文摘
牙齿再生被认为是一种乐观的方式来取代目前的治疗牙齿脱落。重要的是要确定最适合牙齿再生的种子细胞。最近,人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)被认为是一种很有前途的候选人为组织再生。然而,它还没有报道hUCMSCs是否可以应用于牙齿再生。在这里,我们报告hUCMSCs可以感应到odontoblast-like细胞在体外和在活的有机体内。诱导hUCMSCs表示dentin-related蛋白质牙本质涎蛋白(DSP)和牙本质基质蛋白1 (DMP-1)及其基因表达水平在原生纸浆组织细胞类似。此外,DSP -和DMP-1-positive钙化hUCMSCs植入后被观察到了在活的有机体内。这些发现表明,hUCMSCs有牙原性的分化能力区分odontoblast-like细胞沉积dentin-like矩阵的特征在活的有机体内。这项研究清楚地显示hUCMSCs作为替代治疗牙齿再生的细胞来源。
1。介绍
牙齿脱落引起的龋齿、牙周炎和机械损伤是世界范围的一个主要公共卫生问题(1]。牙齿脱落患者口腔健康相关的生活质量的问题涉及饮食、咀嚼,微笑,和沟通(2]。目前治疗牙齿脱落依靠人工假牙,如固定桥,可拆卸的假牙,牙科植入物。然而,与天然牙相比,人工假牙非生物,有一些缺点包括异物感和有限的可用性,所有的不满足患者(3,4]。因此,生物的牙齿被认为是必要的(5]。
领域的干细胞和组织再生,生物牙冠和生成根已经在动物实验中6,7]。此外,牙齿再生被认为是一个可能的方法在牙科治疗的下一代8]。然而,实现目标的关键因素之一是说明最适合牙齿再生的种子细胞。胚胎干细胞(ESCs)和成人干细胞是干细胞的两种主要类型的牙齿再生(9]。尽管高增殖和分化能力,ESCs很少应用于临床实践,因为可能的肿瘤发生和伦理问题10]。因此,最近牙齿再生的种子细胞的研究主要集中在成体干细胞。成体干细胞,牙齿干细胞被认为是作为一个候选牙齿再生。其中包括牙髓干细胞,干细胞从乳牙脱落,牙周韧带干细胞,干细胞从顶端的乳头,和牙科卵泡祖细胞(11]。这些细胞已经被证明拥有多功能和牙原性的分化潜力,其中一些已经成功地应用于牙齿再生研究[12]。然而,使用牙齿干细胞有几个潜在的局限性。牙齿的主要挑战是有限的可用性干细胞,尤其是来自那些agomphious。此外,细胞在同种异体排斥和伦理问题治疗进一步阻碍牙齿干细胞的临床应用13,14]。另一方面,诱导nondental ectomesenchyme coculture牙发生的口腔上皮细胞提供了实验基础使用nondental成人干细胞进行牙齿再生(15]。李等人报道骨髓间充质干细胞(BMMSCs)产生tooth-like结构与口腔上皮细胞来源于coculture后大鼠胚胎(16),建议使用BMMSCs牙齿再生的可能性。然而,入侵和痛苦的过程收获BMMSCs困难的人包括那些需要牙科治疗。因此,一种更实际的和合适的种子细胞需要牙齿再生。
自从罗曼诺夫等人孤立的间充质干细胞(msc)人类脐带(17),这些干细胞获得了巨大的关注,和许多的优点hUCMSCs已经认可。首先,hUCMSCs是多功能高分化和增殖的功能18]。其次,没有限制hUCMSCs细胞来源,这是其他类型的干细胞的主要障碍。事实上,人类已经建立了脐带血银行在世界范围内,提供一个可靠的hUCMSCs[来源19,20.]。更重要的是,人类脐带分娩后就会被丢弃,并且没有侵入性和/或痛苦的程序为母亲和婴儿在集合,所以伦理问题越来越少21]。此外,由于胎盘屏障的保护,有一个降低病毒污染的风险相对于其他来源的成体干细胞(22]。
hUCMSCs可以分化成心肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、神经元和已经应用于研究骨软骨,肌肉骨骼,骨骼组织再生(23- - - - - -26]。然而,它还没有报道hUCMSCs是否可以应用于牙齿再生。
因此,在这项研究中,我们审查hUCMSCs是否有牙原性的分化潜能。我们使用Sprague-Dawley (SD)大鼠牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)和人类牙齿牙质矩阵(hTDM)诱导hUCMSCs成odontoblast-like细胞在体外并确定是否可以分化成hUCMSCs odontoblast-like细胞在活的有机体内。
2。材料和方法
本研究遵循赫尔辛基宣言的指南和国际动物研究指导原则和法律对实验动物的管理。研究伦理委员会建立的人类样本和动物实验伦理委员会的华西口腔医院,四川大学,研究提出了本项目研究协议,并发现它是道德上可以接受的。
2.1。hUCMSCs隔离、文化和身份证明
收集新鲜的人类脐带从足月剖腹产出生的成都妇女儿童中心医院并存储在磷酸缓冲盐(PBS)包含100 U /毫升青霉素和链霉素100 U /毫升、知情同意的家长和四川大学伦理委员会批准后进行。人类脐带在4小时内处理,随机分配给测试组和对照组。我们应用胶原酶和胰蛋白酶法(0.2%胶原酶和胰蛋白酶0.25%,都从σ,购买美国)和外植体培养孤立hUCMSCs从沃顿商学院的果冻27]。细胞被培养LG-DMEM / F12(美国表达载体)含10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫),100 U /毫升青霉素(美国Hyclone),和100 U /毫升链霉素(美国Hyclone),介质是改变每2 - 3天。2 - 3通道后,免疫组织化学进行按出版协议(28]。脂肪形成的差异化,通过三个(P3) hUCMSCs播种密度1×104细胞与PBS /在6-well盘子和洗两次当细胞达到80%汇合。这些细胞被维护在LG-DMEM / F12包含10%的边后卫,1μ美国M地塞米松(σ),5μ美国g胰岛素(σ),0.5毫米3-isobutyl-1-methylxanthine(美国σ),吲哚美辛和0.2毫米(σ,美国)。一半介质变化是每隔2 - 3天完成。2周的细胞诱导,沾油红O(美国σ),然后在显微镜下观察(CKX41、奥林巴斯、日本)。成骨分化,P3 hUCMSCs被播种密度1×104细胞/在6-well盘子和培养LG-DMEM / F12含有10%的边后卫与PBS 2天,洗两次。然后,成骨诱导的细胞保持介质组成的LG-DMEM / F12包含10%的边后卫,10毫米β美国甘油磷酸酯(σ),10−8mol / L地塞米松,50μ美国g / mL抗坏血酸(σ)。媒介改变了每2 - 3天3周,直到黑色不透明的区域在显微镜下观察和白色结节被肉眼观察到。茜素红染色应用于检测钙结节。
2.2。分化与TGC-CM hUCMSCs成Odontoblast-Like细胞在体外
牙齿的隔离细菌的SD大鼠和准备TGC-CM进行如前所述[28,29日]。简而言之,下颌第一磨牙细菌从0.5产后新生儿SD大鼠解剖,丁大约1毫米的立方体3,与0.2%胶原酶消化- min在37°C,和中和αmem(美国Hyclone)含有10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升。消化细胞被培养基培养αmem含有10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升。中了2 - 3天。替代条件培养基收集和离心机在1000 rpm 5分钟。上层清液通过0.22μm细菌滤器和混合LG-DMEM / F12(美国表达载体)含有10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升1:1比例获取TGC-CM。
通道2 (P2) hUCMSCs被播种密度1×104细胞/在6-well菜肴和培养24小时。洗后的细胞与PBS三次,TGC-CM添加诱导hUCMSCs odontoblast-like细胞。TGC-CM改变了每隔一天,细胞的形态变化在显微镜下拍摄。控制hUCMSCs培养LG-DMEM / F12包含10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升。
2.3。制备人类牙齿的牙本质矩阵(hTDM)
TDM获得健康单一根中提取的前磨牙的原因矫正患者的知情同意。和治疗牙齿手术处理之前的研究(30.]。短暂,捐赠的牙齿被削减一半的根源并存储在无菌去离子水5 - 6小时,然后被超声发生器,该国在80 Hz 5 - 6分钟改变无菌每小时去离子水。然后根治疗在17%、10%和5% EDTA每6分钟去除涂片层和无菌去离子水冲洗5分钟,然后沉浸在PBS含100 U /毫升青霉素和链霉素100 U /毫升72小时后用无菌去离子水冲洗5分钟并存储在LG-DMEM / F12培养基含有100 U /毫升青霉素和链霉素100 U /毫升。这后,苏木精和伊红(他)染色进行检查是否hTDM变得松散的纤维束和涂片层已经被移除。马森的三色的染色进行检测是否胶原纤维在hTDM仍然存在。MTT测定,P2 hUCMSCs被播种密度的5×103细胞/在装有hTDM 24-well菜肴,和细胞培养1 - 8天。麻省理工的解决方案(40μL)被添加到每个好,细胞在37°C在湿润的气氛中孵化有限公司为5%23.5 h。然后,媒介是吸气,200μL(二甲亚砜加入蓝色晶体溶解,形成的细胞。温和搅拌10分钟后,100年μL在每个被转移到一个解决方案的96孔板。光密度是决定一个多平台的读者在波长570纳米。没有hTDM控制hUCMSCs培养。
2.4。分化的hUCMSCs牙原性的hTDM提供的微环境在体外和体内
为在体外研究中,hUCMSCs被播种密度的5×104包含hTDM细胞/在6-well盘子,负控制细胞被播种在相同密度没有hTDM 6-well板块。的测试和控制组织培养培养基LG-DMEM / F12包含10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升。培养基是改变每一天和细胞后14天分析。为在活的有机体内研究中,hUCMSCs被播种密度的5×104细胞/在6-well板块包含hTDM和培养LG-DMEM / F12 24小时。然后二十hTDM-hUCMSC复合材料植入皮下的支持裸小鼠麻醉。8周后,植入物被提取并进行视觉观察。他染色,马森的三色的染色和免疫组织化学进行评估hUCMSCs牙原性的分化在活的有机体内。
2.5。免疫细胞化学
采用免疫分析,细胞与4%多聚甲醛固定15分钟。免疫细胞化学与执行streptavidin-biotin复杂方法根据制造商的协议。CD105抗体(1:100),CD29 (1: 100), CD44 (1: 100), CD34 (1: 100), CD45 (1: 100), CD31 (1: 100), DSP(1: 200),和DMP1(1: 100)被用于这项研究。抗体DSP和DMP1购自圣克鲁斯(美国)。其他抗体购自ZSGB-BIO(中国)。样品一个奥林巴斯CKX41显微镜下拍摄。
2.6。西方墨点法
hUCMSCs与PBS收集和清洗。然后,细胞细胞溶解与裂解缓冲30分钟。SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离的蛋白质10%,然后转移到纤维素膜。膜是孵化与温柔的风潮在37°C主要抗体β圣克鲁斯肌动蛋白(1:1000年,美国),DMP-1(1: 100年,圣克鲁斯,美国),和DSP(1: 200年,圣克鲁斯,美国)。然后用温柔的膜被孵化搅拌2小时37°C和辣根peroxidase-conjugated二级抗体稀释在5%脱脂奶粉1:7500。洗后Tris-Buffered盐水Tween-20 (Beyotime,中国)三次(每10分钟洗),膜是由一种ECL免疫印迹检测系统。免疫反应性的蛋白质被检测到ChemiDoc议员系统# 170 - 8280(美国Bio-Rad)。图像捕获和分析数量一个软件(美国Bio-Rad)。
2.7。定量聚合酶链反应
总RNA提取与RNAiso试剂(豆类、日本)。RNA是reversed-transcribed cDNA使用PrimeScript实时RT试剂盒完美(豆类、日本)。7300年ABI棱镜序列执行定量PCR检测系统(美国应用生物系统公司)。目标基因的相对表达水平进行评估使用方法(31日]。β肌动蛋白基因表达被用于每个样本的正常化。使用的引物对RT-qPCR被显示在表中1。
2.8。扫描电子显微镜(SEM)
hTDM被扫描电子显微镜(SEM)观察(检查F、范、荷兰)。短暂,与PBS hTDM被三次,然后用2.5%戊二醛是固定在0°C和临界点干燥脱水和干燥。最后,它由SEM观察和拍照。
2.9。统计分析
定量数据都表示为均值±SD。统计分析使用单向方差分析使用SPSS软件。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。隔离、文化和hUCMSCs的识别
hUCMSCs隔绝沃顿的果冻维护标准培养条件下,和主和通道细胞都表现出坚持塑料(图1(一))。免疫组织化学显示,贴壁细胞染色积极为间充质标记CD29、CD44、CD105,但不利于造血谱系标记CD34、CD45和内皮细胞CD31标记(图1 (b))。脂肪形成的诱导2周后,脂滴在细胞质中被发现,这表明这些细胞分化成脂肪细胞(图1 (c))。此外,成骨诱导期间,几乎没有细胞形态学的变化,但折射的物质细胞中观察到殖民地。钙积累诱导2周后被发现的小圆茜素red-positive结节细胞(图1 (d))。因此,hUCMSCs multipotency示威。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。hUCMSCs有牙原性的分化潜能
在TGC-CM hUCMSCs一直培养后14天,细胞生长良好,表现出一个长梭形的形状与丰富的细胞质,但形态在诱导过程中没有明显变化(图2(一个))。我们还发现TGC-CM-induced hUCMSCs表达了DSP和DMP-1检测到免疫细胞化学和免疫印迹。这些蛋白不表达uninduced hUCMSCs但被发现在牙髓组织,表明TGC-CM-induced hUCMSCs分化成odontoblast-like细胞(数字2 (b)和2 (c))。其次,定量PCR用于比较的基因表达DSSP和DMP-1在TGC-CM诱导hUCMSCs uninduced hUCMSCs。我们发现DSSP和DMP-1基因表达调节明显在TGC-CM-induced hUCMSCs和果肉组织,而没有发现表达uninduced hUCMSCs(数字2 (d)和2 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。hTDM hUCMSCs提供了一个牙原性的微环境
分段hTDM沾他和马森的三色的。他染色显示松散的纤维束表面的准备hTDM(图3(一个))。马森的三色的染色准备hTDM与渐进的深蓝色的深红色从远到近端髓腔牙质,从低到高,胶原纤维存在丰富(图3 (b))。SEM观察进一步证实,牙本质小管完全暴露和松散的小intertubular纤维提供了空间,hUCMSCs能与蛋白质和保持接触因素参与牙本质的形成,从而提供了一个为hUCMSCs牙原性的微环境(图3 (c))。接下来,免疫组织化学是用来确定DSP和DMP-1 hTDM表示。正如所料,hTDM呈阳性DSP和DMP-1,尤其是在牙本质小管,表明表达的牙质DSP和DMP-1(图3 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
MTT检测的生长曲线检测hTDM-induced hUCMSCs和正常培养hUCMSCs没有hTDM是相同的。均显示24 - 36小时的潜伏期,对数期5或6天,高原阶段(图7天后文化3 (e))。和扫描电镜显示hUCMSCs坚持hTDM表面感应2小时后,然后细胞24小时后开始蔓延,覆盖整个hTDM表面细胞后7天。这些观察表明,hTDM没有影响扩散hUCMSCs(图3 (f))。
免疫细胞化学和免疫印迹证明DSP和DMP-1存在hTDM-induced hUCMSCs(数字4(一)和4 (b))。我们还发现hTDM-induced hUCMSCs表达DSPP和DMP-1,而uninduced hUCMSCs没有表达这些基因。尽管低水平的DSPP表达的差异DSPP和DMP-1表达式之间hTDM-induced hUCMSCs和uninduced hUCMSCs统计学意义(数字4 (c)和4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。牙质再生通过皮下植入hTDM-hUCMSC复合材料
调查hUCMSCs是否适合牙齿再生的种子细胞,我们植入hTDM-hUCMSC复合材料在活的有机体内。hTDM-hUCMSC复合材料是收获20裸小鼠皮下植入后8周。我们没有发现在植入物周围的组织肿胀或发炎。此外,植入物保持原来的外观没有任何退化。他在hTDM染色显示新形成的钙化与多层细胞但没有炎症细胞(图5(一个))。马森的三色的染色也显示新形成的钙化(图5 (b))。重要的是,新形成的钙化和贴壁细胞阳性DSP和DMP-1通过免疫组织化学方法检测(图5 (c))。这些结果表明,hUCMSCs可以感应到odontoblast-like hTDM细胞在活的有机体内。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
hUCMSCs可以从不同地区分离的脐带。这些地区包括沃顿的果冻,脐静脉内皮下膜,和血管周的地区32]。沃顿商学院的果冻是一个原始的粘液组织围绕脐带动脉和静脉。间充质干细胞从沃顿商学院的果冻已被确认为一种原始干细胞群(33]。另外,干细胞从沃顿商学院的果冻有更好的多分化潜能比其他地区的脐带34,35]。因此,我们分离msc人类脐带沃顿的果冻和应用他们的牙齿再生。
利基的干细胞增殖和分化中起着重要的作用。特定的利基市场参与调节干细胞的不对称分裂36,37]。因此,诱导hUCMSCs成odontoblast-like细胞在体外,重要的是提供一个微环境,模拟的特定利基牙齿形态发生和促进牙原性的分化。先前的研究已经表明,TGC-CM提供了微环境富含牙齿形态发生的调节因素,增强牙齿的牙原性的分化以及nondental干细胞(38,39]。牙齿形态发生是由上皮和间质组织之间的顺序和相互交互。此外,信号从口腔上皮细胞在牙齿形态发生发挥决定性的作用,作用于ectomesenchyme细胞来启动和维护牙齿形态发生(40]。当开发牙胚细胞在培养基中培养,上皮和间质细胞之间的相互作用导致分泌的各种因素,包括Wnt,纤维母细胞生长因子、转化生长因子-β,骨形成蛋白(41,42]。这些因素与TGC-CM诱导hUCMSCs后,启动和维持牙原性的分化。
牙齿再生主要集中在三个方面:种子细胞、支架和生长因子(43]。牙齿再生的种子细胞应该是能够分化成tooth-specific细胞并形成牙质,釉质、牙骨质和牙槽骨在合适的脚手架44]。确定hUCMSCs适合牙齿再生,我们执行在体外和在活的有机体内实验使用cocultured hUCMSCs支架。有各种支架等牙齿再生胶原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸(45]。其中,TDM是牙齿再生的新开发的脚手架。准备hTDM保持牙本质小管的主要结构,这对牙本质再生是至关重要的。此外,hTDM表达了DSP和DMP-1已被证明在牙质生成扮演关键角色(46]。因此,hTDM不仅作为支架,但也提供了一个odontoblastic为干细胞微环境(30.,47]。因此,hTDM被认为是一个可用的牙齿再生的支架。我们的研究结果表明,由hTDM hUCMSCs可以分化成odontoblast-like细胞在体外的增殖率,hUCMSCs结合hTDM后并没有改变。此外,新形成的钙化观察hTDM-hUCMSC复合材料被植入皮下注射到裸鼠后8周。此外,新形成的钙化是积极的DSP和DMP-1通过免疫组织化学方法检测,显示新成立的钙化可能dentin-like矩阵。不出所料,hUCMSCs没有hTDM对照组不能分化成odontoblast-like细胞是否在体外或在活的有机体内。因此,我们得出结论,hUCMSC可以感应到odontoblast-like细胞分泌dentin-like矩阵在活的有机体内,这表明hUCMSCs是合适的和实用的细胞类型可应用于牙齿再生。
DSP(由基因编码DSPP)是与分化和矿化有关的成48]。此外,DMP-1(由基因编码DMP-1)控制成核的磷酸钙多晶型物和促进髓干细胞分化成成(49]。DSP和DMP-1通常被视为odontoblast-specific标记来识别感应odontoblast-like细胞(50,51]。在目前的研究中,hUCMSCs诱导TGC-CM或hTDM在体外或在活的有机体内被发现表达DSP和DMP-1 upregulation的DSPP和DMP-1基因表达水平在果肉组织类似。
虽然我们已经证实hUCMSCs有牙原性的分化潜能,有一些限制和挑战应该担心。尽管hUCMCSs丰富的来源,应该改进分化效率。以及如何维护细胞的稳定性和一致性也应该被考虑。牙齿再生研究,进一步研究需要区分牙原性的分化和成骨分化。和再生整个牙齿hUCMSCs包括牙周韧带、牙髓牙釉质、牙骨质和牙本质也应该学习在不久的将来。
5。结论
在这项研究中,我们表明,hUCMSCs有牙原性的分化潜能分化成odontoblast-like细胞在牙原性的TGC-CM和hTDM提供的微环境在体外。此外,当结合hTDM hUCMSCs沉积dentin-like矩阵在活的有机体内。总的来说,hUCMSCs可能是一个新的治疗牙齿再生的细胞来源。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Yuanwei陈和Yongchun Yu的贡献同样这项工作。
确认
金融支持提供的国家自然基金(81070802,81070802),基础研究基金中国中央大学(2011 scud4b14),和公共应用研究基金浙江省科学技术部门(没有。2012 c33010)。