隔离的msc胎儿心脏组织方法如前所述[后执行 3, 16)做了一些调整。短暂,胎儿心脏组织从天45 - 67的胚胎获得人体组织网络(中心实验室对人类胚胎组织,华盛顿大学,西澳)在磷酸盐(PBS)。抵达后,组织碎用剃刀成小块。为了避免破坏心脏干细胞利基,我们没有组织胶原酶消化。相反,剁碎的心脏组织直接播种在10厘米板与少量的DMEM(2 - 3毫升)含10%胎牛血清(FCS)和抗生素和培养在37°C公司5%₂湿润的气氛。心脏组织成为附加到板后,少量的新鲜培养基添加到板没有扰乱组织每天。5 - 7天后,msc开始迁移从心脏移植培养的msc收集进一步的扩张。msc在章节3 - 5是用于分析。msc从胎儿皮肤组织被孤立的使用相同的方法和用于与HMSCs平行研究。实验机构审查委员会批准的协议/斯坦福大学干细胞研究监督小组。

胎儿心脏的msc培养(HMSCs)以流式细胞术使用干细胞标记如前所述[ 31日]。收集细胞的浓度 1 × 10 6 细胞/毫升含有0.1% BSA的磷酸盐(PBS)。在4°C细胞孵化抗体MSC-markers (CD90、CD73和CD105),造血细胞标记(CD45、CD34、CD14、CD19),和受体细胞外基质(CD29、CD44)和主要组织相容性(HLA-DR)(都来自BD生物科学,CA)。三十分钟后抗体孵育,细胞被洗,并于300年暂停 μL PBS。流式细胞仪进行使用FACSCAria三世细胞分选仪(BD生物科学,CA) [ 32- - - - - - 35]。

鉴别潜在的分离msc脂肪形成的和成骨的血统了如前所述[ 32- - - - - - 35]。感应后,细胞被沾油红O和茜素红(美国σ)检测中性脂质空泡的存在在骨细胞分化的脂肪细胞和钙沉积,分别。

模仿复制衰老在msc ( 36, 37),我们采用了一种新的方法,长期暴露低细胞氧化应激和低血清环境。特别是HMSCs在通道3 - 5在大约50%融合不断暴露在低浓度的过氧化氢(50 µM H₂O₂在DMEM补充5%的边后卫。使用这种方法,msc表现出典型的senescence-like形态后2 - 3段。细胞收集RNA-Seq分析(北京荣誉科技有限公司,北京,中国)。

细胞衰老是量化的SA -通过测量活动 β加如前所述[ 38, 39]。msc收集和固定在室温下用3%甲醛3 - 5分钟。与PBS洗涤后,细胞被孵化与刚做好的senescence-associated SA - 37°C β加染色溶液:1毫克/毫升5-bromo-4-chloro-3-indolyl P3-D-galactoside(半乳糖苷),40毫米柠檬酸/磷酸钠,pH值6.0,5毫米亚铁氰化钾,5毫米铁氰化钾,MgCl2 150毫米氯化钠,2毫米。隔夜孵化后,细胞的SA - β加染色评估使用microscope-mounted相机。

的相对端粒的长度被定量PCR估计之前报道( 40, 41]。短暂,基因组DNA提取试剂盒DNeasy血液和组织工具包(试剂盒、钙、美国)。稀释后,35 ng / μ在95°C l DNA被加热5分钟,在冰上冷却5分钟。DNA样本被放置在一个20 μ包含10 l实时qPCR反应系统 μl 2×SYBR预拌缓冲(罗氏公司、上海、中国),2 μ正向和反向引物。引物的序列包括(1)端粒向前:5′-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3′(100海里)和反向:5′-TCCCGACTATCCCTATCCCTTCCCTATCCCTATCCCTA-3′(300海里);和(2) β球蛋白转发:5′- GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3′(150海里)和反向:5′-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3′(150海里)。PCR扩增过程是一个周期在95°C 10分钟和40周期为15秒95°C, 56°C 30年代,30年代和72°C (ABI SepOnePlus,北京)。端粒长度估计的相对端粒的副本和副本之间的比例 β球蛋白(T / S)。T / S值计算 2 - - - - - - Δ Δ C t ( 40, 41]。

比较衰老和心脏发展途径的基因是由RNA-Seq [ 42]。使用Qiazol总RNA分离(试剂盒,CA)和用于索引库准备使用Illumina公司TruSeq RNA样本准备工具包v2。图书馆使用HiSeq4000测序(Illumina公司)和产生大约3400万读取的长度每样150个基点。基因数量归一化的值读取每千碱基记录每百万映射读取(RPKM)。KEGG通路被选为显著监管如果纠正 P 荣誉值小于0.05(北京科技有限公司有限公司,北京,中国)。

DNeasy细胞线粒体和总DNA提取的血液和组织工具包(试剂盒,CA)和治疗通过亚硫酸氢钠使用EZ DNA甲基化™工具(Zymo, CA),协议后,由制造商提供。最初,我们获得mtDNA孤立与亚硫酸氢钠和治疗线粒体DNA克隆测序。之后,我们发现,该协议可以大大简化,只需用总基因组DNA PCR引物的线粒体DNA。

Bisulfite-treated放大了DNA聚合酶链反应(PCR)在液体蜡在6 µl反应包含2 µl (3×Klen-Taq我混合,2 µl模板DNA和1 µl的2.5 µM底漆。在95°C孵化后5分钟,DNA是由38个周期放大95°C的20年代,20年代的退火62°C, 72°C的20年代在72°C扩展和最后扩展2分钟。甲基化PCR引物序列表中列出 年代 1 (见表S1在网上补充材料 https://doi.org/10.1155/2017/1764549)。

mtDNA甲基化状态是由限制性内切酶消化。PCR dna被Taq消化我在65°C 2 h或HpyCH4IV 37°C 2 h和3%琼脂糖凝胶上分离。TCGA Taq我认识到网站和HpyCH4IV消化ACGT站点。治疗后与硫酸氢钠,unmethylated胞核嘧啶转化为尿嘧啶( 43, 44]。因此,甲基化mtDNA将限制性内切酶消化。相比之下,unmethylated mtDNAs将转换为TTGA ATGT,不消化Taq我和HpyCH4IV,分别。甲基化和unmethylated乐队为定量进行扫描。

两个不同的RNA干扰寡核苷酸针对每个DNMT基因是由H1和U6推动者,分别被PCR联合subcloned成pGreen-puro慢病毒载体。种能阻碍DNMT3b DNMT3a针对DNMT1的寡核苷酸序列,如下:DNMT1 (A): 5′-GCCCAATGAGACTGACATCAA-3′;DNMT1 (B): 5′-GGAACCAAGCAAGAAGTGA-3′;DNMT3a (A): 5′-AGCGGGCAAAGAACAGAAG-3′;DNMT3a (B): 5′-CCAGATGTTCTTCGCTAATAA-3′;DNMT3b (A): 5′-CCTGTCATTGTTTGATGGCAT-3′;DNMT3b (B): 5′-CCATGCAACGATCTCTCAAAT-3′。控制序列的争夺是5′-GCTTCAATTCGCGCACCTA-3′。

病毒包装,转染293 T细胞2 µg的每个构建慢病毒表达。转染是2000年使用Lipofectamine six-well板块(美国表达载体)。病毒上清液收集在转染后24和48 h。在添加聚凝胺(8 µ克毫升⁻¹),上层清液放在培养HMSCs细胞。细胞转染提高转染效率的两倍。

rt - pcr用于量化衰老相关基因的表达。总RNA提取试剂盒试剂(σ,密苏里州)和被转换为cDNA逆转录反应如前所述[ 45, 46]。我们设计PCR引物如下: β- - - - - - 肌动蛋白:5′-CAGGTCATCACCATTGGCAATGAGC-3′(向前)和5′-CGGATGTCCACGTCACACTTCATGA-3′(反向); caveolin-1:5′-TCCCATCCGGGAACAGGGCAACAT-3′(向前)和5′-GTCCCTTCTGGTTCTGCAATC-3′(反向); P16:5′-CGGATAATTCAAGAGCTAACAGGT-3”(向前)和5′-GGCCTCCGACCGTAACTATTCGGT-3′(反向); P21:5′-GTGGACCTGTCACTGTCTTGTAC-3′(向前)和5′-GCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGC-3′(反向);载脂蛋白:5′-GGTCTCWGACAATGAGCTCCA-3(向前)和5′-TCCCAGAGGGCCATCATGGTC-3′(反向); COX1:5′-CAGCATGCCCCAGGATTTGTC-3′(向前)和5′-CAKGTCCTGCTCCAGGGCAGC-3′(反向, K = G / T )。PCR扩增是由1周期在95°C 5分钟和33周期20年代在95°C, 62°C 15秒,72°C 15秒,最后一个扩展周期在72°C 5分钟。

COX1活动是由细胞对细胞色素C氧化酶染色。msc ( 1 × 10 6 )在6-well镀板和培养24小时。细胞被冲洗3次与PBS和空气干燥。细胞培养15分钟在预培养介质(RT 50 mM Tris-HCl, pH值7.6;0.29 M蔗糖;2.2毫米氯化钴)和与缓冲我冲洗(0.1磷酸钠pH值7.6;10%蔗糖)。细胞培养4小时37°C在10毫升孵化介质(pH值7.4,0.1 M磷酸钠pH值7.6,10%蔗糖,10毫克细胞色素C(σ,密苏里州),10毫克轻拍(3、3′-diaminobenzidine)盐酸盐(σ,密苏里州)、过氧化氢酶和2.0毫克(σ,密苏里州))。细胞被冲洗与PBS缓冲我和5分钟后,用H₂O 5分钟,显微镜下观察。

数据使用SPSS分析软件(版本16.0;SPSS, Inc ., IL)。学生的 t 以及或单向方差分析(Bonferroni测试)被用来比较治疗组间的统计差异变量。数据被表示为平均数±标准差。所有的实验进行了一式三份,被认为具有统计显著性结果 P < 0.05 。

从不同组织分离msc,尽管他们分子一致,表现出强烈的偏见在基因和蛋白表达,通路活动,和谱系分化,表明存在“分子组织起源的记忆” 14]。这些守恒瀑特异功能可能使他们更合适作为细胞治疗药物的器官来源,尤其是在“ 原位重编程”或“ 原位差异化”模型。值得注意的是,鼠新生儿心脏可以再生和重建受损部分导致恢复正常解剖和功能没有疤痕形成,但是这种能力是失去了一个星期后时代( 2]。我们有兴趣学习如果表观遗传改变线粒体DNA参与这一衰老过程。

定义潜在的表观遗传机制这个心脏衰老,我们从人类胎儿心脏组织培养的msc,认为维持充分的再生潜力。附着msc成长~ 8 - 12天之后的初始组织播种和收集使用流式细胞仪表型分析。我们发现干细胞标记在孤立的msc普遍表示,包括CD105, CD73, CD90、CD44、CD29(图 1(一))。-干细胞标记,包括CD34、CD45 CD14、CD19,和HLA-DR表示在非常低的水平。孤立HMSCs可以分化成脂肪形成的和成骨的血统(图 1 (b))。这些数据表明,胎儿心脏的msc培养表现出的潜力multilineage分化之前报道( 3, 14, 16]。

作为组织msc表现出很强的“分子组织起源的记忆” 14),我们使用RNA-Seq检查途径与心脏发育相关基因( 4- - - - - - 8]。我们发现基因在HMSCs心脏编程也表示,包括AKT通路,叫家人,TBX家族基因(图 1 (c))。这些数据表明,这些HMSCs可能作为一个适当的模型来研究心脏衰老。

两种类型的诱导衰老通常被用于研究衰老 在体外,包括复制衰老(RS)和压力诱导过早衰老(口) 47- - - - - - 49]。RS染色体端粒缩短的特点是进步的,它发生在每一个细胞分裂。虽然它是一个很好的模仿自然衰老过程,诱导衰老非常耗时。另一方面,口接触subcytotoxic应力引起的,没有端粒缩短细胞经历过早衰老。口是最常用的模型在研究老化。然而,细胞毒性遇到在这个模型中,特别是高浓度的过氧化氢。因此,口可能不是一个合适的模型 在活的有机体内病理生理衰老心脏干细胞。

在这项研究中,我们建立了一个新的模型结合RS和口的优点。在这个模型中,我们促进复制衰老的发生,一个新的“两面夹攻”的方法。胎儿heart-derived msc (HMSCs)同时暴露在低剂量的过氧化氢(50 µ米)和低血清(5%)在细胞培养。假定,暴露于低剂量的过氧化氢会产生更少的毒性比通常遇到的小口。与此同时,低血清暴露将加速衰老的发展。结合接触2 - 3通道后,我们发现HMSCs扁平的形态学和细胞增殖减少展出。治疗(SA - msc senescence-associated呈阳性的β-半乳糖 β加)活动(数据 2(一个)和 2 (b))。

然后我们用PCR量化伴随老化基因曾被报导过( 38, 39, 50]。我们发现caveolin-1基因(CAV1)是调节在衰老msc(图 2 (c)),尽管我们没有检测到显著改变APO-J OX1。P21也是调节与细胞衰老(图 2 (d))。未来的研究需要明确的时间点senescence-inducing p53、p21开始调节时的刺激。

为了进一步描述衰老细胞,使用定量PCR我们测量染色体端粒的长度。通过比较三个模型中端粒长度,很明显,我们的模型的衰老细胞的端粒缩短类似复制衰老细胞(图 2 (e))。正如所料,没有明显的细胞中端粒长度的变化是接受高剂量的过氧化氢。此外,使用RNA-Seq我们发现先前确定的路径复制衰老细胞( 42, 51]也激活衰老细胞中(图S1-S2)。总之,这些数据表明,我们的模型有一个容易复制衰老表型。

描绘的表观遗传机制细胞衰老,我们使用亚硫酸氢钠评估DNA甲基化测序总共11 CpG岛整个线粒体基因组(图 3(一个))。使用限制性内切酶区分甲基化和unmethylated论文认定,我们发现主要是线粒体基因组unmethylated。三个CpG岛表现出相当大的mtDNA hypomethylation衰老HMSCs,包括CpG岛4,1和2(图 3 (b))。也观察到类似mtDNA甲基化模式smsc(图 3 (c))。剩下的CpG岛,但是,显示更少的控制和衰老之间的差异msc(数字S3-S5)。我们也注意到的差异mtDNA甲基化三CpG岛(4、2、1)新生儿和成人皮肤成纤维细胞(图之间的关系 3 (d))。

线粒体DNA甲基化的程度被扫描PCR带密度估计的数量。显然,重要mtDNA hypomethylation是细胞衰老后(图中观察到 3 (e))。

CpG岛4坐落在3′线粒体COX1基因(图的地区 4(一)),编码细胞色素c氧化酶,有氧代谢的关键酶。mtDNA甲基化的程度在CpG 4下降衰老后,我们怀疑COX1表达将受此影响表观遗传调控。我们使用rt - pcr semiquantitate COX1,发现的一个重要upregulation COX1衰老(图 4 (b))。阐述,第二个线粒体基因位于下游的CpG岛2,略减少衰老msc。同样,COX1酶的活性也增加衰老msc培养胎儿心脏和皮肤组织(图 4 (c))。因此,改变mtDNA甲基化可能是伴随着细微变化线粒体酶的活性。

自从mtDNA变得hypomethylated在衰老过程中,我们测试了三个DNA甲基转移酶的作用( DNMT1 DNMT3A,和 DNMT3B控制DNA甲基化)。我们发现,这三种酶在衰老msc(图表达下调 5(一个))。

确认DNA甲基转移酶的作用在衰老,我们撞倒酶成分(图 5 (b))。有趣的是,击倒这三个酶诱导衰老和抑制细胞增殖在msc(图 5 (c)),并行的upregulation COX1(图 5 (d))。