线粒体DNA低甲基化是与人胎心间充质干细胞中诱导衰老相关的生物标志物

摘要

背景．胎儿心脏可以再生，以恢复其正常的解剖和功能，以应对损伤，但这种再生能力在出生后的第一周就失去了。虽然具体的分子机制尚不明确，但可以推测心脏干细胞或祖细胞的老化可能导致再生潜能的丧失。方法．为了研究这种与衰老相关的功能障碍，我们培养了人胎儿心脏组织的间充质干细胞(MSCs)。慢性氧化应激/低血清诱导细胞衰老。线粒体DNA甲基化检测衰老过程中。结果．衰老间充质干细胞表现为扁平和增大的形态，衰老相关的-半乳糖苷酶(SA-)呈阳性β加)。通过扫描整个线粒体基因组，我们发现MSCs中有4个CpG岛低甲基化与衰老密切相关。线粒体COX1基因编码细胞色素c氧化酶复合物的主要亚基，并包含差异甲基化的CpG岛4，在MSCs中与衰老的开始同步上调。DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a和DNMT3B)的下调也上调了COX1的表达，并诱导了MSCs中的细胞衰老。结论．该研究表明，线粒体CPG低甲基化可以用作与慢性氧化应激诱导的细胞衰老相关的关键生物标志物。

1.介绍

成人哺乳动物心脏传统上被认为是不可再生的器官，因为它保留了非常小的再生潜力。心脏损伤后，如在心肌梗死的情况下，心脏无法补充绝大多数失去或受损的心肌细胞。相反，心脏愈合时留下疤痕组织，导致器官收缩缺陷，最终导致心力衰竭[1］．然而，1日龄小鼠的心脏保留了完整的再生潜能，能够在心脏损伤后恢复正常的解剖和功能[2］．然而，新生小鼠心脏的这种再生能力在出生后的第一周就丧失了。心脏干细胞或祖细胞的减少可能是衰老过程中再生能力丧失的决定因素之一[3.］．

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)作为一种有前途的再生治疗多种人类疾病的细胞，已经引起了人们极大的兴趣，主要是因为它们具有自我更新、多系分化和免疫调节的能力[9- - - - - -13.］．胎儿心脏来源的MSCs (c-MSCs, HMSCs)具有分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的潜力[3.，14.- - - - - -16.］．在心肌梗死大鼠模型中植入胎儿心肌间充质干细胞可改善心功能并修复心肌[15.］．然而，作为一种有用的再生治疗，从患者中分离的MSCs需要扩大前体内[17.］．MSCs在细胞培养中有一个有限的寿命，并且在几个膨胀通道之后，细胞进入衰老状态，导致自我更新能力和分化潜力的降低[18.，19.］．此外，随着年龄的增长，MSCs的自我更新潜能显著降低。与培养中的许多原代细胞一样，MSCs随着供体动物或人的年龄增长，增殖减少，凋亡增加[20.- - - - - -24.］．当MSCs接近衰老时，其增殖显著减慢，导致分化潜能降低[25.］．因此，了解MSCs中调控复制衰老的机制至关重要。

复制性衰老是一种使细胞在各种应激源下处于永久增殖停滞状态的过程，是衰老和年龄相关疾病的潜在重要贡献者。很明显，细胞衰老与一系列表观遗传修饰有关，这些修饰可能导致基因表达的变化，最终导致分解代谢和退化过程。线粒体DNA (mtDNA)损伤长期以来一直与衰老过程有关[26.］．许多线粒体信号通路可诱导细胞衰老[27.］．然而，线粒体表观遗传学的作用在很大程度上尚未被探索。事实上，线粒体表观遗传学在衰老中的重要性和相关性一直存在争议[28.这主要是因为在大得多的核基因组的背景下研究相对较小的线粒体基因组很困难。

各种组织中MTDNA的甲基化因老化，疾病状态，环境暴露和某些药物而异。除了5-甲基胞嘧啶之外，在MTDNA中还鉴定了所谓的“第六碱”，5-羟甲基胞嘧啶，其在老化中独立于5-甲基胞嘧啶水平的情况下的丰富变化[29.］．有人认为mtDNA甲基化可能成为下一代衰老的生物标志物[30.］．目前，我们对MTDNA甲基化在心脏茎或祖细胞的衰老功能障碍中的作用很少。为了获得有关线粒体表观遗传学在衰老中的作用的洞察力，我们在从人胎儿心脏组织培养的MSCs中诱导衰老，并检查了MSCs中可能与细胞衰老相关的表观遗传机制。

2.材料和方法

２.１.msc的隔离

从胎儿心脏组织中分离MSCs的方法如前所述[3.，16.经过一些修改。简单地说，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，从人类组织网络(华盛顿大学人类胚胎学组织中心实验室)获得45-67天胚胎的胎儿心脏组织。到达后，纸巾被用剃刀剁成小块。为了避免破坏心脏干细胞龛，我们没有使用胶原酶消化组织。相反，切碎的心脏组织直接播种在一个10厘米的平板上，加入少量含10%胎牛血清(FCS)和抗生素的DMEM (2-3 ml)，并在37°C的5% CO中培养₂湿润的气氛。心脏组织附着在平板上后，每天在不干扰组织的情况下向平板中加入少量新鲜培养基。5-7天后，MSCs开始从心脏外植体中迁移，收集MSCs进行进一步扩张。3-5代间充质干细胞用于分析。采用相同的方法从胎儿皮肤组织中分离出间充质干细胞，并与间充质干细胞并行使用。该实验方案由斯坦福大学的机构审查委员会/干细胞研究监督小组批准。

２.２.对msc

从胎儿心脏培养的MSCs (HMSCs)通过使用干细胞标记的流式细胞术进行表征，如前所述[31.］．收集细胞的浓度为细胞/ml，置于含0.1% BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。细胞在4℃下与抗msc标记物(CD90、CD73和CD105)、造血细胞标记物(CD45、CD34、CD14和CD19)、细胞外基质受体(CD29、CD44)和主要组织相容性(HLA-DR)的抗体(均来自CA BD Biosciences)共同孵育。抗体孵育30分钟后，细胞洗净悬浮于300μL PBS。使用FACSCAria III Cell Sorter (BD Biosciences, CA)进行流式细胞术[32.- - - - - -35.］．

２.３.msc的分化

分离的间充质干细胞分化成脂肪和成骨谱系的潜能如前所述[32.- - - - - -35.］．诱导后，分别用Oil Red O和茜素红(Sigma, USA)染色，检测分化脂肪细胞中是否存在中性脂空泡，骨细胞中是否有钙沉积。

２.４.诱导骨髓间充质干细胞衰老

模仿MSCS中看到的复制衰老[36.，37.[我们通过长期暴露于低氧化应激和低血清环境来采用一种新方法。具体地，在大约50％汇合下的通道3-5处的HMSC被连续地暴露于低浓度的过氧化氢（50 µM H₂O₂）在补充有5％FBS的DMEM中。使用这种方法，MSCs在2-3道后显示出典型的衰老形态。收集细胞进行RNA-SEQ分析（北京北京荣誉科技有限公司）。

2．5．染色的Senescence-Associatedβ牛乳糖

通过检测SA-的活性来定量测定细胞衰老β-gal如前所述[38.，39.］．收集间充质干细胞，用3%甲醛室温固定3 ~ 5 min。PBS洗涤后，细胞与新鲜制备的衰老相关SA-在37°C下孵育β-gal染色溶液：1mg / ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基P3-D-半乳糖苷（X-GAL），40mM柠檬酸/磷酸钠，pH6.0,5mM钾铁氰化钾，5mM钾铁氰化物，150mM NaCl和2mM MgCl2。过夜孵育后，细胞与sa-β-Gal染色使用显微镜安装的摄像机进行评估。

2.6。衰老细胞端粒长度的检测

端粒的相对长度通过定量PCR进行估算，如之前报道的[40，41.］．简单地说，用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, CA, USA)提取基因组DNA。稀释后为35 ng/μl DNA在95°C加热5min，冷藏5min。DNA样本被放在20μl含有10的实时QPCR反应系统 μl 2×Sybr预混缓冲区（罗氏，上海，中国），2 μL正向和反向引物。引物序列包括:(1)端粒正向:5 ' -GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3 ' (100 nM);反向:5 ' - tcccgactatccctatccctatccctatccctatcccta -3 ' (300 nM);和(2)β-globin正向:5 ' - GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 ' (150 nM)，反向:5 ' - caccaacttcatccacgttcacc -3 ' (150 nM)。PCR扩增过程为95℃10 min 1个循环，95℃15 s、56℃30 s、72℃30 s 40个循环(ABI SepOnePlus，北京，中国)。端粒长度由端粒拷贝数与拷贝数的相对比值估算β球蛋白(T / S)。T/S值由［40，41.］．

2.7。衰老与心脏发育途径的基因表达

通过RNA-SEQ进行衰老和心脏发育途径基因的比较[42.］．使用QIAZOL（QIAGEN，CA）分离出总RNA，并使用Illumina的Truseq RNA样品制备试剂盒V2用于分度的文库制备。使用Hiseq4000（Illumina）测序文库，并产生约3400万读数，每个样品长度为150bp。基因计数被标准化为每百万映射读数（RPKM）每千碱基的读数的值。如果纠正，Kegg途径被选中为显着调节值均小于0.05。,北京,中国)。

2.8。用COBRA检测mtDNA甲基化

线粒体和细胞总DNA由DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen, CA)提取，并使用EZ DNA甲基化™试剂盒(Zymo, CA)用亚硫酸氢钠处理，遵循制造商提供的协议。首先，我们从分离的线粒体中获得mtDNA，用亚硫酸氢钠处理DNA进行克隆测序。后来，我们发现，简单地使用全基因组DNA和针对线粒体DNA的PCR引物可以大大简化方案。

用聚合酶链反应(PCR)扩增亚硫酸氢盐处理的DNAµL反应含2µ3 × Klen-Taq I Mix, 2µl模板DNA，1 µL每个2.5µM底漆。95°C孵育5分钟后，DNA扩增38个循环，95°C 20 s, 62°C 20 s退火，72°C 20 s延伸，最后72°C延伸2分钟。甲基化PCR引物序列列于表（参见在线提供的补充材料中的表S1https://doi.org/10.1155/2017/1764549)．

mtDNA甲基化状态由限制性内切酶测定。PCR dna在65℃下用Taq I酶切2小时，在37℃下用HpyCH4IV酶切2小时，在3%琼脂糖凝胶上分离。Taq I识别TCGA位点，HpyCH4IV消化ACGT位点。用硫酸氢钠处理后，未甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶[43.，44.］．因此，甲基化的mtDNA将被限制性内切酶消化。而未甲基化的mtdna则会转化为TTGA和ATGT，这两种基因分别不会被Taq I和HpyCH4IV酶切。对甲基化和未甲基化条带进行扫描定量。

2.9。RNA干扰慢病毒对DNMTs的敲除

靶向每个DNMT基因的两种不同的RNA干扰寡核苷酸分别由H1和U6启动子驱动，并通过PCR共同亚克隆到PGREEN-PURO慢病毒载体中。靶向DNMT1，DNMT3A和DNMT3B的寡核苷酸序列如下：DNMT1（A）：5'-GCCCAATGAGACTGACATCAA-3';DNMT1（b）：5'-ggaaccaagcaagaagtga-3';DNMT3A（a）：5'-agcggggcaaaagaacagaag-3';DNMT3A（b）：5'-ccagatgttcttcgctaataa-3';DNMT3B（a）：5'-cctgtcattgttttgatggcat-3';DNMT3B（b）：5'-ccatgcaacgatctctcaaat-3'。争夺控制序列是5'-GCTTTCAATTCGCGCACCTA-3'。

在病毒包装方面，用2µ每个慢病毒表达结构的G。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美国)在6孔板上进行转染。在转染后24和48小时收集病毒上清。加入聚苯乙烯(8µ克毫升⁻¹)，上清置于培养的hmsc细胞上。细胞被转染两次，以提高转染效率。

2.10。RT-PCR分析

RT-PCR用于定量与衰老有关的基因的表达。通过Trizol试剂（Sigma，Mo）提取总RNA，并通过逆转录反应转化为cDNA，如前所述[45.，46.］．我们设计的PCR引物如下:β-肌动蛋白: 5 ' -CAGGTCATCACCATTGGCAATGAGC-3 '(正向)和5 ' -CGGATGTCCACGTCACACTTCATGA-3 '(反向);caveolin-1: 5 ' -TCCCATCCGGGAACAGGGCAACAT-3 '(正向)和5 ' -GTCCCTTCTGGTTCTGCAATC-3 '(反向);P16：5'-cggataattcaagagctaacaggt-3'（前进）和5'-ggcctccgaccgtaactattcggt-3'（反向）;P21.: 5 ' -GTGGACCTGTCACTGTCTTGTAC-3 '(正向)和5 ' -GCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGC-3 '(反向);载脂蛋白:5 ' -GGTCTCWGACAATGAGCTCCA-3(正向)和5 ' -TCCCAGAGGGCCATCATGGTC-3(反向);COX1: 5 ' -CAGCATGCCCCAGGATTTGTC-3 '(正向)和5 ' -CAKGTCCTGCTCCAGGGCAGC-3 '(反向))．PCR扩增由95℃5 min 1个循环、95℃20 s、62℃15 s、72℃15 s 33个循环组成，以72℃5 min延伸循环结束。

2.11。COX1酶活性的测定

通过细胞色素C氧化酶染色测定COX1活性。msc ()置于6孔板中培养24小时。用PBS冲洗细胞3次，空气干燥。细胞在预孵育培养基(50 mM Tris-HCl, pH 7.6;0.29 M蔗糖;2.2 mM氯化钴)，用缓冲液I (0.1 M磷酸钠pH 7.6;10%蔗糖)。细胞在37℃下孵育4小时，培养液为10ml (pH 7.4, 0.1 M磷酸钠pH 7.6, 10%蔗糖，10mg细胞色素C (Sigma, MO)， 10mg DAB(3,3 ' -二氨基联苯胺)盐酸盐(Sigma, MO)， 2.0 mg过氧化氢酶(Sigma, MO))。细胞用缓冲液I冲洗1次，PBS冲洗5分钟，用H冲洗₂o 5分钟，在显微镜下观察。

2.12。统计分析

使用SPSS软件（版本16.0; SPSS，Inc.，IL）进行分析数据。学生-检验或单因素方差分析(Bonferroni检验)比较治疗组间变量的统计学差异。数据以均数±标准差表示。所有实验都是重复进行的，结果被认为具有统计学意义．

3.结果

3.1。胎儿心脏间充质干细胞的多线性分化

从不同组织分离的MSCs，尽管它们的分子一致性，但在基因和蛋白表达、通路活性和谱系分化方面表现出强烈的偏差，表明存在“组织起源的分子记忆”[14.］．这些保守的器官特异性功能可能可能使它们更适合作为它们的原产气机构的细胞治疗剂，特别是在“原位重编程”或“原位差异化“模型。值得注意的是，鼠新生儿心脏可以再生和恢复损坏的部分，导致恢复正常解剖学和功能而没有疤痕形成，但在一周的年龄后，这种能力丢失了[2］．我们有兴趣了解线粒体DNA的表观遗传改变是否参与了这个衰老过程。

为了确定这种心脏衰老的潜在表观遗传机制，我们培养了来自人类胎儿心脏组织的MSCs，这些MSCs被认为可以维持完整的再生潜能。贴壁MSCs在初始组织播种后生长~ 8-12天，收集并使用流式细胞仪进行表型分析。我们发现干细胞标记物在分离的MSCs中普遍表达，包括CD105、CD73、CD90、CD44和CD29(图)1(一))．阴性的干细胞标志物，包括CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR，表达水平很低。分离的HMSCs可分化为成脂和成骨谱系(图)1 (b))．这些数据表明，胎心培养的MSCs具有之前报道的多系分化潜能[3.，14.，16.］．

由于组织间充质干细胞表现出强烈的“组织起源的分子记忆”[14.]，我们使用RNA-Seq检测与心脏发育相关的通路基因[4- - - - - -8］．我们发现参与心脏课程的基因也以HMSCs，包括Akt途径，Gata家族和TBX家族基因表达（图1 (c))．这些数据表明，这些HMSCs可能是研究心脏衰老的合适模型。

3.2。间充质干细胞慢性衰老诱导

两种诱导衰老通常被用来研究衰老在体外，包括复制性衰老(RS)和应激性早衰(SIPS) [47.- - - - - -49.］．RS的特征是端粒不断缩短，这发生在每次细胞分裂。虽然这是一个很好的模仿自然衰老过程，诱导衰老是非常耗时的。另一方面，SIPS是由暴露于亚细胞毒性应激引起的，细胞在端粒不缩短的情况下过早衰老。SIPS是研究衰老最常用的模型。然而，在这个模型中会遇到细胞毒性，特别是高浓度的过氧化氢。因此，SIPS可能不是一个合适的模型在活的有机体内心脏干细胞的病理生理老化。

在本研究中，我们结合RS和SIPS的优点建立了一个新的模型。在这个模型中，我们通过一种新的“双打击”方法促进了复制性衰老的发生。胎儿心脏来源的间充质干细胞(HMSCs)同时暴露于低剂量过氧化氢(50µM)和低血清(5%)细胞培养。据推测，接触低剂量的过氧化氢产生的毒性要比通常在SIPS中遇到的小得多。同时，低血清暴露会加速衰老的发展。联合暴露2-3代后，我们发现HMSCs呈扁平形态，细胞增殖减少。处理后的MSCs衰老相关-半乳糖苷酶(SA-β加)活动(数据2(一个)和2 (b))．

然后我们使用PCR来定量先前报道的衰老相关基因[38.，39.，50.］．我们发现衰老的MSCs中CAV1基因(CAV1)上调(图)2 (c))，尽管我们没有检测到APO-J和OX1的显著变化。P21也在细胞衰老的同时上调(图)2 (d))．需要进一步研究明确从衰老诱导刺激开始p53和p21上调的时间点。

为了进一步表征衰老细胞，我们使用定量PCR测量端粒长度。通过比较三种模型的端粒长度，可以清楚地看到，我们模型中的衰老细胞的端粒缩短类似于复制性衰老细胞(图)2 (e))．如预期的那样，在高剂量过氧化氢处理过的细胞中，端粒长度没有显著变化。此外，利用RNA-Seq，我们发现之前在复制衰老细胞中发现的途径[42.，51.]在我们的衰老细胞中也被激活（图S1-S2）。这些数据在一起表明我们的模型携带一种易于复制衰老的表型。

3.3。线粒体dna CpG岛甲基化差异与细胞衰老相关

为了描述细胞衰老的表观遗传机制，我们使用亚硫酸氢钠测序来评估整个线粒体基因组中11个CpG岛的DNA甲基化(图)3(一个))．利用限制性内切酶来区分甲基化和未甲基化的CpGs，我们发现线粒体基因组主要是未甲基化的。在衰老的HMSCs中，有三个CpG岛表现出相当多的mtDNA低甲基化，包括CpG岛4、1和2(图)3 (b))．在smsc中也观察到类似的mtDNA甲基化模式(图)3 (c))．然而，其余CpG岛在对照组和衰老MSCs之间的差异较小(图S3-S5)。我们还注意到新生儿和成人皮肤成纤维细胞中三个CpG岛(4,2,1)的mtDNA甲基化的差异(图)3 (d))．

通过扫描PCR带密度定量测定线粒体DNA甲基化程度。显然，衰老后的细胞中观察到明显的mtDNA低甲基化(图)3 (e))．

3.4。差分MTDNA甲基化影响COX1表达

CpG island 4位于线粒体COX1基因的3 '区(图)4(一))，它编码细胞色素c氧化酶I，这是有氧代谢的关键酶。随着cpg4位点mtDNA甲基化程度的下降，我们怀疑COX1的表达可能受到这种表观遗传调控的影响。我们使用RT-PCR对COX1进行半定量，发现COX1显著上调与衰老相关(图)4 (b))．位于CpG岛2下游的第二个线粒体基因ND2在衰老的MSCs中略有下降。同样，从胎儿心脏和皮肤组织培养的衰老MSCs中，COX1酶的活性也增加了(图)4 (c))．因此，线粒体dna甲基化的改变可能伴随着线粒体酶活性的细微变化。

3.5。DNA甲基转移酶的敲低上调线粒体COX1

由于线粒体DNA在衰老过程中发生低甲基化，我们检测了三种DNA甲基转移酶(DNMT1 DNMT3A,和DNMT3B)来控制DNA甲基化。我们发现这三种酶在衰老的MSCs中均下调(图)5(一个))．

为了确认DNA甲基转移酶在衰老过程中的作用，我们用shrna将这些酶敲除(图)5 (b))．有趣的是，敲低这三种酶可诱导MSCs衰老并抑制细胞增殖(图)5 (c))，并同时上调COX1(图5（d）)．

4.讨论

胎儿心脏再生潜能在出生后丧失的机制仍有待阐明。在本研究中，我们从人胎儿心脏组织培养多能MSCs，并使用慢性氧化应激/低血清方法诱导典型的衰老。通过扫描整个线粒体基因组中CpG甲基化的状态，我们发现msc中随着衰老，mtDNA有相当程度的低甲基化。COX1编码细胞色素c氧化酶复合物的主要亚基，在衰老的MSCs中显著上调。敲低三种DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a和DNMT3B)也可上调COX1并诱导MSCs衰老。总之，我们的数据表明，线粒体CpG低甲基化可能是与MSCs细胞衰老相关的有用生物标志物。

在解密控制细胞衰老的调节途径方面取得了重大进展。有两个不同的途径，导致细胞衰老的发展[47.，52.，53.］．复制性衰老(Replicative ageing, RS)是由位于染色体末端的端粒(端粒)中重复DNA序列(TTAGGG)的逐渐缩短引起的生物钟功能障碍。这种缩短最终会引发DNA损伤并启动细胞周期阻滞程序。相反，压力诱导的早衰(SIPS)虽然与那些经历复制性衰老的早衰有许多细胞和分子特征，但却是端粒独立的。在SIPS中，ROS诱导细胞功能障碍，在年龄相关疾病中发挥关键作用[54.］．在SIPS衰老模型中，氧化应激常被用作SIPS衰老的诱导因子[55.］．早期通道的细胞曝光一次或几次至急性的核氧化胁迫，例如H.₂O₂［56.，57.］．为了捕捉复制衰老和SIPS的特征，我们采用了一种改进的方法，将MSCs暴露于低浓度的H₂O₂血清供应也很低利用这一策略，我们在短时间内诱导了典型的MSCs细胞衰老，通常为2-3代。值得注意的是，这些衰老细胞表现出缩短的端粒。RNA-Seq证实，衰老伴随着与复制衰老相同的通路的激活。因此，该方法可能为研究MSCs细胞衰老提供了一个理想的模型。未来的研究将需要全面比较该模型与两个成熟的SIPS和RS模型的基因和蛋白表达谱。

MSC的培养膨胀中的复制衰老似乎是通过在基因组DNA水平的DNA甲基化和抑制组蛋白标记进行表现意见[58.］．然而，线粒体基因组在MSCs衰老中的表观遗传调控尚不明确[30.，59.］．年龄相关的mtDNA突变积累被认为是老年人中发现的年龄相关线粒体呼吸缺陷的原因。衰老表型是可逆的，受表观遗传调控。老年成纤维细胞的重编程修复与年龄相关的线粒体呼吸缺陷[60.］．我们测量了从人胎儿心脏组织培养的衰老MSCs中mtDNA甲基化的状态。总的来说，衰老的MSCs中mtDNA普遍低甲基化。这与人类血液样本和肺组织中mtDNA甲基化的程度一致[61.］．然而，我们注意到在细胞衰老过程中mtDNA甲基化的显著变化。特别是CpG岛4的mtDNA变得更低甲基化。这种与衰老相关的mtDNA去甲基化在成人皮肤培养的成纤维细胞中也被观察到，并与来自新生儿皮肤组织的成纤维细胞进行了比较。显然，线粒体基因组在细胞衰老过程中经历表观遗传改变。

随着mtDNA甲基化的改变，包括CpG island 4在内的线粒体COX1基因在所有老化的MSCs中均上调，这在mRNA和蛋白酶水平上都显示出来。COX1编码细胞色素c氧化酶I，是细胞色素c氧化酶复合物的主要亚基，是有氧代谢的关键酶[62.］．在原核生物和真核生物中，血红素铜氧化酶是呼吸链的末端能量转移酶。线粒体产生腺苷5 ' -三磷酸(ATP)，但也产生潜在的有毒活性氧(ROS) [59.］．随着年龄的增长，线粒体功能逐渐丧失。mtDNA损伤的持续积累可能在衰老过程中起因果作用。然而，目前尚不清楚在我们的模型中，COX1上调是否在功能上参与了衰老的启动，或者仅仅是衰老过程的后遗症。

目前，我们对MTDNA甲基化在我们衰老模型中基因活性调节中起作用的作用知之甚少。例如，CpG岛4位于线粒体COX1基因的3位区域，而不是在D圈启动子区域中，在那里我们可能期望CPG岛施加表观遗传控制。然而，几项研究表明基因体内的基因体DNA甲基化的作用[63.- - - - - -65.］．此外，我们还发现使用shRNA敲低DNA甲基转移酶可诱导MSCs中COX1的上调(图)5（d）)，与细胞衰老同时发生(图5 (c))，支持mtDNA低甲基化在调控COX1中的作用。DNMT1是哺乳动物细胞中含量最丰富的DNA甲基转移酶，是维持哺乳动物DNA甲基化所必需的关键甲基转移酶。它主要催化半甲基化CpG二核苷酸的甲基化[66.］．DNMT1纯合缺失对妊娠10-11天的小鼠胚胎是致命的[67.］．另一方面，DNMT3A和DNMT3B都是新创甲基转移酶[66.］．在哺乳动物发展中，在哺乳动物发展中的建立，维护和擦除外延型，包括基因组印记需要所有三种酶68.，69.］．在我们的诱导衰老模型中，这三种DNMTs在衰老MSCs中下调(图)5(一个))．重要的是，在没有氧化应激的情况下，shRNA的DNMTS敲低也诱导MSC中的细胞衰老（图5 (c))．我们的数据表明，所有三个DNMTS都参与了MSC的衰老。应该注意的是，shRNA的DNMTS敲低也诱导全球DNA去甲基化，包括基因组DNA。此外，目前尚不清楚MTDNA低甲基化是我们模型的特定生物标志物。特别是，我们不知道是否可能发生在复制衰老和啜饮模型中。未来的研究需要通过比较这些模型中线粒体DNA的表观遗传学来进行。我们可以使用特定于现场的de Novo DNA甲基化或去甲基化来了解更多关于表观遗传控制，可由CRISPR CAS9-SSS1表观遗传调节剂诱导的[43.］．

5。结论

总之，通过扫描线粒体基因组中的DNA甲基化，我们证明了异常表观遗传学与MSCs衰老发生的关联。在衰老MSCs和dnmt敲除MSCs中，mtDNA甲基化的改变都伴随着COX1基因的上调。因此，这项研究表明mtDNA表观型在MSCs细胞衰老过程中是一个关键的生物标志物。

缩写

MSCS：	间充质干细胞
mtDNA:	线粒体DNA
DNMT:	DNA甲基转移酶
CPG：	一个胞嘧啶核苷酸后面跟着一个鸟嘌呤核苷酸的DNA区域，只被一个磷酸盐隔开。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

所有作者阅读并认可的终稿。

致谢

这项工作得到了格伦实验室老化生物学的种子基金的支持，安德鲁·r·霍夫曼;国家自然科学基金(81272294,31430021)，国家重点基础研究发展计划(973计划)(2015CB943303)，美国加州再生医学研究所(CIRM)资助项目(RT2-01942);国家自然科学基金资助项目(81372835,81670143)和吉林省科技国际合作项目(20130413010GH)资助;教育部重点项目(311015)资助;NIH拨款1RO1ES020812给Pinchas Cohen;国家自然科学基金资助项目(81302380);吉林省科技厅青年发展基金资助项目(20140520017JH)

补充材料

参考

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