在应用hUCMSC-Exos人类子宫内膜损伤。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以要求从相应的作者。数据没有公开由于隐私问题或道德的原因。

同意

病人的监护人提供招聘前签署知情同意,自愿选择加入我们的研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

J.W.和相对湿度的贡献同样工作。Z.W. J.W.设计和监督学习。J.W.,R.H., and Q.X. collected the materials, performed the experiments, analyzed the data, and wrote the manuscript. All authors wrote parts of, read, and approved the final manuscript.

确认

这项工作是支持由安徽省的主要研究和开发项目(1804号h08020265),中国国家自然科学基金(81901437),和安徽省自然科学基金(1908085 qh314和1908085 qh201号)。

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