文摘
成人间充质干细胞(MSC)可以从骨髓容易收获的愿望。MSC参与组织再生和修复,特别是在伤口愈合。由于其高的自我更新能力和优秀的分化潜能在体外,MSC是适合再生医学。MSC与环境之间复杂的相互作用,及其影响的分子和功能水平广泛研究,但没有完全理解。MSC分泌,例如,肝细胞生长因子(HGF)的浓度是提高受伤的区域和所示为MSC作为化学引诱物。我们生产HGF-loaded基于胶原蛋白和纤维蛋白凝胶的生物材料开发招聘系统为内生MSC改善伤口愈合。在这里,我们报告HGF纳入胶原蛋白或纤维蛋白凝胶导致增强和MSC移植在体外。HGF-loaded生物材料可能是潜在的作为在活的有机体内伤口敷料从组织招募内生MSC利基市场向受伤的区域。这种新方法可能有助于减少昂贵的多步过程的细胞隔离,在体外文化,移植通常用于组织工程。
1。介绍
伤口愈合是参与组织再生和修复的过程。其复杂的过程依赖于适当的不同来源的细胞之间的相互作用和细胞外基质(ECM)成分。旁边,免疫系统的细胞和不同居民细胞,间充质干细胞(MSC)扮演一个关键的角色在伤口愈合1]。
人类MSC可隔绝各种组织(例如,骨髓或脂肪组织)和他们的干细胞特征详细描述了自1968年Friedenstein的开创性工作,同事(2,3]。此外,MSC具有免疫调节和营养特性,使其再生医学(有前途的细胞来源4]。内源性MSC移植到受损区域,强烈参与伤口愈合反应通过旁分泌的沟通5]。旁分泌发生通信通过一致行动的生物活性因子,如血管内皮生长因子、表皮生长因子、角质细胞生长因子和肝细胞生长因子(HGF) [6,7]。HGF突出,因为它proangiogenic和趋化现象的属性。在MSC c-met其受体表达,使细胞迁移到更高的HGF梯度。这种梯度另外建立了巨噬细胞和凋亡细胞(8,9]。此外,MSC参与伤口反应通过ECM分子的分泌,从而影响组织重构和伤口收缩(10]。
慢性伤口的愈合过程是无序和延迟要求医疗干预改善愈合状况(11]。生物材料可以作为伤口敷料提供结构的严重的组织的损失。自然和人工生物材料可以以不同的方式影响细胞行为,例如,生存、增殖和分化。在广泛的潜在的生物材料,纤维蛋白和胶原蛋白对伤口愈合(合适的候选人12,13]。纤维蛋白,本机组件高度参与凝血,伤口愈合是一个关键因素所示的第一个动物研究[14]。多年来,纤维蛋白作为细胞的工具和药物输送15- - - - - -17)以及线的扩张血液造血干细胞(18]。第一次使用胶原蛋白作为一种天然矩阵提高伤口愈合猪研究[19]。近年来,胶原蛋白可以诱导趋化性和趋触性的兔子和人类MSC (20.]。它还展览增加价值的影响交互和MSC分化[21]。胶原蛋白是一个潜在的nonimmunogenic可降解支架MSC在皮肤组织工程的公司10]。
在目前的研究中,我们分析了HGF的影响纳入纤维蛋白和胶原蛋白凝胶在MSC使用标准化的招聘和迁移在体外化验。我们进行了一次试验,一个简单的,时间,和有成本效益的方法来评估细胞迁移(22]。此外,我们使用一个修改Boyden室试验来评估对胶质瘤细胞的趋化现象的活动迁移(23]。
总之,MSC参与的概念在伤口愈合和组织修复的过程中被广泛接受。纤维蛋白、胶原蛋白和HGF直接MSC移植是有用的组件在体外和在活的有机体内。我们的研究揭示了运动性MSC在两个可降解生物材料结合HGF。我们描述一个健壮的和导演首次MSC移植对HGF释放纤维蛋白和胶原蛋白在体外。这些结果为发展铺平道路的招聘系统内生MSC改善烧伤的伤口愈合或慢性疾病在活的有机体内。
2。材料和方法
2.1。间充质干细胞分离和细胞培养
程序是经当地伦理委员会批准。人类的捐助者给予知情同意。人类间充质干细胞(MSC)隔绝股负责人根据Haynesworth等人的协议和Pittenger et al。3,24]。短暂,股正面的病人接受全髋关节endoprosthesis与干细胞培养基冲洗几次,DMEM含60%,40% mcdb - 201 1 x + BSA-linoleic酸,1 nM地塞米松,100μM抗坏血酸,10 ng / mL EGF, 40.000 U青霉素,链霉素40毫克,2% FCS(锅生物技术,Aidenbach,德国)。细胞悬液被转移到50毫升管和离心500克10分钟。细胞颗粒在新鲜培养基和播种resuspended T75组织培养瓶血压得到较好的控制。24小时后,不依从细胞被介质变化。在80 - 90%融合,干细胞和干细胞使胰蛋白酶化胰蛋白酶(表达载体,达姆施塔特,德国)和受移植者的密度5.000细胞/厘米2最优扩散。每3 - 4天介质发生变化。所有细胞的特点是流式细胞术和multipotency使用标准协议作为细胞治疗[国际社会所需要的25,26和如前所述8]。细胞被孵化20% O2和5%的公司2调湿大气在37°C。2和5之间的细胞通道用于实验。
2.2。纤维蛋白凝胶制备
纤维蛋白凝胶是由聚合像之前描述的那样使用凝血酶和纤维蛋白原(27]。纤维蛋白原的解决方案是由溶解纤维蛋白原粉体在8毫升的水(160毫克aqua广告iniectabilia)8毫升GBSH5缓冲不完整。混合物转移到透析袋和平衡与GBSH5缓冲不完整在4°C的夜晚。第二天,纤维蛋白原的解决方案是放在一个橡树岭离心管,离心1200 g 30分钟。吸气,得到上清液的无菌过滤,冻结在−80°C。直接在细胞播种之前,CaCl2缓冲(50毫米ddH20、无菌过滤)和GBSH5缓冲完成添加到纤维蛋白原。聚合、10μL凝血酶(1000 U /毫升)和180年μL纤维蛋白原方案24-well板块涨跌互现。此外,75 ng / mL HGF聚合前添加。板是动摇精心提高聚合和孵化37°C为20分钟。聚合后,中了。所有的结果都是基于五个独立实验()。
2.3。胶原蛋白凝胶制备
胶原蛋白凝胶生成如前所述[28,29日]。短暂,八卷的酸性胶原蛋白G(3毫克/毫升胶原蛋白I /盐酸三世在12毫米)被混入了一个卷10倍DMEM(来自Biochrom,柏林,德国),后与2 M氢氧化钠中和。一个卷的媒介±75 ng / mL HGF (PromoCell、海德堡、德国)添加到凝胶混合物。的凝胶放置在车厢底部24-well板和孵化37°C 2 h聚合,和中添加。所有的结果都是基于五个独立实验()。
2.4。HGF ELISA
HGF成立之前的聚合凝胶在96孔板。上层清液收集后1、2、4、6、8、24、48和168小时的文化。HGF ELISA (PromoCell GmbH,海德堡)是根据制造商的指示。简单、标准和样本孵化在4°C 96孔板。第二天,生物素抗体被添加到每个在室温下和孵化1 h。后来,链霉亲和素的解决方案是添加和板在室温下孵化了45分钟。接下来,三甲一步衬底试剂添加到每个好,在室温下孵化30分钟。停止的解决方案是添加板块阅读之前450海里。
2.5。划痕试验
细胞生长,直到融合在隔间的culture-insert (Martinsried ibidi GmbH,德国)在24-well格式菜(图1)。插入被用来创建统一的维度在整个实验。插入被仔细和介质±75 ng / mL HGF被添加到每个。关闭的在体外伤口是用照相记录(0)8、16、24 h后删除插入。照片是处理Adobe Photoshop 7.0和3.2.4条分析了八度。
2.6。Boyden室试验
分析细胞迁移,MSC被播种密度的105细胞/毫升transwell系统的前室(美国康宁康宁合演)(修改Boyden室)24-well盘子。车厢顶部是由聚碳酸酯膜分离舱底部与8μm毛孔。排除一个仅仅chemokinetic HGF对MSC的迁移的影响,我们同时添加相同的HGF浓度顶部和底部的车厢里,也只有舱顶部。胶原蛋白和纤维蛋白±75 ng / mL HGF在舱底部沉积如上所述。这个试验是称为“迁移试验。”
模仿的在活的有机体内情况和检查可能推迟发布HGF的生物材料,胶原蛋白和纤维蛋白都涂上薄薄的一层基底膜基质(美国富兰克林湖BD生物科学)。这个试验是称为“入侵检测。“任何趋化现象的分析/ chemokinetic基底膜基质本身对细胞的影响,较低的底部的隔间transwell(没有生物材料)是覆盖着一层薄薄的基底膜基质。
在这两个化验,基底迁移(HGF、生物材料)是用于规范值;媒体+ HGF在低舱担任内部控制。细胞被允许迁移前24小时分析和量化。切除transwell后,顶部被抹去了细胞层用一块不起毛的布(Wepa、件、德国);膜固定,沾Hemacolor(默克公司,达姆施塔特,德国)和安装在客观幻灯片带盖滑和Vitro-Clud (Langenbrinck, Emmendingen,德国)。膜是细胞在底部一侧的量化在5个不同的大功率领域/膜在200倍放大。每个分析五种不同捐赠者的一式三份。
2.7。统计分析
数据提出了平均值±标准差(SD)。单向方差分析和图基的后续测试被用于统计分析;意义被定义为,,。生成相应的图形化表示4.0 GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。
3所示。结果与讨论
3.1。HGF ELISA
HGF的释放动力学分析了纤维蛋白和胶原蛋白凝胶与人类HGF酶联免疫试剂盒。在第一次8小时,HGF很快被释放从胶原蛋白和纤维蛋白(17%和20%,resp)。经过这一次,HGF在更渐进的方式被释放。总的来说,这两种生物材料显示出类似的释放动力学。然而,更高浓度的HGF刷新从纤维蛋白相比,胶原蛋白。168小时后,HGF的累积释放胶原蛋白和纤维蛋白是28%和32%,分别为(图2)。继续逐步释放的过程预计,胶质瘤,因为超过60%的HGF在生物材料仍然存在。最初强烈释放后,预计HGF的支持缓慢释放,这是合理的在活的有机体内应用程序。因此,我们的系统显示了有前景的结果体外。在我们正在进行在活的有机体内研究(鼠标),我们特别关注炎症阶段,一些生长因子、血小板源生长因子和血管内皮生长因子等,由巨噬细胞释放迅速吸引炎症细胞(30.]。我们HGF动力学相关的生理条件所描述的克拉克和亨森(31日)以及科恩和他的同事们(32]。
许和他的同事们研究了控释HGF的牛支架声襞重建。他们来到类似释放动力学HGF的非细胞支架。他们显示的总释放32.6% HGF 7天后,这是按照我们的结果(33]。凝胶,HGF释放都可以接受,我们会进一步分析细胞的迁移和降解性能在活的有机体内模型。
胶原基质的研究潜力释放的载体外源性生长因子是由Kanematsu et al。34]。他们分析了在活的有机体内释放一些生长因子(bFGF, HGF, PDGF-BB、VEGF和HB-EGF)从胶原海绵在28天。经过7天的植入,70% HGF被释放从矩阵和很强的相关性之间的发布概要文件和退化的矩阵被发现。
3.2。划痕试验
基于划痕试验,诺伊斯et al。8),细胞迁移(图进行分析3)。诺伊斯和他的同事们决定最佳的HGF浓度对细胞迁移的范围50到100 ng / mL。我们选择75 ng / mL化验。MSC在文化培养插入,直到融合;插入删除(= 0小时)和干细胞培养基±75 ng / mL HGF是补充道。没有区别在细胞迁移的存在与否观察HGF 8和16小时后(数据没有显示)。然而,24小时后,MSC与HGF显示更多的迁移细胞培养(约。胞外覆盖面积的50%)没有HGF(约比同行。胞外覆盖面积的25%;图4)。
大量的在体外研究报道HGF的化学引诱物不同的细胞类型,从而突显出我们的发现。研究显示一个增强的,如果没有明显增加,细胞迁移的HGF与同行相比培养HGF浓度较低或没有HGF [35- - - - - -38]。有趣的是,cotreatment HGF与转化生长因子-β1导致优越仅比胶质瘤细胞迁移,表明细胞因子的结合有利于伤口愈合,也(39]。最近,一个新的定量方法分析介绍了伤口愈合的长期动力学。腺癌细胞系协调和集体的方式迁移,并表示更高的速度在胶质瘤细胞,因此显示加速伤口关闭(40]。总之,HGF有很强的趋药性的影响不同细胞类型的细胞迁移。
3.3。Boyden室试验
进一步评估迁徙HGF对MSC的影响,我们建立第一个Boyden室实验结果被诺伊斯和同事(8]。检查任何chemokinetic HGF的影响,进行了分析与HGF浓度相同,但是不同的本地化(没有HGF =基底迁移,底舱,顶部和底部隔间里,人物5;和室,图6)。HGF的趋化作用明显强于chemokinetic效果。MSC移植明显增强(*;图5)相比,基底迁移和等量的HGF同时出现在两个隔间。这种效应也已被郑et al。41),证实了我们的假设的趋化HGF对MSC的迁移行为的影响。
根据化验结果,我们进一步研究了HGF的影响纳入胶原蛋白和纤维蛋白使用修改后的Boyden室试验。对化验、迁移(生物)和入侵(生物材料加上一层薄薄的基底膜基质),胶原蛋白和纤维蛋白都是免费或装载75 ng / mL HGF(图7)。
迁移分析
HGF仅在介质(没有生物材料)相比,细胞迁移有显著提高基底迁移(没有HGF,没有生物材料)为不同的细胞类型(如前所述8,36,42]。此外,HGF纳入胶原蛋白和纤维蛋白表现出显著高于基底细胞迁移迁移(约。56%和31%,分别地;数据8(一个)和8 (c))。因为我们的项目目标释放HGF的帮助下慢性疾病或烧伤伤口敷料从天然载体材料,这些结果对于未来很有用在活的有机体内研究。
(一)
(b)
(c)
(d)
haptotactic影响纤维蛋白的血管平滑肌细胞的迁移是描述早期(43]。另一项研究对纤维蛋白的摄入量有关影响牛内皮细胞显示的积极影响纤维蛋白在细胞的迁徙活动44]。在我们的研究中,我们没有观察到这种效应的纤维蛋白没有HGF在MSC,但只有结合HGF(图8 (c))。我们认为MSC可能不是一样容易受到纤维蛋白及其组件血管和/或内皮细胞自这两种类型的细胞被证明炎症的调控中起着关键的作用在伤口愈合(通过他们的交互与纤维蛋白原代谢物和其他迁移细胞)(45]。研究结合HGF成纤维蛋白是由张先生和他的同事们,用纤维蛋白作为biomatrix针剂。他们声称的功效聚乙二醇再生纤维蛋白biomatrix关于干细胞移植的心肌在一个小鼠模型(46]。作者认为是生物材料的HGF加载平台技术潜在的应用在其他生物材料和生长因子组合。沿着这些线路,纤维蛋白可以作为一个潜在的载体HGF的伤口敷料。
早在1981年,人类胶原蛋白的不同浓度(I型,第三,V)被发现对各种类型的肿瘤细胞有趋化现象的影响(47]。后来,化疗和haptotactic I型胶原蛋白的影响被描述为兔子和人类MSC (20.]。这些描述是依照我们的发现。修改分析(与I型胶原蛋白膜涂)评估入侵子宫内膜腺癌细胞系刺激的HGF在剂量依赖性的方式48突显了我们的结果。虽然修改不同的I型胶原蛋白被发现增强细胞迁移。几年前,Bhargava和同事从胶原凝胶显示HGF的扩散,提高修复半月板的损伤在一只狗的研究中。特别是结合血小板源生长因子,HGF释放胶原蛋白产生了明显高于对细胞迁移的影响模拟缺陷比胶原蛋白凝胶(49]。
在活的有机体内模型需要执行评估什么扩展HGF的直接结合到纤维蛋白和胶原蛋白影响MSC移植。Kanematsu等人的一项研究显示HGF的发布概要文件,其他生长因子,纳入一个胶原基质植入小鼠皮下组织(34]。这组描述胶原蛋白I型作为生长因子对于一个合适的载体在活的有机体内发布在一个小鼠模型。他们的结果,完全基于在活的有机体内实验表明我们的功能在体外在我们即将到来的老鼠研究分析系统。
总体而言,上述研究是根据我们的发现,这HGF独自,结合胶原蛋白和纤维蛋白作为启动子高MSC能动性和迁移。
入侵检测
模仿的在活的有机体内异物反应情况(HGF-loaded)生物材料植入后,胶原蛋白和纤维蛋白被涂上了一层薄薄的基底膜基质。迁移化验,胶质瘤干细胞中单独显示显著高于基底细胞迁移迁移。胶原蛋白与HGF涂层与基底膜基质显示明显高于细胞迁移(约。22%)相比没有HGF但人工基底膜胶原蛋白。纤维蛋白(大约发现了相同的结果。25%;数据8 (b)和8 (d))。在这里,基底膜基质±HGF担任控制排除任何可能的趋化现象的基底膜基质对MSC的影响(图9)。我们故意选择外套上的生物材料井底(不是膜),以检查可能推迟发布的胶质瘤生物材料在这个实验中,这是一个小说改编的Boyden室试验,因为所有先前的研究(只在癌症研究)描述的涂层膜。
排除任何可能的趋化因子或chemokinetic MSC的基底膜基质对迁移的影响,修改后的Boyden室试验进行了没有胶原蛋白和纤维蛋白凝胶,但只有人工基底膜板的底部。没有区别的迁移细胞当井相比,涂上一层薄薄的基底膜基质基底迁移。然而,当HGF添加到舱底部涂层与基底膜基质,细胞迁移是显著增强(* * *,图9)。因此,我们可以排除任何人工基底膜对细胞迁移的影响,进一步评价胶原蛋白和纤维蛋白凝胶的影响。
即使Boyden室的方法选择细胞活性和定向迁移的调查,研究纤维蛋白的组合方法和人工基底膜是缺席的。Matrigel-coated膜检测领域的应用血管生成,入侵细胞迁移,基底膜的渗透,anti-invasive和抗血管新生药物的临床前发展50- - - - - -53综述了),他们最近[54]。然而,Boyden室测定先前从未被用来测试增长factor-loaded生物材料与纤维蛋白和MSC。在早期的方法与I型胶原蛋白的主要结构部件边界层,涂层和IV型胶原蛋白、层粘连蛋白等建立了一个有选择性障碍(55]。这些结果和我们的研究使用胶原蛋白的结合和MSC。
当涂层Boyden室两边插入IV型胶原蛋白和使用HGF在不同浓度(10到100 ng / mL)为不同的人类肺癌细胞系,趋化和chemokinetic能动性对肿瘤细胞诱导(56]。另一组涂布双方的过滤与I型胶原蛋白,因为他们之前发现这是一个适当的分子支持MSC的粘附和迁移。趋化因子的综合分析骨髓MSC和兔子MSC,他们得出结论HGF必不可少的浓度化学引诱物的兔子和人类MSC (57]。这两项研究再一次强调了重要的HGF对选择性的影响和chemokinetic运动性不同的细胞类型。总之,我们的方法开辟了新的见解的主题增长因素趋化作用。总之,胶原蛋白和纤维蛋白作为运营商,胶质瘤有前途的候选人,我们将在进一步阐明在活的有机体内研究。
4所示。结论
我们能够展示HGF的逐步释放胶原蛋白和纤维蛋白凝胶,这是一个重要的MSC招聘系统的先决条件。此外,我们显示的积极效应HGF溶解在介质释放纤维蛋白或胶原蛋白凝胶(涂有或没有人工基底膜)在人类间充质干细胞的定向迁移和招聘在体外。自基底膜基质本身没有任何趋化因子或chemokinetic影响细胞的迁移,我们推断出增强迁移仅仅从HGF和HGF结合纤维蛋白和胶原蛋白凝胶。
在诊所,HGF-loaded生物材料可以立即植入慢性伤口或烧伤区域,从而克服时间和成本的关键问题在体外细胞扩张。进一步阐明纤维蛋白和胶原蛋白凝胶的直接机制与胶质瘤细胞迁移和伤口愈合,我们将启动一个在活的有机体内模型。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢Norina Labude优秀技术援助在整个研究中,茱莉亚Falkenstein Svenja彼得森(所有病理研究所,亚琛工业大学)进行ELISA检测,和DFG资助这个项目。