SCI 干细胞国际 1687-9678 1687-966X Hindawi出版 10.1155 /五百九十三万九千五百三十〇分之二千〇二十〇 5939530 研究文章 剪应力通过PTEN/Akt/GTPCH/BH4途径触发晚期内皮祖细胞的血管生成 https://orcid.org/0000-0002-3291-6115 吴 韶红 1 张 冯 2 https://orcid.org/0000-0002-4505-4761 姚 避开 3 唐 鲁 4 https://orcid.org/0000-0002-4843-4428 曾 Hai-Tao 五 https://orcid.org/0000-0001-6749-8737 朱 凌平 2 https://orcid.org/0000-0001-5823-7949 杨 震 6 Sorrenti 瓦莱里娅 1 超声科 第一附属医院 中山大学 中山路2号58号 广州 中国 510080 sysu.edu.cn 2 心血管内科 中南大学湘雅医院 中南大学 87湘雅路 长沙 中国 410008 csu.edu.cn 3 心血管病研究所系 广东省人民医院 广东省医学科学院 广州 中国 510080 gdghospital.org.cn 4 老年医学系 中南大学湘雅医院 中南大学 87湘雅路 长沙 中国 410008 csu.edu.cn 五 生殖医学中心 第六附属医院 中山大学 58 二村十字街 广州 中国 510080 sysu.edu.cn 6 急诊医学部 一般内科 急诊重症监护室&心内科辅助循环重点实验室 卫生部 第一附属医院 中山大学大学 中山路2号58号 广州 中国 510080 moh.gov.cn 2020 30. 4 2020 2020 14 08 2019 03 11 2019 12 11 2019 30. 4 2020 2020 版权所有:吴少红等 这是知识共享署名许可，允许在任何媒体不受限制地使用，分发和复制下发布的开放式访问文章，提供原工作正确引用。

背景。剪应力是内皮祖细胞(EPCs)的有效调节因子，在血管生成中起重要作用。phosphatase and tensin homolog (PTEN)/Akt和鸟苷三磷酸环水解酶(GTPCH)/四氢生物蝶呤(BH4)通路调控早期EPCs的功能。然而，这些通路在剪应力诱导的晚期EPCs血管生成中的作用仍不清楚。因此，我们旨在研究剪应力是否能上调晚期EPCs的血管生成能力，并进一步探讨其可能的机制。 方法。晚的EPC进行切应力（LSS），和它们的 体外测定迁移、增殖和造管能力。此外, 体内通过观察PTEN/Akt和GTPCH/BH4通路相关分子的表达，观察血管生成能力。 结果。LSS高架 体外晚期EPCs的活性伴随着PTEN表达的下调，加速了Akt的磷酸化和GTPCH/BH4途径的激活(全部) P < 0.05 )。Akt被抑制后，lss诱导的EPCs GTPCH表达上调、BH4和NO水平被抑制。LSS能显著提高小鼠的迁移、增殖和造管能力(15 dyn/cm)2LSS与静止的： 72.2 ± 5.5 与 47.3 ± 7.3 ， 0.517 ± 0.05 与 0.367 ± 0.038 , 1.664 ± 0.315 与 1 ± 0 ， 分别;所有 P < 0.05 ） 随着 体内晚内皮祖细胞，促进肢体缺血的恢复能力血管生成。也阻断Akt抑制或敲除GTPCH（这些效果 P < 0.05 ， 分别）。 结论。本研究提供了第一个证据剪切应力触发器血管生成通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径晚期的EPCs，提供用于在缺血相关疾病促进血管生成的电势的非药物治疗策略。

 广州经济技术开发区国际科技合作项目 2017年gh13 中山大学 17ykzd18 广州市科技计划重点项目 201803010008 广东省科技厅 2015A020212013 中国国家自然科学基金 81670220 1.背景

血管疾病引起的组织缺血缺氧是缺血性疾病的重要病理生理机制。因此，改善血管生成对组织缺血的反应是减少缺血疾病中器官损伤的有效治疗策略[ 1， 2]。越来越多的证据表明，血管生成成人不单独为内皮细胞（EC）的增殖的结果，但也涉及到循环内皮祖细胞（EPC）的新血管形成函数[ 3- 6]。此外，至少有两种不同类型的内皮祖细胞，内皮祖细胞早期和晚期内皮祖细胞（或生长的EPC）的，最近在确定 体外细胞培养系统[ 7]用不同的细胞特性和生物学功能。期间内4-7天的早期培养周期早期内皮祖细胞的出现，与VE-cadherin和KDR的微弱阳性，低增殖潜能和强烈的细胞因子的释放，并且主要涉及伤者血管内皮细胞的修复。相反，晚期内皮祖细胞（或生长的EPCs）出现在以高达2-4周后期培养时间，并显示强表达VE-钙粘着蛋白，KDR和vWF，具有较高的能力，以产生内源性一氧化氮（NO）和增强的neovasculogenesis。此外，增殖，迁移，和晚期内皮祖细胞的粘附通过在缺血组织缺氧促进，从而提高了管形成的能力和增强的EPC相关的血管发生导致病情恶化[ 7- 9]。因此，更好地了解晚期EPCs的血管生成机制，可为缺血疾病的新治疗策略提供依据。

现在公认，剪切应力对血管内皮的稳态具有有益效果，并且还用作用于新血管形成的关键触发[ 10， 11]，和在EC和内皮祖细胞的剪切应力的有益效果是通过层流剪切应力（LSS）排他地介导的，而不是湍流/振荡流[ 12- 16]。与先前的研究一致，我们发现，LSS增加迁移，粘合剂，和人的早期内皮祖细胞，这是伴随着组织型纤溶酶原激活剂的表达上调和增强内皮型一氧化氮合酶的水平的增殖活性（eNOS）的超氧化物歧化酶[ 17- 23]。因此，LSS是调制的EPCs的功能的重要非药理学手段。然而，LSS对晚期内皮祖细胞和它们的血管生成能力的个体效应研究的限制。

肿瘤抑制磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）中，PI3K / AKT / eNOS的途径的内源性抑制剂，在局部缺血部位的新血管形成构成的主要决定因素，并已显示出与EC和内皮祖细胞[的血管生成功能相关联的 24- 26]。Hamada等发现ECs中PTEN不足通过促进血管生成加速肿瘤生长[ 24], Koide等人发现,细胞凋亡调节器通过调节IAP表达式(咏叹调)增加膜相关PTEN表达而降价会导致相反的效果,因此放大PI3K / Akt信号,识别,咏叹调增强PTEN激活,因此减少了PI3K / Akt信号在ECs和内皮祖细胞,导致的负调控血管生成和血管生成 26]。这些研究从不同的角度提出，PTEN扮演新生血管形成的负调节关于其在内皮细胞或内皮祖细胞的表达。此外，PTEN / Akt信号途径在多种生物学过程中起重要作用，如细胞增殖和生长，并在典型的内皮细胞功能参与诸如血管张力，血管生成，粘合性的控制，并且募集白细胞到血管壁的调节[ 27， 28]。另有研究证实，GTP的表达和活性环化I（GTPCH I）和四氢生物合成（BH4）在内皮祖细胞中上调通过用选择性PPAR δ激动剂GW501516可以下调PTEN，从而增加Akt磷酸化，从而增强EPCs的体内再生能力[ 29]。

我们前期研究表明，高血压状态下GTPCH表达降低和BH4水平降低导致早期EPCs受损，LSS通过激活sGC/cGMP和抑制TSP-1表达上调GTPCH/BH4通路，从而增强早期EPCs的内皮化能力[ 23]。考虑早期和长出内皮祖细胞之间的相似性，我们推测的剪切应力也可以调节PTEN / Akt和GTPCH / BH4信号传导途径的表达在晚期内皮祖细胞，这可能进一步提高其 体外活动和 体内血管生成能力。为了验证这些假设，在本研究中，我们暴露后期EPC企业向LSS并检查他们的 体外功能 体内血管生成能力。在后肢缺血小鼠模型中，我们进一步研究了PTEN/Akt和GTPCH/BH4通路在lss介导的晚期EPCs血管生成能力改变中的作用。这些发现可能为缺血性疾病中退化的EPC功能的恢复提供新的治疗方法。

 2.材料和方法 2.1。晚期EPCs的细胞培养与鉴定

这项研究是经中南大学湘雅医学院的伦理委员会。接收知情同意后，从志愿者获得血液样品，并根据我们先前报道的方法晚内皮祖细胞的分离和培养[ 30.]。

 2.2。EPC迁移、增殖和试管形成<体外italic> </italic>

EPC迁移测定采用改良的Boyden腔，置于含有500ml EBM-2并补充血管内皮生长因子(VEGF)的24孔培养皿中。增殖测定采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯四唑溴化铵(MTT)法，毛细管形成测定如既往报道[ 17]。基质胶加入到24孔板中以形成胶原凝胶，然后将其用100覆盖  μl体外培养的EPCs重悬至106细胞/ ml，在5％CO气氛中在37℃温育2。凝胶的图像被在相差显微镜下捕获。所述管状每个图像中的结构的总长度是根据先前的研究报告[测量并进一步归一化至对照组和呈现为相管长度 31， 32]。

 2.3。层流剪应力试验

内皮祖细胞暴露于层流剪切应力与流动室装载装置如先前所述[ 18， 23， 30.]。将种子细胞暴露于5、15和25 dyn/cm的环境中2层流剪应力可达15小时或15 dyn/cm2laminar shear stress for 5, 10, and 15 h, respectively. The EPCs in the control group were maintained in a static condition. All experiments were performed at 37°C in a CO2孵化器。

 2.4。GTPCH I敲除和Akt的药理学抑制

剪应力实验也与细胞病毒转导使用任务shRNA慢病毒颗粒转导根据制造商的说明书（30MOI，Sunbio医药生物技术有限公司，上海，中国）执行GTPCH我击倒后 23]。GTPCH-I的目标顺序为：5 “ -CcggGCCGCTACCTACTAATGAATTCAAGAGATTCA-TTAGTAGGTAGCGGCTTTTTTg -3- “ 和阴性对照的靶序列是5 “ -CcggTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg-3 “ 。转导后，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤细胞，EPC培养基孵育48 h;通过聚合酶链反应(PCR)证实shRNA转导降低GTPCH I的表达水平。

此外，将培养的EPCs与10预孵育 μ如前所述，在剪应力刺激前1小时，以mol的Akt磷酸化抑制剂ly294002 (Calbiochem)进行研究[ 18]。

 2.5。Western印迹分析

洗涤细胞，用PBS两次，总EPC蛋白质通过细胞裂解缓冲液收获（＃9803，Cell Signaling Technology公司公司，丹弗斯，MA，USA）。蛋白提取物进行12％SDS-PAGE，并转移到聚偏氟乙烯膜（的Immobilon-P，默克-Millipore公司，达姆施塔特，德国）。The following antibodies were used for western blot analysis: rabbit anti-PTEN (1 : 1000; #9559, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), rabbit anti-phosphorylated Akt (Ser473) (1 : 1000; #9271, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), rabbit anti-total Akt antibody (1 : 1000; #9272, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), mouse anti-GTPCH I (1 : 1000; sc-271482, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), and rabbit anti- β-actin (1: 1000;Cell Signaling Technology Inc.，丹佛，MA, USA)。用辣根过氧化物酶- (HRP-)偶联抗兔IgG对蛋白进行可视化(1:20 00;#7074, Cell Signaling Technology Inc.， Danvers, MA, USA)或hrp标记抗小鼠IgG (1:20 00;#7076,Cell Signaling Technology Inc.， Danvers, MA, USA)，然后使用ECL化学发光系统(#6883,Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)。免疫反应条带强度分析，以PTEN、抗磷酸化Akt、Akt和GTPCH I与的比值表示 β肌动蛋白内皮祖细胞。

 2.6。细胞内BH4和NO测量

细胞内BH4浓度根据我们先前报告的另一项研究[测量 23， 33]，通过从以pmol/mg蛋白表达的总生物蝶呤中减去BH2 +氧化生物蝶呤的水平。如前所述，使用DAF-FM (Invitrogen)荧光技术，通过荧光显微镜评估EPCs细胞内NO水平[ 23，并表示为相对于细胞的荧光变化百分比，作为时间/载体控制。与静态条件组的数据进行统计学比较。

 2.7。小鼠后肢缺血模型

所有的动物保健协议和实验，审议并通过实验动物研究中心的动物护理和使用委员会在中南大学湘雅医学院批准。所有小鼠都保持在中南大学实验动物研究中心的无特定病原体的设施。下肢缺血在8-10周龄雄性NRMInu / NU无胸腺裸鼠致。In brief, the mice were anesthetized with pentobarbital sodium (0.5%, 50 mg/kg) by intraperitoneal injection, and the surgical procedures were performed under sterile conditions. A vertical longitudinal incision was made in the left hindlimb, and the femoral artery and its branches were then dissected and ligated [ 18， 30.， 34]。

 2.8。激光散斑成像

血流通过扫描之前用激光散斑对比度成像（PeriCam PSI Z，Perimed，瑞典）两个后爪和所述外科手术之后（0天，第3，第7，第14，和21）进行测量。在该过程期间，将动物保持在戊巴比妥麻醉下钠和它们的体温被严格保持36.5℃和37.5℃[之间 35]。足底灌注感兴趣解剖学定义区域（ROI）内量化。将得到的数据报告为在左侧的血流到右（L / R）后肢的比率。

 2.9。免疫组化

腓肠肌收获在股动脉结扎后14天后。The midzone of the muscles (the 5 mm wide centermost section) was trimmed. The samples were embedded in paraffin, and 4  μ米厚的横截面被做用于苏木精和伊红（H＆E）染色制备。放大40倍的显微镜下测量每场侧支动脉的数目。For immunohistochemistry, we used antibodies against CD31 (1 : 200, Abcam, UK). The paraffin section was rehydrated, and endogenous peroxidase activity was blocked for 30 min in methanol containing 0.3% hydrogen peroxide. The section was incubated with the primary antibody at 4°C overnight, followed by 60 min of incubation with the biotinylated secondary antibody (1 : 500, Abcam, UK) [ 36]。所有标本用苏木染色溶液（生物技术研究所碧云天，中国）复，然后用储存中性胶密封。形态学和血管生成的程度的分析是通过OLYMPUS CX41和Leica应用套件4.0软件扫描部分之后进行。

 2.10。统计分析

所有数据均采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析进行三组或三组以上的比较，然后采用差异最小的事后检验。的值 P < 0.05 被认为是统计学显著。

 3.结果 3.1。切应力增强后期的EPCs <斜体>体外</斜体>的功能

迁移（图 图1（a）和 图2（a）），增殖（图 图1（b）和 图2（b）），和管形成（图 图1（c）和 图2（c））的EPCs的以剂量依赖性和时间依赖性的方式层流剪切应力后增加。

不同层次的LSS的效果 体外晚期内皮祖细胞的功能。(a) vegf诱导晚期EPCs迁移的量化分析( * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 每组)。（b）中的EPCs晚期增殖活性的定量分析（ * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 每组)。（c）中定量分析和晚期内皮祖细胞代表照片管信息（表示为相对值，以在静态条件组的EPCs， * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 每组)。比例尺200  μ米最显著差异适用于统计分析的事后检验。hpf = high power field.

LSS上的影响 体外不同时间点晚期EPCs的功能(a) vegf诱导晚期EPCs迁移的量化分析( * P < 0.05 与EPCs在0小时相比， ñ = 6 每组)。（b）中的EPCs晚期增殖活性的定量分析（ * P < 0.05 与EPCs在0小时相比， ñ = 6 每组)。(c)曲antification analysis and representative photograph tube information of late EPCs (represented as relative value to EPCs at 0 h, * P < 0.05 与EPCs在0小时相比， ñ = 6 每组)。比例尺200  μ米最显著差异适用于统计分析的事后检验。hpf = high power field.

 3.2。层切应力调节EPCs中的PTEN/Akt和GTPCH/BH4通路

如图 3，层压处理后，PTEN表达水平下降，Akt磷酸化水平升高，且呈剂量和时间依赖性。此外，晚期EPCs中GTPCH I表达和细胞内BH4和NO水平也随着层切应力的增加而呈剂量和时间依赖性增加。总的来说，这些数据表明，LSS降低了晚期EPCs中PTEN的表达，诱导Akt磷酸化，进而诱导GTPCH/BH4通路的激活。

LSS对PTEN / Akt和GTPCHI /内皮祖细胞中的BH4通路的影响。(a, b) Representative photographs and quantification analysis of PTEN protein expression (a) and phosphorylation of Akt (b) of late EPCs treated with 5, 15, and 25 dyn/cm215小时或静止状态下的剪应力( * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 )。(c) 15 dyn/cm处理的晚期EPCs GTPCH I蛋白表达的代表性照片和定量分析25小时、10小时及15小时的剪应力( * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 )。(d, e) Quantitative analyses of intracellular BH4 (d) and NO (e) levels in late EPCs treated with 15 dyn/cm25，10和15小时后，分别切应力（ * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 )。(f, g) Representative photographs and quantification analysis of PTEN protein expression (f) and phosphorylation of Akt (g) of late EPCs treated with 5, 15, and 25 dyn/cm215小时或静止状态下的剪应力( * P < 0.05 与EPCs在0小时相比， ñ = 6 每组)。(h)Representative photographs and quantification analysis of GTPCH I protein expression of late EPCs treated with 15 dyn/cm25小时、10小时及15小时的剪应力( * P < 0.05 与EPCs在0小时相比， ñ = 6 每组)。(i, j) Quantitative analyses of intracellular BH4 (i) and NO (j) levels in late EPCs treated with 15 dyn/cm25，10和15小时后，分别切应力（ * P < 0.05 与EPCs在0小时相比， ñ = 6 每组)。最不显著性差异用于事后检验。

 3.3。在晚期EPCs中，层流剪切应力触发GTPCH/BH4通路上游的PTEN/Akt激活

如所预期的，预处理GTPCH我的shRNA没有防止PTEN表达和Akt磷酸化高程的切应力诱发的减少，和Akt磷酸化的抑制也没有LSS下改变PTEN的表达水平（图 图4（a）和 图4（b）)。相比之下，shrna介导的GTPCH I敲低可显著抑制lss诱导的GTPCH I表达，导致晚期EPCs细胞内BH4和NO水平降低。Akt磷酸化特异性抑制剂LY处理后也观察到同样的效果(图) 图4（c）- 4 (e))。这些结果表明，层流剪切应力激活通过抑制PTEN表达和诱导的Akt磷酸化的GTPCH / BH4通道;换句话说，PTEN / Akt信号充当GTPCH / BH4的上游在LSS的对EPCs的调节。

EPCs对LSS的反应中PTEN/Akt和GTPCHI/BH4通路的关系(a) Akt抑制或GTPCH I敲除对晚期EPCs中lss调控的PTEN蛋白表达影响的代表性照片和定量分析( * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 ;NS:与LSS+EPC组比较无显著性差异， ñ = 6 每组)。（B）代表性照片和Akt抑制或GTPCH我敲低对内皮祖细胞的LSS调节Akt磷酸化在后期的EPCs的影响定量分析（ * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 ;NS:与LSS+EPC组比较无显著性差异， ñ = 6 每组)。（c）中的代表性照片和Akt抑制或GTPCH我敲低对LSS调节GTPCH I蛋白表达在晚期内皮祖细胞的影响的定量分析（ * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 ;＃ P < 0.05 与LSS + EPC基， ñ = 6 每组)。(d, e)定量分析Akt抑制或GTPCH I敲除对晚期EPCs中lss调控的细胞内BH4 (d)和NO (e)水平的影响( * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 ;＃ P < 0.05 与LSS + EPC基， ñ = 6 每组)。最显著差异适用于统计分析的事后检验。LY 294002的浓度：10  μ摩尔/升。LSS = laminar shear stress.

 3.4。在PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径介导的剪切应力，增强<斜体>体外</斜体>功能和<斜体>体内</斜体>血管生成延时的EPCs的容量

然后，我们评估PTEN/Akt/GTPCH/BH4通路在EPC功能中的作用。GTPCH I shRNA或LY预处理减弱了层切应力诱导的晚期EPCs的迁移、增殖和管形成活性(图) 五)。与一致 体外结果，层流剪切应力显着地改善在小鼠模型中股动脉结扎后肢体缺血的功能恢复（图 6)。此外，这种功能恢复通过GTPCH我shRNA或LY废除。

PTEN / Akt和GTPCH / BH4通路阻断抑制 体外与LSS处理内皮祖细胞的功能。迁移（a）中，增殖活性（B），和管形成的定量分析（表示为相对值，以在静态条件组的EPCs）与GTPCH我击倒和Akt抑制处理的内皮祖细胞的晚期内皮祖细胞（c）中的（ * P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 ;＃ P < 0.05 与LSS + EPC基， ñ = 6 每组)。最显著差异适用于统计分析的事后检验。LY 294002的浓度：10  μ摩尔/升。LSS = laminar shear stress.

PTEN / Akt和GTPCH / BH4通路阻断抑制 体内与LSS处理内皮祖细胞的血管生成。代表性照片（a）和定量分析，显示 体内内皮祖细胞的血管生成能力与GTPCH我击倒和Akt抑制处理用于改善血液灌注缺血性后肢（B，C）（ * P < 0.05 与媒介, ñ = 6 ;＃ P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 ;＆ P < 0.05 与LSS + EPC基， ñ = 6 每组)。最显著差异适用于统计分析的事后检验。LY 294002的浓度：10  μ摩尔/升。（d）代表性照片和定量分析，显示 体内由CD31染色的EPCs的血管生成的能力（ * P < 0.05 与媒介, ñ = 6 ;＃ P < 0.05 在静态条件组对内皮祖细胞， ñ = 6 ;＆ P < 0.05 与LSS + EPC基， ñ = 6 每组)。规模50条 μ米LY 294002的浓度：10  μ摩尔/升。LSS = laminar shear stress; hpf = high power field.

最后，CD31染色上显示，LSS在小鼠的缺血肢体，这是由GTPCH我shRNA或LY抑制显著血管生成增强股动脉结扎后第14天的腓肠肌（图 图6（d）)。总的来说，这些结果证实，LSS都引发后期EPC功能 体内和 体外通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4通路。

 4.讨论

在这项研究中，我们观察到LSS下调PTEN表达，诱导的Akt磷酸化，激活GTPCH / BH4的信号传导途径，和高架 体外活动和晚期内皮祖细胞的血管生成能力。因此，LSS触发经由PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径晚期EPC相关的血管发生，揭示了一种新机制对晚期的EPCs底层LSS的有益效果。这表明，剪切应力可以作为缺血性疾病的潜在治疗选择行动。

来源于骨髓的EPCs在促进新生血管形成、修复内皮损伤、改善内皮功能等方面发挥着重要作用[ 37- 39]。EPC编号及功能在心血管疾病及相关危险因素中均受损[ 40- 42]，构成血管损伤的重要机制。以往的研究进一步透露，后期内皮祖细胞通过直接嫁接到新形成的主体容器和促进旁分泌作用[表现出严重肢体缺血或心肌梗死的高潜在的血管生成和增强血管新生 3， 43]。因此，晚内皮祖细胞的血管生成能力起着在缺血性疾病的血管损伤的病理生理学中的基本作用，从而显示出有希望作为缺血性疾病的有效治疗方法。

积累的数据表明，剪应力调节细胞内功能基因的形态、功能和表达[ 44， 45]，从而出现作为血管修复的重要非药理学方法。我们以前报道，LSS增加增殖和迁移活动，并通过上调eNOS的，Tie2的表达增强的损伤内皮早期内皮祖细胞的修复能力，而GTPCH I [ 18， 20.- 23， 46]。剪切应力，还发现通过整联或细胞骨架重排[上调调节晚期内皮祖细胞的分化 47， 48]。然而，LSS对epc介导的晚期血管生成能力的影响尚不清楚。本研究表明，LSS增强了晚期EPCs的增殖、迁移和成管能力 体外。Furthermore, 15 dyn/cm2LSS治疗15小时可显著增加小鼠下肢缺血模型中晚期EPCs的血管生成。因此，LSS上调了晚期EPCs介导的血管生成过程，进一步支持了其对EPC功能的有益作用，并为LSS作为缺血性疾病非药物治疗的潜在应用提供了依据。结合我们前期研究发现LSS通过上调GTPCH/BH4通路诱导早期EPCs体外迁移、增殖和粘附的恢复，我们认为LSS可以同时刺激早期EPCs的迁移、增殖和粘附 体外通过早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞的功能GTPCH / BH4途径，提高其 体内再内皮化或血管生成函数，分别为（因为它们的基本不同的生理功能 体内)。

PTEN参与ECs的血管生成功能及产后新生血管形成[ 24， 49并通过PI3K/Akt/eNOS作用于epc介导的血管生成[ 26]，其为增加的PTEN进行抑制PI3K和Akt激活，并抑制PTEN表达式获得相反的效果。先前的研究显示，该GTPCH / BH4通路与在高血压早期EPC介导的内皮修复能力相关联 50]，而且我们还发现，通过LSS上调GTPCH / BH4途径[改善早期内皮祖细胞的再内皮化能力 23]，证实此途径在维持早期的EPC功能的重要作用。此外，我GTPCH的BH4的表达和活性，生物合成是PTEN下调和随后的Akt活化的条件下在后期的EPCs的刺激，从而提高他们的再生功能[ 29]。因此，我们推测，LSS影响通过PTEN / AKT / GTPCH / BH4途径，这是由事实LSS下调PTEN表达支持后期内皮祖细胞的功能活动，促进Akt磷酸化，并在后期的EPC增加GTPCH和BH4水平。这种效应是通过抑制Akt的磷酸化减少，表明GTPCH / BH4响应于剪切应力作用晚的EPCs的PTEN / Akt途径的下游。这是由BH4的和细胞内的GTPCH我击倒NO水平LSS诱导增强的抑制进一步证实;然而，GTPCH我并不影响后期的EPC PTEN表达或Akt磷酸化。此外，Akt和所述GTPCH / BH4通路的阻塞抑制衰减的LSS诱导的增加 体外活动和 体内新血管形成的能力或晚期内皮祖细胞的血管密度。因此，这些结果彰显PTEN / Akt和GTPCH / BH4途径的EPC的LSS介导调控的重要性 体外功能 体内新生血管形成的能力。

我们以前的研究表明，LSS可以增加eNOS的mRNA表达[ 20.，激活Tie2/Akt/eNOS信号通路[ 18，并上调GTPCH/BH4通路[ 23]在早期的EPCs与它们的内皮修复能力后续增强，表明LSS刺激的NO产生的EPCs早期既包括转录后（包括mRNA表达，并参与NO产生功能性蛋白的后续磷酸化）和转录调制。它呈现的是LSS增强的Tie2和Akt的磷酸化，和Tie2击倒或Akt抑制抑制Akt蛋白和eNOS LSS诱导的磷酸化在内皮祖细胞，内皮祖细胞，其随后抑制再内皮化的能力[ 18]。此外，人们发现，LSS还原的Janus激酶通过SDF-1 / CXCR4的上调，然后刺激EPC介导的再内皮化2（JAK2）磷酸化。通过相反，敲低CXCR4被sh-RNA或JAK2抑制减弱这个有益效果[ 30.]。其他研究证实了CXCR4和CXCR7的抗体或拮抗剂阻断SDF-1诱导EPC活性，从而抑制了EPC归位和血管生成的作用[ 51，显示抑制CXCR4或CXCR7对EPC迁移、粘附和管形成均有抑制作用。其中也有研究认为Akt是血管生成素-2/Tie2的下游信号通路[ 18]和CXCR7 / SDF-1途径[ 51， 52和监管两者 体外功能和 体内内皮祖细胞的再内皮化容量[ 30.]。本研究进一步阐明了在后期EPC功能的LSS诱导的增加和血管生成能力有关的Akt和GTPCH / BH4途径，这表明转录后调控可能存在差异，内皮祖细胞发挥LSS诱导NO合成至关重要的作用。与我们以前的研究结果一致[ 23]，它证实的eNOS / NO是内皮祖细胞GTPCH / BH4途径的下游信号传导。因此，通过LSS的NO产生的EPCs的调制可以通过多种机制介导，和NO依赖性途径可能是共同的下游目标在早期调节或晚期EPC功能。

有迹象表明，应该承认我们的研究有一定的局限性。首先，我们并没有进行负调控因子PTEN的基因转染实验，以确认其在剪应力介导的EPC功能的上调作用。其次，在这项研究中没有进行荧光内皮祖细胞的跟踪。以前的研究中使用的荧光示踪证明EPC注射后，后期内皮祖细胞驻留在局部缺血肌肉并分化成内皮细胞的毛细血管显著改善血流恢复[ 23， 53， 54]。这一证据揭示了晚期EPCs在缺血反应中epc介导的新生血管形成中的命运。第三，由于我们没有使用振荡流仪，因此无法研究振荡剪切应力对晚期EPCs的影响。既往研究表明，振荡剪切对内皮的影响与动脉粥样硬化内皮表型有关，这与层切应力所发挥的动脉粥样硬化保护电位不同[ 55- 57]。因此，振荡剪切应力可能抑制了晚期EPCs的功能活性，从而与层状剪切应力介导的调控作用相反;然而，需要进一步的研究来研究这种可能性。

 五，结论

综上所述，本研究首次证明了剪应力增强了材料的稳定性 体外功能 体内通过PTEN/Akt/GTPCH/BH4途径的晚期EPCs新生血管能力。这项研究为切变应力对epc介导的血管生成的保护作用提供了新的见解，提示切变应力是缺血性疾病的一种重要的非药理学治疗策略。

 缩写 内皮祖细胞：

内皮祖细胞

 没有：

一氧化氮

 eNOS的：

内皮一氧化氮合酶

 PTEN：

肿瘤抑制磷酸酶和张力蛋白同源

 PI3K：

磷脂酰肌醇3 “ 激酶

 GTPCH我：

三磷酸鸟苷cyclohydrolase我

 BH4：

四氢生物蝶呤

 LSS:

切应力。

 数据可用性

目前的研究过程中使用和/或分析数据集可从上合理请求相应的作者。

 伦理批准

这项研究是经中南大学湘雅医学院的伦理委员会。

 的利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

 作者的贡献

镇杨设计并监督了实验。绍香武，张枫，和灵朱平进行的实验，分析数据，绘制的人物，并写了稿子。姚舜，鲁堂，和海陶择嗯进行一些实验和分析数据。所有作者智力促成了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。绍香武和张枫同等贡献这项工作。

 致谢

这项工作得到了国家自然科学基金的赠款中国(81670220)、广东省科技计划的项目(2015 a020212013),广州城市的科技项目(201803010008),中央大学的基础研究基金(17 ykzd18),中山大学的国际科技合作项目广州经济技术开发区(2017 gh13)。

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