HDAC6抑制剂挽救由诱导多能干细胞衍生的周围神经病变患者运动神经元轴突线粒体运动缺陷HSPB1突变

摘要

Charcot-Marie-Tooth病2F (CMT2F)和远端遗传性运动神经病变2B (dHMN2B)是由热休克27kda蛋白1 (HSPB1)基因，目前还没有专门的治疗方法。在这里，我们评估了HDAC6抑制剂对周围神经病变的潜在治疗效果HSPB1使用来自CMT2F和DHMN2B患者的诱导多能干细胞（IPSC）的运动神经元体外模型的突变。在CMT2F电动机神经元和DHMN2B电机神经元中，线粒体运动的绝对速度和轴突中的移动线粒体的百分比低于对照中的DHMN2B-电机神经元，并且两种疾病模型之间存在缺陷线粒体运动的严重程度。CMT2F电机神经元和DHMN2B电机神经元也表现出降低-微管蛋白乙酰化新开发的HDAC6抑制剂，CHEMICAL X4和CHEMICAL X9，增加了乙酰化-Tubulin和CMT2F电机神经元和DHMN2B电机神经元线粒体的逆转轴突运动缺陷。我们的研究结果表明，衍生自患者特异性IPSC的神经元可用于药物筛选，包括靶向外周神经病变的HDAC6抑制剂。

1.介绍

Charcot-Marie-Doother疾病（CMT）和相关神经病是一种非均相神经变性疾病，其含有类似的表型。到目前为止，已经确定了近40个基因对这些疾病负责[1]。根据电生理和组织病理学特征，CMT主要分为脱髓鞘神经病理（CMT1）和轴突神经病理（CMT2）。在这些类型中，CMT型2F（CMT2F）和远端遗传运动神经病变2B（DHMN2B）是由热冲击27kDa蛋白1引起的（HSPB1，亦称HSP27) 7q11.23染色体突变[2]。CMT2F和dHMN2B最常见的病理是轴突运输和细胞骨架组织异常[3.- - - - - -5]。然而，我们对其潜在分子机制的了解仍然有限，而且还没有具体的治疗方法。

HSPB1是一类小热休克蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)，通过其保守结构在细胞应激反应中形成动态的四级结构晶状体蛋白域。除了在蛋白质重折叠中发挥作用外，HSPB1还参与蛋白质翻译、细胞内还原/氧化状态、细胞骨架结构、细胞分化和凋亡[6]。虽然Hspb1在各种组织中普遍表达，但突变HSPB1似乎只在周围神经系统引起神经元变性，主要通过细胞骨架成分的改变。在临床上,是dHMN2B的原因，然而是CMT2F和dHMN2B的病因[2]。先前转染细胞系的研究表明表达破坏神经丝(NF)网络并增加NFs的毒性聚集[3.),而这两个和表达通过减少驱动蛋白与NFs的结合并诱导周期蛋白依赖的激酶5介导的NFs的超磷酸化来干扰NFs的顺行运输[5]。另外，突变HSPB1也会影响轴突微管轨道。在稳定的细胞系和症状前转基因小鼠中，表达导致微管蛋白轨道异常稳定，这是由于微管蛋白之间过度活跃的相互作用和微管蛋白(4]。此外，症状转基因和小鼠的乙酰化程度降低-坐骨神经微管蛋白表达小鼠在背根神经节中运动的线粒体较少[7]。然而，需要更多与CMT2F相关的生理和特异性细胞模型来确定确切的疾病机制和评估候选药物筛选的效果。

组蛋白去乙酰化酶6 (Histone deacetylase 6, HDAC6)是IIb类HDAC，调节的乙酰化状态微管蛋白(8，9]。此外，HDAC6抑制CMT2F的小鼠模型中的逆向轴向轴向传输缺陷[7和帕金森氏病的细胞模型[10和亨廷顿氏舞蹈症[11]通过增加乙酰化微管蛋白。因此，我们评估了包括tubastatin A和新开发的CHEMICAL X4和CHEMICAL X9 (Chong Kun Dang Pharmaceutical Cooperation, Seoul, Korea)在内的HDAC6抑制剂对来自患者携带的诱导多能干细胞(iPSCs)分化的CMT2F-和dhmn2b特异性运动神经元(MNs)的治疗效果和突变，通过分析线粒体运动和乙酰化微管蛋白在体外。

2。材料和方法

2．1．伦理声明和人体样本

皮肤成纤维细胞取自两名携带HSPB1突变型(S135F和P182L)的患者的皮肤活检(4mm punch)，经机构审查委员会批准(ECT 11-58-37，梨花女子大学，木洞医院，韩国首尔)。所有实验都是按照批准的指导方针和规定进行的。将新鲜皮肤样品剁碎，在含有10 mg/mL IV型胶原酶、50 U/mL disase和0.05%胰酶/EDTA的Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM)中在37℃下消化40分钟。通过细胞滤器过滤后(70μ在含20%胎牛血清(FBS)和100μ青霉素g / mL /链霉素。

2．2．代的万能

四种含仙台病毒的载体，每种载体表达不同的转录因子(Sox2，Oct4，Klf4,原癌基因;Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）被引入到通过以下制造商的方案患有多种感染患者的成纤维细胞。在第7天，细胞被胰蛋白酶化并转移到丝霉素C（Sigma，St.Louis，Mo，USA） - 过生的小鼠胚胎成纤维细胞，SN1饲养细胞（Cell Biolabs，Inc.，San Diolabs，CA，USA）上，并收获胚胎干细胞（ESC）/ IPSC介质（敲除，Gibco，Grand Island，NY，USA），其含有4ng / ml碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）。媒体每天都发生了变化。在第30天，基于它们的形态特征来选择IPSC菌落。用作对照的其他干细胞包括人体ESC（WICELL，麦迪逊，WI，USA）和人类IPSC（HFSIPS1;韩国国家干细胞银行，韩国，张建国，韩国）。

2．3.核型分析

CMT2F-iPSCs和dHMN2B-iPSCs在没有喂食细胞的情况下培养10代细胞，Seegene医学基金会(首尔，韩国)对每种类型的iPSCs的20个细胞进行核型分析。

２.４.畸胎瘤化验

相同的Matrigel混合物（康宁，康宁，纽约，美国）和1.0×10的混合物⁶将人ESCs (WA09)、人iPSCs (hFSiPS1)、CMT2F-iPSCs或dHMN2B-iPSCs皮下注射到5周龄雌性NOD/SCID小鼠背部(韩国大田生命科学技术研究院实验动物资源中心，韩国)。异种移植物允许生长8周，然后通过外科手术将其外植。畸胎瘤组织用10%甲醛固定，石蜡包埋。组织学分析采用苏木精和伊红染色。

2．5．胚状体- (EB-)介导的体外分化试验

将ESCs和iPSCs镀到超低结合板(即无涂层培养皿)上，用ESC/iPSC培养基(KnockOut)悬浮培养，每隔一天更换一次。漂浮培养8天后，将EBs转移到凝胶涂层(Sigma)室载玻片(Nalgene/Nunc, Rochester, NY, USA)上，并在10%胎牛血清/DMEM (Welgene，大邱，韩国)中培养，随机分化为3个胚层细胞，再培养8天。

2.6。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

用于总表达和内源性表达的检测KLF4, OCT4、SOX2和c-我的C和HSPB1，用TRIzol提取ESCs和iPSCs的RNA。采用AMV逆转录酶(Promega, Madison, WI, USA)进行逆转录，PCR采用前Taq.聚合酶(Takara Bio，大津，日本)。引物序列为KLF4 CDR (108 bp) 5 ' -CTG CGG CAA AAC CTA CAC AAA-3 '(正向)和5 ' -GCG AAT TTC CAT CCA CAG CC -3 '(反向);KLF4 UTR (96 bp) 5 ' -CAT GGT CAA GTT CCC AAC TGA G-3 '(正向)和5 ' -CAC AGA CCC CAT CTG TTC TTT G-3 '(反向);OCT3/4 CDR (161 bp) 5 ' -CAG TGC CCG AAA CCC ACA C-3 '(正向)和5 ' -GGA GAC CCA GCA GCC TCA AA-3 '(反向);OCT3/4 UTR (120 bp) 5 ' -GAA AAC CTG GAG TTT GTG CCT -3 '(正向)和5 ' -TCA CCT TCC CTC CAA CCA GTT-3 '(反向);SOX2 CDR (131 bp) 5 ' -TAC CTC TTC CTC CCA CTC C-3 '(正向)和5 ' -GGT AGT GCT GGG ACA TGT GA-3 '(反向);SOX2 UTR (105 bp) 5 ' -CCC GGT ACG CTC AAA AAG AA-3 '(正向)和5 ' -GGT TTT TGC GTG AGT GTG GAT-3 '(反向);c-MYC CDR (380 bp) 5 ' -CGT CCT CGG ATT CTC TGC TC-3 '(正向)和5 ' -GCT GGT GCA TTT TCG GTT GT-3 '(反向);c-MYC UTR (328 bp) 5 ' -GCG TCC TGG GAA GGG AGA TCC GGA GC-3 '(正向)和5 ' -TTG AGG GGC ATC GTC GCG GGA GGC TG-3 '(反向)。

2.7。桑格测序

使用3730xL DNA分析仪（Macrogen Inc.，Seoul，Korea）的Sanger测序并使用Sequencher V.5.2.3进行分析乔木，MI，美国）。用于放大和测序的引物如下：5'-TTT CTG AGC AGA CGT CCA-3'（前进）和5'-CTT TAC TTG GCG GCA GTC TC-3'（反向）。

2.8。将IPSC的指向差异化为MNS

为了产生EBs，将ESCs和iPSC的菌落酶解成小块，在含有10个ESC/iPSC培养基(KnockOut)的培养皿中悬浮培养2天μM RHO相关激酶抑制剂Y27632（Tocris Bioscience，Bristol，UK），20ng / ml BFGF（Invitrogen），10 μM SB435142（Stemgent，Cambridge，MA）和0.2 μM LDN193189（Stemgent）和青霉素/链霉素。第5天，用于亚硫化化，视黄酸（1 μM;Sigma)，抗坏血酸(0.4μg / ml;Sigma），脑源性神经营养因子（10ng / ml;研发，明尼阿波利斯，Mn，USA）和N2补充剂（1％; Gibco）[12]。第7天，用于腹侧化的超音hedgehog基因激动剂purmorphamine (1μM;加入Stemgent)，停止双SMAD抑制剂(SB435142和LDN193189)。第17天，将基础培养基改为含有所有先前指示因子的神经基础培养基(Invitrogen)，并添加胰岛素样生长因子-1 (10 ng/mL)、胶质细胞系来源的神经营养因子(10 ng/mL)和B27 (2%;Gibco)。第21天，用锐化酶(Gibco)分离神经球，并将其放在聚l -赖氨酸/层压蛋白包被的培养板或载玻片室(Nalgene)上，并添加含有所有先前指示因子的神经基础培养基β巯基乙醇(25μM;和谷氨酸(25μM;Sigma）。

2.9。免疫印迹分析

用RIPA裂解缓冲液(150 mM NaCl, 1.0% NP-40, 0.5%去氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，50 mM Tris, pH 8.0)常规方法收集分化mnn的蛋白。SDS-PAGE凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上。印迹,anti-acetylated-tubulin (1: 1000;鼠标，6-11b-1，abcam，剑桥，英国）和反-tubulin (1: 1000;小鼠免疫球蛋白₁使用DM1A、Sigma)抗体。采用UN-SCAN-IT凝胶软件(Silk Scientific, Inc.， Orem, UT, USA)分析条带密度。

2.10。免疫细胞化学

用4%多聚甲醛固定细胞，用10%正常山羊血清(Gibco)和0.2% Triton X-100阻断细胞。一抗为抗ssea4 (1: 100;小鼠免疫球蛋白_3.， MC-813-70, Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)， Iowa City, IA, USA)， anti-NANOG (1: 500;小鼠免疫球蛋白₁， NNG-811, Abcam)，反胎蛋白(法新社;1: 100;鼠标， 2A9, Abcam)，反-平滑肌肌动蛋白(SMA;1: 100;鼠标， 1A4, Abcam)，抗巢蛋白(1:1000;小鼠IgG1, 10C2, Abcam)，抗hb9 (1: 100;小鼠IgG1, 81.5 5c10, DSHB)， anti- ISL1/2 (ISL1/2;1: 50;鼠标， 39.4DS, DSHB)，抗神经丝H非磷酸化(SMI32;1: 500;小鼠免疫球蛋白₁抗神经元特异性β - III微管蛋白(Tuj1;1: 1000;兔抗微管相关蛋白2 (MAP2;1: 200;兔多克隆，Millipore, Billerica, MA, USA)，抗胆碱乙酰转移酶(ChAT;1: 1000;兔多克隆，Abcam)，抗突触蛋白1 (1:1000;兔多克隆，Abcam)，抗-Tubulin（1：500;兔多克隆，ABCAM）和抗乙酰化的-Tubulin（1：200;鼠标6-11B-1, Abcam)抗体。二抗为Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG(预吸附;Abcam)、cy3标记山羊抗兔IgG (Abcam)、fitc标记山羊抗小鼠IgG (Abcam)、cy3标记山羊抗小鼠IgG (Abcam)抗体。

2.11。微流控培养分析轴突线粒体运动

从ESCs和iPSCs中提取的神经球用accutase分离成单个细胞，并以1 × 10的密度接种到微通道板上⁵细胞/板和用神经缺失（Invitrogen）和B27培养基培养10天。轴突完全伸展后μm型槽(总长度= 833.4μm)和到达对面隔间，MNs用lipofectamine 2000 (Invitrogen)递送的mito-dsRED2 (Clonetech Inc./Takara Bio)转染。转染后3天内，荧光显微镜以121张/2分钟的速率捕捉线粒体图像，并将其堆叠成一个文件，形成kymographs。利用ImageJ软件在kymograph上测量角度和距离，计算线粒体运动速度。使用ImageJ测量轴突长度。轴突长度由单个轴突延伸的长度之和计算μm型槽和已知槽长(833.4μ米)。

2.12。药物治疗

为了分析蛋白乙酰化水平，用HDAC6抑制剂tubastatin A (5μM;Selleckchem, Houston, TX, USA)， CHEMICAL X4 (0.5μ米和5μM)和X9 (0.5μ米和5μM) 16小时。为分析轴突转运，上述HDAC6抑制剂治疗3小时。CHEMICAL X4和X9是Chong Kun Dang制药合作公司(首尔，韩国)新建立的HDAC6抑制剂。X4和X9的常见结构由三个组成部分(锌粘合剂，连接剂和帽部分)，是非常有效的羟基酸酯基HDAC6抑制剂[IC_50.(HDAC6) = 5.3和3.7 nM。与泛HDAC或其他HDAC亚型特异性抑制剂类似，羟肟酸部分作为锌结合基团对阻断HDAC6的催化活性非常重要。尽管这些化合物在结构上有不同的帽子部分(芳基脲和吲哚)，但它们共享苄基作为连接部分，从而产生足够的HDAC6特异性[fold (HDAC1/HDAC6) = 400和>270]。在细胞和动物中提供理想的疗效，而不具有与I类HDAC亚型抑制相关的毒性。

2.13。统计分析

值表示为平均值±平均值的标准误差。组间比较采用GraphPad Prism(版本5;GraphPad软件公司，La Jolla, CA, USA)。统计显著性设为．

3.结果

3.1。生成CMT2F-IPSCS和DHMN2B-IPSCS

1例CMT2F患者(女性/52岁，韩国)具有404C>T (S135F)突变，1例dHMN2B患者(女性/8岁，韩国)具有545C>T (P182L)突变HSPB1基因。CMT2F和DHMN2B患者均显示出主要的远端腿部肌肉弱点和脚趾步态异常。发病年龄分别为20年，7年。CMT2F患者中，Sensory Neve传导速度和群体神经的动作电位减少，但在DHMN2B患者的正常范围内。

通过仙台病毒转导四种episomes载体，将皮肤成纤维细胞重编程为iPSCsKLF4、OCT3/4 SOX2,和原癌基因(数据1(一)和1 (b)）.CMT2F-iPSC和dHMN2B-iPSC菌落的形态与人类ESCs (WA09)相似，由核质比高的细胞组成，细胞致密，呈扁平的鹅卵石状，边缘锋利(图)1 (c)）.CMT2F-iPSCs和dHMN2B-iPSCs的基因背景在重编程过程中没有发生改变，特别是在突变位点HSPB1(图1 (d)）.CMT2F-iPSCs和dHMN2B-iPSCs保持正常的核型(图)1 (e)）.内源性表达KLF4、OCT3/4 SOX2,和原癌基因基因经过几次亚传代后，使用与目的mRNA内含子区域互补的引物进行RT-PCR检测(图)1（f））.10个细胞传代后，iPSCs中未检测到仙台病毒基因组含量(见补充材料补充图S1)http://dx.doi.org/10.1155/2016/9475981）.CMT2F-IPSCS和DHMN2B-IPSCS表达干细胞标记物，例如细胞质中核和SSEA中的纳米（图1（g））.CMT2F-iPSCs和dHMN2B-iPSCs的多能性通过体外通过EB形成随机分化的afp阳性内胚层细胞、sma阳性中胚层细胞和巢蛋白阳性外胚层细胞的存在得到证实(图)1（h）)和体内畸胎瘤形成(图1(我)）.

3．2．CMT2F-iPSCs和dHMN2B-iPSCs MN分化体外模型的推导

为了概述周围神经病变，根据Amoroso等人描述的方法，通过提供双SMAD抑制剂(SB435142和LDN193189)用于神经化，维甲酸用于诱导化，以及嘌呤嘧啶(purmorphamine)用于中央化，将MNs从iPSCs分化出来。[12)(图2(一个)）.完全分化的MNs(图2 (b))表达的转录因子如HB9和ISL1/2，细胞骨架标记物如Tuj1、MAP2和SMI32，以及synapsin和ChAT(图2（c））.S135F-MNs和P182L-MNs未表现出发育缺陷，可见S135F-MNs和P182L-MNs与对照WA09-MNs和hFSiPS1-MNs标记阳性细胞比例无差异(图)2（d））.WA09-MNs (μm)及S135F-MNs (μm)显示轴突长度无差异(图2（e））.神经肌肉连接，由-bungarotoxin染色(见补充图S2)， MNs与C2C12细胞分化的肌管细胞共培养形成。

3．3.S135F-MNs的轴突线粒体运输缺陷

虽然不同CMT2亚型的致病基因存在异质性，但许多疾病亚型涉及细胞运输系统的异常[13]。由于MNs的轴突长度可达1米，轴突运输缺陷可能增加轴突病的易感性。特别是，线粒体运输对于维持神经元轴突和突触的稳定极其重要。在线粒体沿着微管的双向运输过程中，质量控制是通过动态融合和裂变过程实现的，这使线粒体产生ATP以支持重要的细胞功能和缓冲细胞内钙[14]。因此，我们通过微通道板培养细胞来检测S135F-MNs和P182L-MNs是否存在线粒体轴突运输缺陷[15它将轴突与体细胞和树突分隔开来(图3（a）)，用mito-dsRED2转染细胞，并分析kymograph图像(图3（b））.我们观察到，S135F-MNS的线粒体运动的绝对速度显着降低（μM / SEC），P182L-MNS略低于P182L-MNS（μm/sec)与控制WA09-MNs (μm/秒)和hFSiPS1-MNs (μ米/秒)(图3 (c)，补充图S3和补充表S1)。此外，S135F-MNs的运动线粒体比例显著降低(%)和P182L-MNs (％）与控制WA09-MNS中的那些相比（%)和hFSiPS-MNs(图3 (d)和补充表S2）。

3.4。乙酰化作用降低α微管蛋白在S135F-MNs

轴突运输由微管的各种翻译后修饰(如去乙酰化、乙酰化和谷氨酰化)通过分子运动蛋白的招募来调节[16]。在这些修饰中，乙酰化- K40蛋白位点的微管蛋白调节动力蛋白/动力蛋白复合物和动力蛋白-1与微管的结合[11，17]。此外，用HDAC6抑制剂治疗，增加乙酰化-微管蛋白，逆转亨廷顿病细胞模型运输缺陷[11]和LRRK2突变诱导的帕金森病[9]。因此，乙酰化水平-微管蛋白作为S135F-MNs和P182L-MNs线粒体运输缺陷的指标。我们发现S135F-MNs和P182L-MNs的乙酰化程度明显降低-微管蛋白水平比较WA09-MNs或hFSiPS1-MNs(图4）.

3．5．HDAC6抑制可逆转CMT2F和dhmn2b相关疾病表型

通过使用HDAC6抑制剂治疗，包括tubastatin A (5μM)和新开发的CHEMICAL X4 (0.5μ米和5μM)和X9 (0.5μ米和5μ米),乙酰化作用的S135F-MNs和P182L-MNs的-tubulin增加(补充图S4，图4)5(一个)和5 (b)）.此外，这些HDAC6抑制剂处理后，线粒体运动的绝对速度和轴突中线粒体运动的比例显著增加(图)5 (c)和5 (d)和附录表S1和S2)。

4.讨论

由于IPSCS作为无限制的细胞来源，可以引起神经元谱系，并且有助于克服由于神经元后性能因患者而受影响的神经元组织的不可用的障碍，以体外建模和药物筛查与IPSCS可以推进对神经变性的基础研究疾病。因此，本研究中最强点之一是CMT2F和DHMN2B特异性体外细胞模型可用于筛选推定的治疗分子，例如外周神经病变上的HDAC6抑制剂。

HDAC6是IIb型HDAC，调节细胞质靶蛋白去乙酰化。由于HDAC6参与细胞骨架形成、细胞氧化/还原状态的调节和泛素-蛋白酶体系统，抑制HDAC6可改善神经元的病理条件，如轴突运输损伤、氧化应激和体外蛋白聚集体形成[18，19]。在轴突转运方面，HDAC6抑制剂通过增加乙酰化来逆转CMT2F和dhmn2b相关的轴突转运微管蛋白。在本研究中，新开发的HDAC6抑制剂的半最大抑制浓度(IC_50.图巴斯汀A对线粒体轴突运输的改善效果较图巴斯汀A低10倍。

CMT2F-iPSCs和dHMN2B-iPSCs由患者来源的皮肤成纤维细胞携带HSPB1的404C>T (S135F)和545C>T (P182L)突变，通过强制表达KLF4、OCT3/4 SOX2,和原癌基因使用仙台病毒载体在建立了几个干细胞集落后，每个患者使用两个集落克隆进行进一步分析，以避免克隆变异造成的差异，并将选定的iPSCs分化为具有定义的细胞因子的运动神经元。为了总结体外轴突病理，将患者特异性的运动神经元培养在用于分离神经元室微环境的微通道板中。在该系统中，CMT2F和dHMN2B的特定细胞模型线粒体运输出现缺陷，运动线粒体的绝对速度和百分比均低于对照mnn。在P182L-MNs中观察到iPSC克隆间在线粒体速度方面的表型差异(见图S3)。轴突交通系统的缺陷与许多神经退行性疾病有关。由于外周神经元具有独特的解剖结构，轴突长度可达1米，体细胞与远端亚细胞位点之间的遗传物质、代谢物、蛋白质和细胞器的交换对维持神经元稳态和生存至关重要。在各种运输货物中，线粒体的运输尤为重要，因为线粒体通过提供ATP、缓冲细胞内钙来支持若干细胞过程^2＋，以及调节细胞凋亡[13]。除了将线粒体运送到适当的亚细胞部位外，线粒体的运输对于通过动态融合和裂变机制回收其成分也至关重要[14]。轴突线粒体运输缺陷与阿尔茨海默病相关[20.，21，肌萎缩侧索硬化症[22和亨廷顿氏舞蹈症[23，24]。

线粒体通过与分子运动蛋白的相互作用进行双向运输，如驱动蛋白-1进行顺行运动和动力蛋白进行逆行运动，以及那些分别通过adaptor蛋白如线粒体Rho-Milton复合物和动力蛋白连接的蛋白[14]。分子马达的招募到微管轨道是由翻译后修饰调控的微管蛋白(16]，特别是乙酰化[17]。在本研究中，乙酰化水平-微管蛋白在S135F-MNs和P182L-MNs中均减少。通过增加乙酰化通过HDAC6抑制剂治疗-微管蛋白，线粒体运输在速度和移动线粒体百分比方面均得到改善。因此，线粒体轴突运输的缺陷与乙酰化降低有关-微管蛋白，可能是CMT2F和dHMN2B中轴突病的主要致病因素。

总之，IPSC可用于体外疾病建模的宝贵资源以及药物筛查。我们预计这一体外系统将是临床翻译研究和药物开发的有用模型。

5.结论

本研究证明了体外药物筛选模型的遗传性神经病变的突变所致HSPB1基因可以从患者特异性诱导多能干细胞中发展。在微流控培养系统中模拟轴突病变，S135F-MNs和P182L-MNs均表现出绝对速度和移动线粒体百分比的显著下降。这些轴突缺陷与乙酰化降低有关-微管蛋白，HDAC6抑制剂治疗后逆转。

相互竞争的利益

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Ji-Yon Kim负责IPSC实验，收集和解释数据，并编制纸张。So-Youn Woo正在解释数据并编辑稿件。Inhee Mook-Jung提供了微通道板并设计了实验。Heesun Choi，Jisoo Kim和Hyunjung Choi进行了微流体文化和脑脑管镜分析。尼娜哈，Jangbeen Kyung，Soo Kyung Koo设计了手稿的实验和准备。Young-Bin Hong和Sung-Chul Jung负责概念，实验设计，并编辑手稿。Byung-Ok Choi负责收集患者样本和数据的解释。

致谢

本研究由韩国保健技术研究开发项目(HI12C0135, HI14C3484, HI15C1560)和韩国科学、信息和通信技术与未来规划部国家研究基金资助项目(NRF-2014R1A2A2A01004240)资助。人干细胞系hFSiPS1由韩国国立干细胞银行(韩国保健研究院，批准号:0500006)提供。4861-307-210-13)。

补充材料

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