文摘
我们探讨了假设一个改变微环境(肠道腺瘤息肉)可以修改骨骨髓来源干细胞的分化程序(综合),涉及结肠致癌作用。亚致死的辐照8-week-old女小鼠移植骨髓(BM)细胞获得男性的年龄(Apc-Tx-Apc)或野生型小鼠(WT) (WT-Tx-Apc)。在移植后4和7周,BM-derived colonocytes被colocalization染色体和Cdx2蛋白(具体colonocyte标记)。息肉数量,体积,和发育不良等级并不受辐照影响/移植程序,因为他们在未经治疗的女性中是相似的和Apc-Tx-Apc老鼠。在移植后4和7周,息肉数量和体积的进步显著减少在WT-Tx-Apc老鼠。此外,WT-Tx-Apc老鼠的数量与高档发育异常的息肉Apc-Tx-Apc老鼠相比显著降低。最后,在移植后4和7周,WT-Tx-Apc小鼠显示出进步显著增加Y + / Cdx2 +“正常”的粘膜细胞,然而,腺瘤组织,Y + / Cdx2 +细胞保持不变的。我们的研究结果表明,WT bmsc不参与息肉发展而抑制其生长。遗传型的改变的替换colonocytes Y + / Cdx2 +细胞可能有助于这一过程。
1。介绍
不同的概念支持居民可能会引起的癌症干细胞这一事实:他们能够增殖并可以积累DNA突变由于他们足够长的寿命(1];肿瘤细胞的人口构成,维持肿瘤生长的能力特别驻留在一个限制的细胞群2,3];的存在癌症干细胞已经证明在一些人类固体癌症包括结肠癌(4- - - - - -7]。
最近,一些研究集中在固体肿瘤的可能性可能出现从骨骨髓来源干细胞(bmsc)。事实上,霍顿等人bmsc参与胃癌所证明的那样,发现证实了Avital等人在其他人类器官的癌症8,9]。另一方面,Cogle et al。10]表明,bmsc和他们的后代可能在癌症组织合并,但他们的参与是零星的,可能是由于发育模仿。最后,我们发现,bmsc不参与肝癌发展使用肝癌的实验模型(11]。
基于猜测bmsc可直接参与结肠癌致癌作用正如前面展示在其他人类器官的癌症8,9),我们探讨了假设微环境的改变,由腺瘤息肉,可以促进骨骼的招聘骨髓来源干细胞(bmsc)修改他们分化程序。这样的状况会导致这些bmsc对carcinogenetic过程。
来验证这个假设,我们使用转基因小鼠模型与Apc突变()。这个模型模拟的条件在人类受到家族性腺瘤息肉病(FAP)和广泛用于结直肠癌(CRC)的研究(12,13]。
在我们的实验条件尚不致命的辐照8-week-old女性转基因小鼠,这些动物移植骨髓细胞(bmc)获得男性年龄相仿,野生型小鼠(WT),跟着bmc的命运通过y染色体的检测。最后,描述BM-derived细胞在结肠组织我们使用Cdx2蛋白,这被认为是肠细胞谱系的标志(14]。
当前研究的新颖性是基于使用BM-derived细胞没有遗传易感性的癌症(从野生型动物)来验证假设健康bmsc参与结肠癌致癌作用的本地组织微环境改变。
2。材料和方法
2.1。动物
在这项研究中女性和男性与Apc突变小鼠(),以及雄性野生型(WT)同源的动物(C57BL / 6 j),是来自查尔斯河(Calco、意大利)。抵达后,所有老鼠都保存在温度、空气和光控(光从早上7点到晚上7点)条件和获得水随意和标准鼠标饮食(WT)或高脂肪低纤维饮食()[12]。所有的动物收到人道关怀根据指南中概述的标准的护理和使用授权的实验室动物和研究当地伦理委员会。
2.2。骨髓移植和研究设计
骨髓(BM)移植手术使用修改之前所描述的技术(11]。简单地说,女性老鼠亚致死的辐射(800 rad)和骨髓细胞移植(bmc)获得雄性老鼠WT (WT-Tx-Apc)或男性老鼠在4 - 6小时内(Apc-Tx-Apc)。准备的bmc,男性WT或老鼠牺牲颈椎错位和后肢,收集BM,刷新了最低基本培养基(MEM) + 5%胎牛血清(FCS)胫骨和股骨骨髓腔的使用27 G针。然后,细胞被离心机在1000 g为4分钟,在4°C,在适当的介质体积resuspended为了获得细胞悬液的浓度1×106/ 100μl .最后,100μL细胞悬浮液在辐照雌性老鼠通过尾静脉注射。
这个过程一直是以前用于演示BM-derived肝脏和其他器官移植的细胞研究中关于组织调整或致癌作用10,11,15- - - - - -17]。
我们的研究设计包括五组:A组由6女转基因小鼠没有收到任何治疗和牺牲在12周的年龄;B组由6女转基因小鼠,8周时,接受了骨髓(BM)移植使用捐赠者的同龄男性老鼠和牺牲在12周的年龄;C组由10个女性转基因小鼠,8周时,接受了BM移植使用捐赠者的同龄男性WT老鼠和牺牲在12周的年龄;D组由6女转基因小鼠,8周时,接受了BM移植使用捐赠者的同龄男性老鼠和牺牲在15周的年龄;E组由10个女性转基因老鼠,8周时,接受了BM移植使用捐赠者的同龄男性WT老鼠和牺牲在15周的年龄。
2.3。组织学研究
评估整个小肠和结肠切除息肉大小和数量/体积如前所述[12]。短暂、小肠和结肠沿着肠系膜插入被削减,放在一个纸条在0 - 4°C,并分析了槽3 x放大的立体显微镜。小肠和结肠标本固定在10%中性缓冲福尔马林24小时和嵌入在石蜡“蛋糕”的方式,使整个肠道在显微镜下检查4μ米厚片。肠息肉数量,体积,发育不良等级评估在haematoxylin-eosin(圆))的准备工作。彩色部分失明的方式进行。如前所述(12),三层系统(轻微、中等和严重)是用于分级发育不良。短暂、轻微的发育异常被认为是通过最少的建筑变形、增生的腺体的存在没有mucin-depleted细胞和杯状细胞的最小减少,轻微的核质比例的增加,核极性保护,微不足道的分层的原子核,察觉有丝分裂的人物;中度异生被认为是拥挤的存在与分层核增生的腺体,丰富mucin-depleted细胞和一致的杯状细胞减少,核质比例适度增加,核质比和轻微的改变;严重发育不良被视为连续的建筑腺安排,杯状细胞减少,核质比例明显增加证据的多形性核,核极性和损失的证据multistratification核,和频繁的和非典型细胞有丝分裂18]。
额外的连续幻灯片被用来评估的存在结合Cdx2的染色体原位杂交研究和免疫荧光。骨髓研究脊柱标本进行了脱钙作用在Mielodec解决方案(EDTA,用盐酸混合)(Bioptica、米兰、意大利)6小时之前发生脱水和石蜡包含(19]。大英博物馆的染色体阳性细胞百分比移植小鼠类似于以前观察到(11]。
2.4。荧光原位杂交(FISH)染色体
鱼对染色体进行使用修改之前所描述的技术(11]。探针从ID获得实验室生物技术(美国帕洛阿尔托,CA)是用于检测y染色体。对于我们的研究,4μ米厚的幻灯片安装在3-aminopropyl-triethoxysilane——(摘要)治疗幻灯片。他们首先deparaffinized,水化,洗在PBS。然后,与蛋白酶K消化后(罗氏诊断,曼海姆,德国),500年μg / mL, Tris-HCl 100毫米/ EDTA 50 mM, pH值8.0,25分钟37°C,幻灯片和PBS洗甲酰胺和接受变性70% 2 x盐水柠檬酸钠(SSC) 2分钟72°C。后,肝脏在冰冷的转移乙醇70°,85°、100°2分钟,干空气喷射。y染色体探针是治疗preannealing在75°C(10分钟和1小时37°C),被添加到前预热部分。标本都淹没了,与橡胶水泥密封,在68°C加热10分钟,然后孵化一夜之间在37°C调湿室。幻灯片然后洗根据协议提供的ID实验室和温柔地干,然后FITC-Avidin(向量实验室荧光亲和素包,伯林盖姆、钙、美国)添加在PBS稀释后(1:100)和孵化在室温下30分钟。最后所有幻灯片都洗在PBS和TOPRO-3添加(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)核复染色。
2.5。免疫荧光
连续患者结肠组织学部分受到抗原决定基检索程序使用柠檬酸与微波解决方案,在pH值为6.0(15分钟750瓦,PBS-TWEEN 0.5% 25分钟)。然后,部分被转移在冰冷的乙醇70°,85°、100°2分钟,和干。y染色体探针被视为描述然后孵化前一夜之间在37°C调湿室。洗后2 x SSC含有0.1% Igepal和第二个洗4 x SSC Tween-20含0.05%,2% BSA的解决方案4 x SSC 30′在室温下被用作勃洛克的解决方案。三个洗后,部分被轻轻地干然后FITC-Avidin(向量实验室荧光亲和素包,伯林盖姆、钙、美国)补充道,在PBS稀释后(1:100),在室温下和孵化为30分钟。随后,部分在PBS洗了三遍。最后,一夜之间,部分被孵化,在4°C,与主要抗体兔子,Cdx2(细胞信号技术)使用1:20稀释。
anti-rabbit Alexa 555(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)是用于immunodetection Cdx2的稀释在1:100年,在室温下孵化30分钟。所有部分都是复染色与TOPRO-3(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),稀释1:5000年,涵盖下滑。
Colocalization Cdx2的染色体被共焦显微镜探索。我们使用鱼标签染色体,正如前面说明,其次是Cdx2 immunodetection在同一幻灯片。免疫荧光检测Cdx2我们使用了向量的荧光亲和素包(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)和TOPRO-3(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)作为核复染色。
2.6。显微镜和图像捕获
光学显微镜,徕卡显微镜(位于德国)DM RB,配备了一个奥林巴斯sp - 350数码相机。图像收购进行使用OLYCAM / IAS软件(ATZ、巴里、意大利)。共焦显微镜徕卡(位于德国)TCS-SP2显微镜,装备了一个激光Ar / Ar氪λ488(绿色,y染色体),Gre /霓虹灯λ543(红、Cdx2),他/霓虹灯λ633(蓝色,TOPRO)。图像采集和分析了交互式LCS软件(徕卡,位于德国)。
2.7。细胞计数
y染色体阳性细胞的识别是基于绿色斑点的出现在细胞核的周长。Cdx2阳性细胞的识别是基于通过免疫组织化学方法红点的存在。标记细胞的数量在总细胞数,也就是说,标记细胞的百分比(标签指数=李),计算了至少10个随机选择的字段。一个单独的计算进行了正常和tumoral组织。在同龄雄性小鼠染色体检测的效率%。
2.8。统计分析
连续变量表示为意味着±标准差,而使用测试或方差分析。单因素方差分析时拒绝的假设意味着平等在团体中,图基测试申请的比较不同组的方法。用于比较的标准是显著性水平。二分变量表示为百分数并与卡方测试修正确切概率法。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。宏观研究
如图1在12周的年龄,未经治疗的女性老鼠(A组)显示数量和体积小息肉所观察到的类似的女性小鼠移植8周的年龄与BM细胞获得的同龄男性老鼠(B组,控制)(与和毫米3与毫米3、职责)。另一方面,12个月大的女性小鼠移植8周的年龄与BM细胞从老鼠的同龄男性WT (C组)获得了显著减少的数量(与)和体积(毫米3与毫米3)的息肉与控制(B组)()。
女性15-week-old小鼠移植8周的年龄与BM细胞获得的同龄男性老鼠(D组)显示适度的增加()和体积(毫米3)的息肉,B组小鼠相比,表明疾病的进展。另一方面,15-week-old女性小鼠移植8周的年龄与BM细胞获得男性WT (E组)小鼠显示出息肉数量仍然类似于观察C组,但与D组相比显著降低(与,),而息肉体积进一步显示C组相比显著下降(与毫米3,)(图1)。
3.2。评估发育不良
低度、中度、高度发育不良的腺瘤息肉是所有动物(图中观察到2)。值得注意的是息肉与优质发育不良的数量显著降低在E组与D组小鼠()(表1)。
(一)
(b)
(c)
3.3。鱼和免疫组织化学研究
为了解释宏观结果关于息肉大小和数量的变化,我们评估的存在BM-derived细胞在“正常”和腺瘤组织使用染色体(图3(a))。此外,使用Cdx2作为上皮细胞分化的标志,具体为colonocytes(图3(b)),我们描述染色体阳性细胞的表型在结肠粘膜。图3(c)显示了colocalization细胞核的染色体和Cdx2 nonadenomatous从c组小鼠结肠粘膜。染色体阳性细胞在肠道粘膜范围从10%到40%的人口整个上皮细胞在染色体/ Cdx2阳性细胞%的y染色体阳性细胞(数据没有显示)。
在图4染色体的百分比/ Cdx2阳性细胞在移植的“正常”和腺瘤组织雌性老鼠。我们的研究结果表明,在移植后4周,在B组,Y / Cdx2阳性细胞%和4.1%±0.6“正常”的细胞和腺瘤组织,分别。在C组,Y / Cdx2阳性细胞的比例有一个相反的分布。特别是,他们有统计上显著的增加“正常”组织和减少腺瘤组织(0.3±6.8%±1.2和1.8%,职责)。更有趣的是Y / Cdx2阳性细胞的分布三周后(即,7weeks after transplantation) in group E. In fact, in these mice the percentage of Y/Cdx2 positive cells significantly grew up to 10.3% ± 2.1 and 3.9% ± 0.5 in “normal” and adenomatous tissue, respectively. Finally, also the distribution of Y/Cdx2 positive cells was different in the two groups. In fact, while in group B positive cells were prevalently localized in the lower/bottom part of the intestinal glands, in groups C and E, they were found essentially in the surface epithelium and in the middle/upper part of the intestinal glands (data not shown).
4所示。讨论
结直肠癌(CRC)主要包括息肉形成,一个条件视为癌前(20.]。向公开的CRC似乎进展的风险相关的数量和大小的息肉(21),两个条件极大地表达小鼠模型。
实验设置了微环境的改变的假设,由腺瘤息肉,可以修改bmsc的分化程序使他们参与癌症的发展。为此我们跟着命运的BM WT雄性小鼠,细胞移植雌性小鼠,通过跟踪染色体和使用Cdx2作为标记肠细胞谱系14]。
在一项研究由Cogle et al。10在完整的雌性老鼠收到BM细胞突变的年龄雄性老鼠,显著降低结肠染色体阳性细胞被发现的,认为没有bmc参与结肠致癌作用。我们的研究提出了两个新的方面;首先我们评估的影响WT bmc息肉增长不仅一次,在不同时间从移植,为了赶上进化方面的过程。其次,在我们的实验条件中,染色体的百分比/ Cdx2阳性细胞在结肠粘膜被不同的检测评估技术,这就可以解释我们的不同的结果。事实上,我们没有使用结肠细胞标志物细胞角蛋白,它在细胞膜,因此可以提供本地化的问题colocalization染色体,但Cdx2,胞内标记主要定位在细胞核,排除错误的积极性的问题(14]。在另一个小鼠模型,窝藏遗传标记元素,德容et al。22)发现了一个低比例的肠上皮BM的入侵细胞。然而,尽管我们用作标记染色体,这是一个既定的表达基因,他们的方法是基于遗传操作可以影响表达式的器官/组织考虑。
排除辐照的影响/移植程序息肉发展我们评估的数量和体积息肉的完好无损老鼠(A组)和年龄老鼠接受男性的细胞突变(B组)证明在这两组参数都是相似的。在B组,Y / Cdx2阳性细胞计数在“正常”的约2%和4%,腺瘤组织,分别表明有一定的招聘BM结肠细胞,更积极地增殖腺瘤组织更加突出。
WT-BM细胞移植的一个引人注目的决定显著减少(约50%)的息肉数量和体积在C组相比,b组在E组小鼠这种效应更加明显,也就是说,7周后移植。事实上,抑制作用对息肉发展施加WT-BM细胞决定进一步减少息肉数量(55%)和体积在E组(92%)相比,年龄匹配的老鼠接受bm移植(D组)。最后,老鼠的数量与息肉表现出严重的发育异常的病变是减少组C和E,后者达到统计学意义。
解释这个数字减少息肉体积,我们评估了“正常”的染色体阳性细胞数量和腺瘤组织。在C组小鼠的“正常”的组织,我们发现增加了5倍的Y / Cdx2阳性细胞与B组相比,达到超过10%的结肠上皮细胞的人口,而在腺瘤组织Y / Cdx2阳性细胞的数量保持不变。在E组中,我们观察到进一步显著增加Y / Cdx2阳性细胞在“正常”和腺瘤组织。这一现象表明,有一种倾向,将替代细胞与健康细胞,减少新的息肉形成的概率。然而,我们不能排除,抑制息肉发展影响也由于修改的居民由不同的BM细胞干细胞利基血统(23]。事实上,Y / Cdx2阳性细胞仅代表%总数的染色体阳性细胞在结肠组织中找到。
染色体上的数据/ Cdx2在肠道粘膜“正常”colocalization表明WT-BM细胞肠给招聘的起源比所产生的一个更大的人口bm细胞所展示的数量组C和B,分别的事实WT细胞被发现不仅在腺体,而且在表面上皮细胞染色体的分布+ / Cdx2 + /腺体细胞仅限于的底部。
结果的基础上对息肉大小和数量,并考虑到“正常”和腺瘤组织的Y / Cdx2 WT-BM移植术后阳性细胞逐渐增多,我们可以声明WT-BM细胞不参与肿瘤进展,但恰恰相反,减少息肉形成,特别是息肉增长近乎“治疗”效应。
总之,我们的研究结果排除微环境改变的假设所代表的腺瘤性息肉可以修改BM-derived干细胞的分化程序。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。