). Following Akt inhibition, LSS-induced upregulated GTPCH expression, BH4, and NO level of EPCs were suppressed. LSS significantly improved the migration, proliferation, and tube formation ability (15 dyn/cm2 LSS vs. stationary: vs. , vs. , and vs. , respectively; all ) along with the in vivo angiogenesis capacity of late EPCs, contributing to the recovery of limb ischemia. These effects were also blocked by Akt inhibition or GTPCH knockdown (, respectively). Conclusions. This study provides the first evidence that shear stress triggers angiogenesis in late EPCs via the PTEN/Akt/GTPCH/BH4 pathway, providing a potential nonpharmacologic therapeutic strategy for promoting angiogenesis in ischemia-related diseases."> 通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径晚期内皮祖细胞的剪切应力触发器血管生成 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

干细胞国际
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干细胞国际/2020/文章

研究论文|开放存取

卷 2020 |文章的ID 5939530 | 13 网页 | https://doi.org/10.1155/2020/5939530

通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径晚期内皮祖细胞的剪切应力触发器血管生成

邵鸿吴,1 张洪峰,2 姚舜,3. 路她嗯,4 Hai-Tao曾,5 灵朱平,2 和 镇杨6

1510080广州市中山二路58号中山大学第一附属医院超声科

2410008长沙湘雅路87号中南大学湘雅医院心血管内科

3.心血管病研究所，广东省人民医院，医学科学研究院广东省，广州市，510080中国科

4老年医学，湘雅医院，中南大学湘雅87路，长沙，410008中国科

5生殖医学中心，第六附属医院，孙中山大学，58岁，二村十字街，广州，510080中国

6急诊科，普通内科，急诊重症监护室及心脏介入和重点实验室，教研室对辅助循环，卫生部附属第一医院，中山大学大学，58中山二路，广州科，510080中国

学术编辑：瓦莱里娅Sorrenti负责
收到 2019年8月14日
修订 2019年11月3日
接受 2019年11月12日
发表 2020年4月30日

抽象

背景。剪切应力是内皮祖细胞（EPCs）的有效调制器和已经建议在血管生成中发挥重要作用。的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）/ Akt和鸟苷三磷酸环化（GTPCH）/四氢（BH4）途径调节早期内皮祖细胞的功能。然而，在晚期内皮祖细胞的剪切应力诱导血管生成这些途径的作用仍然知之甚少。因此，我们的目的是调查的剪切应力是否可以上调晚内皮祖细胞的血管生成的能力，并进一步探讨可能机制。方法。晚的EPC进行切应力（LSS），和它们的体外迁移，增殖和管形成的能力进行了测定。除此之外体内血管生成的能力进行了探讨，与参与PTEN / Akt和GTPCH / BH4途径分子的表达一起。结果。LSS高架的体外晚的EPC，这是伴随着下调PTEN表达的活性，加速Akt磷酸化，和GTPCH / BH4途径活化（所有 )。Akt被抑制后，lss诱导的EPCs GTPCH表达上调、BH4和NO水平被抑制。LSS能显著提高小鼠的迁移、增殖和造管能力(15 dyn/cm)2LSS与固定: 与 , 与 ,和 与 ,分别;所有 )随着体内晚内皮祖细胞，促进肢体缺血的恢复能力血管生成。也阻断Akt抑制或敲除GTPCH（这些效果 ,分别）。结论。本研究提供了第一个证据剪切应力触发器血管生成通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径晚期的EPCs，提供用于在缺血相关疾病促进血管生成的电势的非药物治疗策略。

1.背景

组织缺血，血管病变引起的缺氧缺血性是疾病的一个重要病理生理机制。因此，实现改善的血管生成响应于组织缺血是减少缺血性疾病器官损伤[一种有效的治疗策略1,2]。越来越多的证据表明，血管生成成人不单独为内皮细胞（EC）的增殖的结果，但也涉及到循环内皮祖细胞（EPC）的新血管形成函数[3.- - - - - -6]。此外，至少有两种不同类型的内皮祖细胞，内皮祖细胞早期和晚期内皮祖细胞（或生长的EPC）的，最近在确定体外细胞培养系统[7具有独特的细胞特性和生物学功能。早期EPCs在培养早期4-7天出现，VE-cadherin和KDR染色呈微弱阳性，增殖潜能低，细胞因子释放强，主要参与损伤血管内皮的修复。而晚期EPCs(或衍生EPCs)则在培养后期2-4周出现，VE-cadherin、KDR、vWF表达更强，能够产生内源性一氧化氮(NO)，增强新生血管生成。缺血组织缺氧可促进晚期EPCs的增殖、迁移和粘附，从而提高小管形成能力，增强epc相关血管生成，使缺血情况恶化[7- - - - - -9]。因此，更好地了解底层的血管生成从晚内皮祖细胞衍生的机制可以提供对缺血的疾病的新的治疗策略提供了基础。

现在公认，剪切应力对血管内皮的稳态具有有益效果，并且还用作用于新血管形成的关键触发[10,11]，和在EC和内皮祖细胞的剪切应力的有益效果是通过层流剪切应力（LSS）排他地介导的，而不是湍流/振荡流[12- - - - - -16]。与先前的研究一致，我们发现，LSS增加迁移，粘合剂，和人的早期内皮祖细胞，这是伴随着组织型纤溶酶原激活剂的表达上调和增强内皮型一氧化氮合酶的水平的增殖活性（eNOS）的超氧化物歧化酶[17- - - - - -23]。因此，LSS是调制的EPCs的功能的重要非药理学手段。然而，LSS对晚期内皮祖细胞和它们的血管生成能力的个体效应研究的限制。

肿瘤抑制磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)是PI3K/Akt/eNOS通路的内源性抑制剂，是缺血部位新生血管形成的主要决定因素，已被证明与内皮细胞和EPCs的血管生成功能有关[24- - - - - -26]。滨田等人。显示，在EC中PTEN缺失通过促进血管生成[加速肿瘤生长24]，和Koide等。发现细胞凋亡调节器通过调节IAP的表达（ARIA）增加膜相关的PTEN表达，而它的敲低导致相反的效果，因此放大PI3K / Akt信号，识别ARIA增强PTEN活化，并因此降低了PI3K / Akt信号在EC和信令内皮祖细胞，导致负调节在血管生成和血管[26]。这些研究从不同的角度提出，PTEN扮演新生血管形成的负调节关于其在内皮细胞或内皮祖细胞的表达。此外，PTEN / Akt信号途径在多种生物学过程中起重要作用，如细胞增殖和生长，并在典型的内皮细胞功能参与诸如血管张力，血管生成，粘合性的控制，并且募集白细胞到血管壁的调节[27,28]。另有研究证实，GTP的表达和活性环化I（GTPCH I）和四氢生物合成（BH4）在内皮祖细胞中上调通过用选择性PPARδ激动剂GW501516，其下调PTEN和因此增加的Akt磷酸化，并因此提高了内皮祖细胞的体内再生能力[29]。

我们以前的研究表明，降低的GTPCH表达和降低的BH4水平在高血压的条件有助于受损早期内皮祖细胞，和LSS上调GTPCH / BH4途径通过激活的sGC / cGMP和抑制TSP-1的表达，从而增强早期内皮祖细胞的再内皮化容量[23]。考虑早期和长出内皮祖细胞之间的相似性，我们推测的剪切应力也可以调节PTEN / Akt和GTPCH / BH4信号传导途径的表达在晚期内皮祖细胞，这可能进一步提高其体外活动和体内血管生成的能力。为了验证这些假设，在本研究中，我们暴露后期EPC企业向LSS并检查他们的体外功能体内血管生成的能力。我们进一步研究了PTEN / Akt和GTPCH / BH4途径的晚期内皮祖细胞在后肢缺血小鼠模型的血管生成能力的LSS介导的改变作用。这些研究结果可以提供一种新的治疗方法，以恢复在缺血性疾病的恶化的EPC功能。

2.材料和方法

2.1。细胞晚期内皮祖细胞的培养与鉴定

这项研究是经中南大学湘雅医学院的伦理委员会。接收知情同意后，从志愿者获得血液样品，并根据我们先前报道的方法晚内皮祖细胞的分离和培养[三十]。

2.2。EPC迁移，增殖和管形成体外

EPC migration was determined using a modified Boyden chamber placed in a 24-well culture dish containing 500 ml EBM-2 and supplemented with vascular endothelial growth factor (VEGF). Proliferation was determined by a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, and capillary tube formation was measured as previously reported [17]。基质胶加入到24孔板中以形成胶原凝胶，然后将其用100覆盖 μ升培养内皮祖细胞重悬浮至106细胞/ ml，在5％CO气氛中在37℃温育2。凝胶的图像被在相差显微镜下捕获。所述管状每个图像中的结构的总长度是根据先前的研究报告[测量并进一步归一化至对照组和呈现为相管长度31,32]。

2.3。切应力分析

内皮祖细胞暴露于层流剪切应力与流动室装载装置如先前所述[18,23,三十]。The seeded cells were exposed to 5, 15, and 25 dyn/cm2laminar shear stress for up to 15 h or to 15 dyn/cm2层流剪应力分别为5 h、10 h和15 h。对照组EPCs维持在静态状态。所有实验均在37℃的CO环境下进行2孵化器。

2.4。GTPCH I敲除和Akt的药理学抑制

剪应力实验也与细胞病毒转导使用任务shRNA慢病毒颗粒转导根据制造商的说明书（30MOI，Sunbio医药生物技术有限公司，上海，中国）执行GTPCH我击倒后23]。gtpg - i的靶序列为5 -CcggGCCGCTACCTACTAATGAATTCAAGAGATTCA-TTAGTAGGTAGCGGCTTTTTTg-3 ,和阴性对照的靶序列是5 -CcggTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg-3 。After transduction, the cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and incubated with EPC medium for 48 h; the effect of shRNA transduction on reducing the GTPCH I expression level was confirmed by polymerase chain reaction (PCR).

此外，培养的内皮祖细胞用10预孵育 μ如前所述，在剪应力刺激前1小时，以mol的Akt磷酸化抑制剂ly294002 (Calbiochem)进行研究[18]。

2.5。Western印迹分析

洗涤细胞，用PBS两次，总EPC蛋白质通过细胞裂解缓冲液收获（＃9803，Cell Signaling Technology公司公司，丹弗斯，MA，USA）。蛋白提取物进行12％SDS-PAGE，并转移到聚偏氟乙烯膜（的Immobilon-P，默克-Millipore公司，达姆施塔特，德国）。The following antibodies were used for western blot analysis: rabbit anti-PTEN (1 : 1000; #9559, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), rabbit anti-phosphorylated Akt (Ser473) (1 : 1000; #9271, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), rabbit anti-total Akt antibody (1 : 1000; #9272, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), mouse anti-GTPCH I (1 : 1000; sc-271482, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), and rabbit anti-β-actin (1 : 1000; #4970, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA). Proteins were visualized with horseradish peroxidase- (HRP-) conjugated anti-rabbit IgG (1 : 2000; #7074, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA) or HRP-conjugated anti-mouse IgG (1 : 2000; #7076,Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), followed by use of the ECL chemiluminescence system (#6883, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA). The intensity of immunoreactive bands was analyzed and expressed as the ratio of PTEN, anti-phosphorylated Akt, Akt, and GTPCH I toβ-肌动蛋白在人EPCs中的作用。

2.6。细胞内BH4和无测量

细胞内BH4浓度根据我们先前报告的另一项研究[测量23,33]，通过减去BH2的从总biopterins，表示为皮摩尔/毫克蛋白的水平加氧化生物蝶呤。在内皮祖细胞内NO水平通过荧光显微镜使用DAF-FM（Invitrogen）的荧光评价如前所述[23，并表示为相对于细胞的荧光变化百分比，作为时间/载体控制。与静态条件组的数据进行统计学比较。

2.7。鼠后肢缺血模型

所有的动物保健协议和实验，审议并通过实验动物研究中心的动物护理和使用委员会在中南大学湘雅医学院批准。所有小鼠都保持在中南大学实验动物研究中心的无特定病原体的设施。下肢缺血在8-10周龄雄性NRMInu / NU无胸腺裸鼠致。In brief, the mice were anesthetized with pentobarbital sodium (0.5%, 50 mg/kg) by intraperitoneal injection, and the surgical procedures were performed under sterile conditions. A vertical longitudinal incision was made in the left hindlimb, and the femoral artery and its branches were then dissected and ligated [18,三十,34]。

2.8。激光散斑成像

血流通过扫描之前用激光散斑对比度成像（PeriCam PSI Z，Perimed，瑞典）两个后爪和所述外科手术之后（0天，第3，第7，第14，和21）进行测量。在该过程期间，将动物保持在戊巴比妥麻醉下钠和它们的体温被严格保持36.5℃和37.5℃[之间35]。足底灌注感兴趣解剖学定义区域（ROI）内量化。将得到的数据报告为在左侧的血流到右（L / R）后肢的比率。

2.9。免疫组织化学

腓肠肌收获在股动脉结扎后14天后。The midzone of the muscles (the 5 mm wide centermost section) was trimmed. The samples were embedded in paraffin, and 4 μ米厚的横截面被做用于苏木精和伊红（H＆E）染色制备。放大40倍的显微镜下测量每场侧支动脉的数目。For immunohistochemistry, we used antibodies against CD31 (1 : 200, Abcam, UK). The paraffin section was rehydrated, and endogenous peroxidase activity was blocked for 30 min in methanol containing 0.3% hydrogen peroxide. The section was incubated with the primary antibody at 4°C overnight, followed by 60 min of incubation with the biotinylated secondary antibody (1 : 500, Abcam, UK) [36]。所有标本用苏木染色溶液（生物技术研究所碧云天，中国）复，然后用储存中性胶密封。形态学和血管生成的程度的分析是通过OLYMPUS CX41和Leica应用套件4.0软件扫描部分之后进行。

2.10。统计分析

使用GraphPad Prism 6.0软件与方差的3组以上的比较单向分析所有数据进行统计分析，紧接着最显著差异事后检验。值 被认为是统计学显著。

3.结果

3.1。切应力增强内皮祖细胞后期的功能体外

迁移（图1(一)和2(一个)），增殖（图1 (b)和图2（b）和管的形成(图1 (c)和图2（c）层流剪切应力作用后，EPCs呈剂量依赖性和时间依赖性增加。

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图1
不同层次的LSS的效果体外晚期内皮祖细胞的功能。（a）中定量晚的EPCs的VEGF诱导的迁移的分析（ 在静态条件组对内皮祖细胞， 每组)。（b）中的EPCs晚期增殖活性的定量分析（ 在静态条件组对内皮祖细胞， 每组)。（c）中定量分析和晚期内皮祖细胞代表照片管信息（表示为相对值，以在静态条件组的EPCs， 在静态条件组对内皮祖细胞， 每组)。比例尺200 μm.统计学分析采用最不显著性差异进行事后检验。高功率场。
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图2
LSS上的影响体外在不同的时间点晚的EPC的功能。（a）中定量晚的EPCs的VEGF诱导的迁移的分析（ 与EPCs at 0 h, 每组)。（b）中的EPCs晚期增殖活性的定量分析（ 与EPCs at 0 h, 每组)。（C）Quantification analysis and representative photograph tube information of late EPCs (represented as relative value to EPCs at 0 h, 与EPCs at 0 h, 每组)。比例尺200 μm.统计学分析采用最不显著性差异进行事后检验。高功率场。
3.2。切应力调节的PTEN / Akt和GTPCH / BH4通路在内皮祖细胞

如图所示3.，层应力处理后的PTEN表达水平的降低和Akt磷酸化水平在剂量和时间依赖性增加。此外，我GTPCH表达与晚期内皮祖细胞内BH4和NO水平也剂量和时间依赖性响应于层流剪切应力增大。总的来说，这些数据表明，在LSS的EPCs后期降低PTEN表达，诱导的Akt磷酸，并随后诱导GTPCH / BH4途径活化。

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图3
LSS对PTEN / Akt和GTPCHI /内皮祖细胞中的BH4通路的影响。(a, b) Representative photographs and quantification analysis of PTEN protein expression (a) and phosphorylation of Akt (b) of late EPCs treated with 5, 15, and 25 dyn/cm2剪切应力15小时或静止的条件下，分别为（ 在静态条件组对内皮祖细胞， )。（C）Representative photographs and quantification analysis of GTPCH I protein expression of late EPCs treated with 15 dyn/cm25，10，和15小时剪切应力（ 在静态条件组对内皮祖细胞， )。(d, e) Quantitative analyses of intracellular BH4 (d) and NO (e) levels in late EPCs treated with 15 dyn/cm25，10和15小时后，分别切应力（ 在静态条件组对内皮祖细胞， )。(f, g) Representative photographs and quantification analysis of PTEN protein expression (f) and phosphorylation of Akt (g) of late EPCs treated with 5, 15, and 25 dyn/cm2剪切应力15小时或静止的条件下，分别为（ 与EPCs at 0 h, 每组)。(h) 15 dyn/cm处理的晚期EPCs GTPCH I蛋白表达的代表性照片和定量分析25，10，和15小时剪切应力（ 与EPCs at 0 h, 每组)。(i, j) Quantitative analyses of intracellular BH4 (i) and NO (j) levels in late EPCs treated with 15 dyn/cm25，10和15小时后，分别切应力（ 与EPCs at 0 h, 每组)。最显著差异是在应用了事后检验。
3.3。在晚期EPCs中，层流剪切应力触发GTPCH/BH4通路上游的PTEN/Akt激活

如所预期的，预处理GTPCH我的shRNA没有防止PTEN表达和Akt磷酸化高程的切应力诱发的减少，和Akt磷酸化的抑制也没有LSS下改变PTEN的表达水平（图图4（a）和图4（b）)。相比之下，shRNA的介导击倒GTPCH我的显著取消了LSS诱导GTPCH I表达，导致后期内皮祖细胞在这两个细胞内BH4和NO水平的降低。治疗Akt磷酸化特异性抑制剂LY所述的（图后观察到同样的效果图4（c）- - - - - -4 (e))。这些结果表明，层流剪切应力通过抑制PTEN表达和诱导Akt磷酸化激活GTPCH/BH4通路;也就是说，PTEN/Akt作为GTPCH/BH4的上游调控EPCs上的LSS。

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图4
EPCs对LSS的反应中PTEN/Akt和GTPCHI/BH4通路的关系(a) Akt抑制或GTPCH I敲除对晚期EPCs中lss调控的PTEN蛋白表达影响的代表性照片和定量分析( 在静态条件组对内皮祖细胞， ;NS:与LSS+EPC组无显著差异， 每组)。（B）代表性照片和Akt抑制或GTPCH我敲低对内皮祖细胞的LSS调节Akt磷酸化在后期的EPCs的影响定量分析（ 在静态条件组对内皮祖细胞， ;NS:与LSS+EPC组无显著差异， 每组)。（c）中的代表性照片和Akt抑制或GTPCH我敲低对LSS调节GTPCH I蛋白表达在晚期内皮祖细胞的影响的定量分析（ 在静态条件组对内皮祖细胞， ; # 与LSS + EPC基， 每组)。（d，E）的定量的Akt抑制或GTPCH我敲低对LSS调节细胞内BH4（d）和NO（e）中的水平在后期的EPCs的影响分析（ 在静态条件组对内皮祖细胞， ; # 与LSS + EPC基， 每组)。统计学分析采用最不显著性差异进行事后检验。LY 294002浓度:10μmol / l。层状剪切应力。
3.4。该PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径介导的剪切力增强体外功能和体内晚期内皮祖细胞的血管生成能力

然后，我们评估了EPC功能的PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径的作用。预处理GTPCH我shRNA或LY衰减层状剪切应力诱导的迁移，增殖和后期内皮祖细胞管形成活性（图5)。符合体外结果，层流剪切应力显着地改善在小鼠模型中股动脉结扎后肢体缺血的功能恢复（图6)。此外，这种功能恢复被GTPCH I shRNA或LY所废除。

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图5
PTEN/Akt和GTPCH/BH4通路阻断抑制体外与LSS处理内皮祖细胞的功能。迁移（a）中，增殖活性（B），和管形成的定量分析（表示为相对值，以在静态条件组的EPCs）与GTPCH我击倒和Akt抑制处理的内皮祖细胞的晚期内皮祖细胞（c）中的（ 在静态条件组对内皮祖细胞， ; # 与LSS + EPC基， 每组)。统计学分析采用最不显著性差异进行事后检验。LY 294002浓度:10μmol / l。层状剪切应力。
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图6
PTEN/Akt和GTPCH/BH4通路阻断抑制体内与LSS处理内皮祖细胞的血管生成。代表性照片（a）和定量分析，显示体内内皮祖细胞的血管生成能力与GTPCH我击倒和Akt抑制处理用于改善血液灌注缺血性后肢（B，C）（ 与媒体， ; # 在静态条件组对内皮祖细胞， ; & 与LSS + EPC基， 每组)。统计学分析采用最不显著性差异进行事后检验。LY 294002浓度:10μmol / l。(d)有代表性的照片和定量分析显示体内由CD31染色的EPCs的血管生成的能力（ 与媒体， ; # 在静态条件组对内皮祖细胞， ; & 与LSS + EPC基， 每组)。比例尺50 μ米LY 294002浓度:10μmol / l。LSS = laminar shear stress; hpf = high power field.

最后，CD31染色上显示，LSS在小鼠的缺血肢体，这是由GTPCH我shRNA或LY抑制显著血管生成增强股动脉结扎后第14天的腓肠肌（图图6（d）)。总的来说，这些结果证实，LSS都引发后期EPC功能体内和体外通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4通路。

4。讨论

在这项研究中，我们观察到LSS下调PTEN表达，诱导的Akt磷酸化，激活GTPCH / BH4的信号传导途径，和高架体外晚期EPCs的活性和血管生成能力。因此，LSS通过PTEN/Akt/GTPCH/BH4途径触发了晚期EPCs相关的血管生成，揭示了LSS对晚期EPCs有益的新机制。这表明，剪应力可作为一种潜在的治疗方案的缺血性疾病。

从骨衍生的内皮祖细胞骨髓在促进新血管形成起到关键作用，修复内皮损伤，并改善内皮功能[37- - - - - -39]。无论EPC数量和功能受到损害心血管疾病及相关危险因素[40- - - - - -42，构成血管损伤的重要机制。既往研究进一步揭示，晚期EPCs在危重肢体缺血或心肌梗死中表现出较高的血管生成潜力，并通过直接移植到新形成的宿主血管中促进旁分泌功能而增强新生血管形成[3.,43]。因此，晚期EPCs的血管生成能力在缺血性疾病血管损伤的病理生理中发挥着基础性作用，有望成为缺血性疾病的有效治疗手段。

累积的数据表明，剪​​切应力调制形态学，功能和功能性基因的表达在EC [44,45]，从而出现作为血管修复的重要非药理学方法。我们以前报道，LSS增加增殖和迁移活动，并通过上调eNOS的，Tie2的表达增强的损伤内皮早期内皮祖细胞的修复能力，而GTPCH I [18,20- - - - - -23,46]。剪切应力，还发现通过整联或细胞骨架重排[上调调节晚期内皮祖细胞的分化47,48]。然而，LSS对后期EPC介导的血管生成能力的影响仍不清楚。本研究表明，LSS增强增殖，迁移，和晚期内皮祖细胞的管腔形成能力体外。此外,15达因/厘米2LSS treatment for 15 h significantly increased the angiogenesis of late EPCs in a murine hindlimb ischemic model. Thus, LSS upregulates the angiogenesis process mediated by late EPCs, further supporting its beneficial effect on EPC function and shedding light on the potential application of LSS as a nonpharmacological treatment option in ischemic disease. Combined with the research results showing that LSS could induce restoration of in vitro migration, proliferation, and adhesion of early EPCs by upregulating GTPCH/BH4 pathway in our previous research, we come to conclusion that LSS could stimulate both the体外通过GTPCH/BH4途径提高早期和晚期EPCs的功能体内再内皮化或血管生成功能，因其基本生理功能不同体内)。

在EC中的血管生成功能PTEN参与以及产后新血管形成[24,49]和作用在通过PI3K / AKT / eNOS的[EPC介导的血管生成26]，其为增加的PTEN进行抑制PI3K和Akt激活，并抑制PTEN表达式获得相反的效果。先前的研究显示，该GTPCH / BH4通路与在高血压早期EPC介导的内皮修复能力相关联50]，而且我们还发现，通过LSS上调GTPCH / BH4途径[改善早期内皮祖细胞的再内皮化能力23]，证实此途径在维持早期的EPC功能的重要作用。此外，我GTPCH的BH4的表达和活性，生物合成是PTEN下调和随后的Akt活化的条件下在后期的EPCs的刺激，从而提高他们的再生功能[29]。因此，我们推测，LSS影响通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径，这是由事实LSS下调PTEN表达支持后期内皮祖细胞的功能活动，促进Akt磷酸化，并在后期的EPC增加GTPCH和BH4水平。这种效应是通过抑制Akt的磷酸化减少，表明GTPCH / BH4响应于剪切应力作用晚的EPCs的PTEN / Akt途径的下游。这是由BH4的和细胞内的GTPCH我击倒NO水平LSS诱导增强的抑制进一步证实;然而，GTPCH我并不影响后期的EPC PTEN表达或Akt磷酸化。此外，Akt和所述GTPCH / BH4通路的阻塞抑制衰减的LSS诱导的增加体外活动和体内新血管形成的能力或晚期内皮祖细胞的血管密度。因此，这些结果彰显PTEN / Akt和GTPCH / BH4途径的EPC的LSS介导调控的重要性体外功能体内新生血管形成的能力。

我们之前的研究显示LSS可以增加eNOS mRNA的表达[20]，激活的Tie2 / AKT / eNOS的信号传导途径[18，上调GTPCH/BH4通路[23]在早期的EPCs与它们的内皮修复能力后续增强，表明LSS刺激的NO产生的EPCs早期既包括转录后（包括mRNA表达，并参与NO产生功能性蛋白的后续磷酸化）和转录调制。它呈现的是LSS增强的Tie2和Akt的磷酸化，和Tie2击倒或Akt抑制抑制Akt蛋白和eNOS LSS诱导的磷酸化在内皮祖细胞，内皮祖细胞，其随后抑制再内皮化的能力[18]。此外，我们发现LSS通过上调SDF-1/CXCR4恢复了Janus激酶2 (JAK2)的磷酸化，进而刺激了epc介导的再内皮化。相反，sh-RNA抑制CXCR4或JAK2抑制降低了这种有益作用[三十]。其他研究证实了CXCR4和CXCR7的抗体或拮抗剂阻断SDF-1诱导EPC活性，从而抑制了EPC归位和血管生成[51]，这表明抑郁对EPC迁移，粘附，和管形成由两个或CXCR4抑制CXCR7的效果。在这些研究中，也有人提出，Akt的充当血管生成素-2 / Tie2的[的下游信号18]和CXCR7 / SDF-1途径[51,52]，调节两个体外功能和体内内皮祖细胞的再内皮化容量[三十]。本研究进一步阐述了lss诱导的EPCs晚期功能和血管生成能力的增强与Akt和GTPCH/BH4通路有关，提示转录后调控可能在lss诱导的EPCs晚期NO生物合成中发挥关键作用。与我们之前的研究一致[23]，它证实的eNOS / NO是内皮祖细胞GTPCH / BH4途径的下游信号传导。因此，通过LSS的NO产生的EPCs的调制可以通过多种机制介导，和NO依赖性途径可能是共同的下游目标在早期调节或晚期EPC功能。

我们的研究有一定的局限性，这是应该承认的。首先，我们没有对负调控因子PTEN进行基因转染实验来证实其在剪应力介导的EPC功能上调中的作用。第二，本研究未对EPCs进行荧光示踪。之前的研究利用荧光示踪证明，注射EPC后，晚期EPCs驻留在缺血肌肉的毛细血管中，并分化为内皮细胞，可显著改善血流恢复[23,53,54]。这个证据表明响应缺血在EPC介导的新生血管内皮祖细胞后期的命运。第三，因为我们没有进入一个振荡流设备，我们无法调查对后期的EPC振荡剪切应力的作用。以前的研究表明，振荡剪切的对内皮效果与atheroprone内皮细胞表型，这是通过从层流剪切应力施加在动脉粥样硬化潜在不同相关联55- - - - - -57]。因此，可能的是，振荡剪切应力抑制晚期内皮祖细胞的功能活性，从而相对的层流剪切应力介导的调节的影响;但是，需要进一步的调查，调查这种可能性。

五，结论

综上所述，本研究首次证明了剪应力增强了材料的稳定性体外功能体内通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径晚期内皮祖细胞的新生血管形成能力。此调查提供新的见解剪切应力对EPC介导的血管生成中的保护作用，这表明剪切应力作为缺血性疾病的重要非药物治疗策略。

缩略语

内皮祖细胞： 内皮祖细胞
没有： 一氧化氮
以挪士: 内皮型一氧化氮合酶
PTEN： 肿瘤抑制磷酸酶和紧张素同源物
PI3K： 磷脂酰肌醇3 -激酶
GTPCH我： GTP环我
BH4： 四氢生物蝶呤
LSS： 切应力。

数据可用性

目前的研究过程中使用和/或分析数据集可从上合理请求相应的作者。

伦理审批

这项研究是经中南大学湘雅医学院的伦理委员会。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

杨甄设计并监督了实验。吴少红、张峰和朱玲平进行了实验，分析了数据，绘制了图表，并撰写了手稿。姚顺、唐鲁和曾海涛进行了一些实验并分析了数据。所有的作者都对手稿做出了智力上的贡献。所有作者阅读并批准了最终的手稿。吴少红和张峰对这项工作同样有贡献。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金的赠款中国(81670220)、广东省科技计划的项目(2015 a020212013),广州城市的科技项目(201803010008),中央大学的基础研究基金(17 ykzd18),中山大学的国际科技合作项目广州经济技术开发区(2017 gh13)。

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