文摘
黏液样脂肪肉瘤是一种罕见的软组织肉瘤。尽管最初大多数病人对治疗反应良好,大约21%复发,强调治疗的必要性。确定新的治疗方案和更好地了解黏液样脂肪肉瘤肿瘤生物学,我们筛选不同的候选人,通过有针对性的疗法和化学疗法黏液样脂肪肉瘤细胞系。血管生成显示抗癌活性疗法这一目标。目标的小分子抑制剂axitinib血管生成抑制VEGFR和PDGFR家庭和c - kit,抑制细胞周期进展和诱导细胞凋亡在体外以及具有显著的抗肿瘤活性对MLS 1765黏液样脂肪肉瘤异种移植小鼠。Axitinib也显示协同抗肿瘤活性在体外当结合钾通道离子载体盐霉素或BH3模仿abt - 737。另一个angiogenesis-targeting治疗4 egi-1,目标肿瘤蛋白eIF4E,显著降低血管生成配位体由黏液样脂肪肉瘤细胞表达,减少肿瘤细胞生长。来验证这个致癌沉迷于血管生成途径,我们利用VEGFR-derived配体陷阱,发现自分泌VEGFR黏液样脂肪肉瘤细胞生存信号是至关重要的。总的来说,这些发现表明,自分泌血管生成信号通过VEGFR家庭黏液样脂肪肉瘤细胞生存是至关重要的,进一步研究axitinib作为一个潜在的抗癌治疗是十分必要的。
1。介绍
黏液样脂肪肉瘤是一种罕见的恶性肿瘤,起源于间充质组织和肿瘤级别是基于圆细胞形态学的百分比。大约有三分之二的美国肿瘤出现在大腿的肌肉组织,剩下的三分之一发生在深层脂肪组织。在极少数情况下,美国可以发现腹膜后腔或皮下注射1]。每年大约有600人被诊断为黏液样脂肪肉瘤(在美国2]。目前的治疗包括手术切除包括明确的利润,74%的病人接受放射治疗。在40%的病人,如阿霉素或异环磷酰胺化疗还包括是因为圆形细胞的存在。MLS圆细胞被认为是高转移性超过21%的患者发展转移或局部复发3]。因此,提出了一种改进的理解肿瘤生物学和调查新治疗方案是必要的。
黏液样脂肪肉瘤是一种独特的癌症> 95%的肿瘤含有相应的染色体易位,t(12、16)(问题;赛),生产嵌合融合蛋白FUS-CHOP(也称为FUS-DDIT3) [4,5]。FUS-CHOP驱动器黏液样脂肪肉瘤的肿瘤发生干扰转录因子(包括PPAR的表达ϒ1,PPARϒ2,C / EBPα,C / EBPβ和C / EBPδ),调节脂肪细胞的前体细胞的分化。这种改变驱动preadipocyte细胞增殖没有分化成一个连续循环,导致恶性肿瘤(6]。此外,转基因小鼠,无所不在地表达FUS-CHOP开发黏液样liposarcoma-like肿瘤在脂肪组织的网站。这一发现表明,FUS-CHOP引起黏液样脂肪肉瘤和足以驱动转换(7]。致癌基因的表达FUS-CHOP被认为是参与黏液样脂肪肉瘤肿瘤启动(8]。大约有50%的黏液样脂肪肉瘤细胞表达核FUS-CHOP [9),细胞为阴性切表达高水平的增殖标记(10]。这个逆扩散和FUS-CHOP表达式之间的关系导致人口衰老细胞(10]。衰老导致细胞凋亡和坏死,这在许多肿瘤中很常见。结果,组织缺氧随之而来,还有炎症,导致致癌的转换的微环境通过释放细胞因子和血管生成。因此这人口的细胞黏液样脂肪肉瘤可能致癌机制的反思,进一步增加这些肿瘤的复杂性。因此,针对FUS-CHOP或其下游介质可能是治疗有效。
为了确定新的治疗策略和黏液样脂肪肉瘤的肿瘤生物学特征,我们采用patient-derived mls - 402 - 91和mls - 1765 - 92细胞系阿曼等人于1992年第一次描述了(11]。在最近的一项研究,18%的黏液样/圆细胞脂肪肉瘤被证明表达激活PI3KCA突变(12),而100%的黏液样脂肪肉瘤(17/17)表达野生型样品PI3KCA和67%的圆细胞脂肪肉瘤(4/6)表达PI3KCA突变(13]。这表明,PI3KCA突变状态可用于两个脂肪肉瘤组织分割成黏液样和圆细胞类型。此外,穷人生存的反应这些肿瘤患者圆细胞组件有关。mls - 402 - 91和mls - 1765 - 92细胞株用于我们的学习表达野生型PI3KCA(13),因此反映了基因组景观的黏液样脂肪肉瘤人口。因此这些肉瘤细胞株用于本研究评估抗增殖和抗癌活动小组的批准和候选人有针对性的疗法和化学疗法在体外和在活的有机体内。
2。材料和方法
2.1。面板的药物和药物的候选人
以下43试剂被用于这项研究:AMG 102和帕尼单抗(Amgen);cercosporamide (BioAustralis);一种蛋白激酶抑制剂V (Calbiochem);57380 - 252424,bisindolylmaleimide本金保证产品和伊马替尼(开曼化学);CTX同类抑制剂(CRC);阿瓦斯丁(贝伐单抗)(Genentech /罗氏公司);4 egi-1 abt - 737, abt - 737对映体,pazopanib,和维甲酸(圣克鲁斯生物技术);埃罗替尼,拉帕替尼,索拉非尼和temsirolimus (Scientifix);bortezomib和CYT387 (Selleck化学品);AKT-I-1/2、axitinib bicalutamide、西洛地唑环巴胺,榫眼,达沙替尼,多烯紫杉醇、阿霉素、氟尿苷,氟尿嘧啶,戈舍瑞林,异环磷酰胺,PD98059,利巴韦林,盐霉素,SU11274,舒尼替,他莫昔芬和长春花碱(σ); NSC 7908 (Tocris); and temozolomide (Wyeth).
2.2。细胞培养
使用两个SV40-transfected patient-derived黏液样脂肪肉瘤细胞系:MLS - 402 - 91(402毫升)和MLS - 1765 - 92(1765毫升)。都由阿曼et al。(Lundberg癌症研究实验室、哥德堡大学、瑞典)(11]。脂肪肉瘤细胞系没有FUS-CHOP SW872,写明ATCC的获得。黏液样脂肪肉瘤细胞系是维护在RPMI中含有10% FCS GlutaMAX,青霉素和链霉素(表达载体)。HUVECs慷慨捐赠了p·罗杰斯(墨尔本大学,澳大利亚墨尔本)和维护在EGM-2 BulletKit介质(Lonza)。U87细胞来源于写明ATCC DMEM / F12培养基(马纳萨斯)和维护(表达载体)含5% FCS, GlutaMAX和青霉素和链霉素。
2.3。抗体、免疫沉淀反应和免疫印迹
短暂,血管内皮生长因子受体3 (VEGFR3)免疫沉淀物从黏液样脂肪肉瘤(IP)溶菌产物使用一只兔子反VEGFR3多克隆抗体(C-20, 1: 20;圣克鲁斯生物技术)和蛋白质A / G琼脂糖珠(圣克鲁斯生物技术)。混合物是孵化18 h与旋转在4°C。珠子被洗了,煮5分钟在95°C减少缓冲洗提蛋白。西方墨点法进行了如前所述[14]。总VEGFR3检测使用一只兔子反VEGFR3多克隆抗体(C-20, 1: 200);phospho-VEGFR3检测使用鼠标反pan-phospho-tyrosine单克隆抗体(135900年,1:2000;英杰公司)。下面的抗体也用于免疫印迹:鼠标反砍单克隆抗体(L63F7, 1: 1000;细胞信号技术)和一只兔子反真核翻译起始因子4 e (eIF4E)单克隆抗体(C46H6, 1: 1000;细胞信号技术)。680种特异的Alexa萤石免疫球蛋白(表达载体)二级抗体被用于免疫沉淀反应和免疫印迹。
2.4。细胞增殖(MTS)测定
一种MTS染料吸收试验进行测量细胞增殖。MTS试剂(20μL)被添加到96 -孔板(细胞效价96水非放射性细胞增殖[Promega]),和盘子被孵化为2.5 h公司37°C的5%2。吸光度测量在490 nm使用FLUOstar最适条件分光光度计和软件(版本2.2得奖感言)。
2.5。siRNA可拆卸的
黏液样脂肪肉瘤细胞被播种在盘子和孵化18小时37°C公司5%2。然后siRNAs针对切或eIF4E或控制争夺siRNAs中增加了制造商的协议(Dharmacon ON-Targetplus SMARTpool,热费希尔科学)。板块在培养5天37°C公司5%2然后一个MTS试验或免疫印迹。
2.6。管形成分析
基底膜基质生长因子减少基底膜矩阵(22毫克/毫升(BD生物科学))在冷稀释至8.8毫克/毫升,无菌PBS和100μL被转移到每个冷冻的96孔板。板是孵化为2 h 37°C设置人工基底膜。与PBS HUVEC细胞被洗,解除瓶,再洗与血清基底EGM-2介质(Lonza)。然后,添加了10000个细胞/控制媒介或媒介一起从美国402个细胞使用药物。消极的控制介质基底EGM-2介质(血清),和积极的控制介质是EGM-2介质补充生长因子和2% FCS提供的介质。板是37°C 5%孵化有限公司2每隔1 h和图片记录了12 h的普洛古莱MF酷相机连接到一个Axiovert 40节能灯显微镜,利用普洛古莱Mac捕获软件(版本2.8.3)。管长度测量使用ImageJ(版本1.47 d)。
2.7。药物的屏幕
黏液样脂肪肉瘤细胞被播种到96 -孔板在1000 - 2000细胞/好,孵化了18 h公司37°C的5%2。上面列出的药物被添加到板一式三份的最终浓度10μ米,除了贝伐单抗(10毫克/毫升),和盘子37°C 5%孵化有限公司25天。一个MTS试验进行计算细胞的可行性。Isobolograms计算使用洛伊可加性的方法(15),而周和组合指数(CI)情节生成使用周和Talalay方法[16]。
2.8。RT-qPCR
短暂,黏液样脂肪肉瘤细胞被取消的烧瓶和PBS洗,和总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)按照制造商的指示。RNA是DNase治疗使用RQ1 RNase-Free DNase工具包(Promega),作为制造商的协议中列出,然后转化为互补使用上标三世第一链合成系统工具包(英杰公司)按照制造商的指示。引物和探针具体VEGFR1、VEGFR2 VEGFR3, VEGFA, VEGFB,细胞周期蛋白D1 (FAM探针和nonfluorescent冷却器(应用生物系统公司))。互补脱氧核糖核酸(2.5μL)添加到底漆/探针集和TaqMan基因表达主人(应用生物系统公司),混合后,制造商的协议。PCR是在7900快速实时PCR thermocycler标准循环条件下(应用生物系统公司)。数据分析使用SDS 2.3软件(应用生物系统公司)。管家基因被归一化的值H6PD或GAPDH。相对量化决心使用方法(17]。
2.9。配体的陷阱
黏液样脂肪肉瘤细胞被播种密度1000 - 2000细胞每口井96 -孔板和孵化37°C公司5%218 h。然后在2.0添加了配位体的陷阱μg / 100μ李:重组人类VEGFR1 (FLT-1) fc嵌合体(研发系统),重组鼠标VEGFR3 (FLT-4) fc嵌合体(研发系统),这两种配体陷阱,或车辆控制。板块在37°C 5%孵化有限公司23天,然后一个MTS试验。
2.10。Bio-Plex和MILLIPLEX化验
Bio-Plex (Bio-Rad)和MILLIPLEX(微孔)包被用来量化的总水平和/或磷酸化蛋白质的水平。短暂,黏液样脂肪肉瘤细胞被播种密度的200000细胞/在6-well板和孵化18 h公司37°C的5%2。细胞治疗2 h axitinib (IC50与PBS)或车辆控制、清洗,lyzed使用提供的缓冲区。制造商的指令被跟踪。的Bio-Rad Bio-Plex 200系统被用来测量板,和数据分析使用5.0软件Bio-Plex经理。
2.11。细胞周期分析和膜联蛋白V染色
黏液样脂肪肉瘤细胞()被播种在25厘米2烧瓶,孵化18 h公司37°C的5%2,然后接受axitinib (IC5018 h)或车辆控制。单层细胞被洗,细胞被取消的井和统计。
细胞周期分析,细胞在1毫升PBS resuspended 25μL propidium碘(100μg / mL,σ),然后正欲用流式细胞仪分析第二章。荧光信号DNA-propidium碘检测使用585/42 nm带通滤波器。G1的细胞含有DNA的分布特点,年代,G2 / M细胞周期阶段确定使用FlowJo软件(用7.5.5版本)。
膜联蛋白V / 7法测定了用PE膜联蛋白V凋亡检测装备1(正),按照制造商的说明。荧光信号的膜联蛋白V-PE使用585/42 nm带通滤波器检测。数据分析使用FlowJo软件。
2.12。在活的有机体内老鼠研究
我们的研究是莫纳什大学医学中心动物伦理委员会批准,按照莫纳什大学和NHMRC指南。老鼠一直在无菌条件下12 h灯:黑暗周期为23°±2°C。老鼠提供食物和水随意。驯化期是2周。Nonobese diabetic-severe联合免疫缺陷(NOD-SCID)老鼠来自纳什动物服务(澳大利亚墨尔本)。
到6-8-week-old女性NOD-SCID老鼠,1765毫升细胞皮下注入两侧翼。肿瘤的比例越来越小;因此,为在活的有机体内药物治疗的实验中,我们将种植肿瘤移植到新老鼠的侧翼如下:当肿瘤生长的细胞达到1000毫米3肿瘤,切除和剥离,部分达100毫米3被移植到新捐赠者的侧翼NOD-SCID老鼠。这个过程有一个好处,那就是几乎所有的肿瘤生长,肿瘤没有接受药物治疗期间增长适应。肿瘤已经连续五次移植(P5)(见补充图S10在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/3484673)被用于治疗研究。
当肿瘤约200毫米3小鼠随机分为控制和治疗组,和治疗开始。这个肿瘤大小是选择启用前足够时间的药物治疗肿瘤达到道德允许的最大尺寸,1000毫米3。老鼠每两天注射30毫克/公斤axitinib或车辆控制了12天。定期使用数字卡尺测量肿瘤,肿瘤体积计算使用公式(长×宽2)/ 2。最后注入两天后,老鼠扑杀,和肿瘤切除,称重,拍照。老鼠每天监测,如果肿瘤增长超过1000毫米3,老鼠是人类安乐死。
2.13。统计分析
数据分析使用GraphPad棱镜(第6版)。学生的以及用于成对分析。统计学意义是。
看到补充方法进一步细节剂量反应曲线和组合药物试验。
3所示。结果
3.1。4 egi-1 Axitinib对黏液样脂肪肉瘤细胞有抗增殖活动
确定药物和抗增殖活动,我们43药物的筛选在体外抗增殖活动对二黏液样脂肪肉瘤patient-derived细胞系,美国职业足球大联盟402年和1765年美国职业足球大联盟,都被证实表达FUS-CHOP [18]。面板包括化疗和靶向治疗和选择的基础上,针对癌症特异性的蛋白质。每种药物测试在10μ米,最高剂量与疗效的相关性。黏液样脂肪肉瘤细胞的增殖抑制,由MTS试验,在代理的存在诱导细胞凋亡(abt - 737(402年美国职业足球大联盟,14.1μM;美国职业足球大联盟1765年12.8μ1.3 M]和盐霉素(美国职业足球大联盟402年μM;美国职业足球大联盟1765年1.3μM])或目标受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂(axitinib(美国职业足球大联盟402年1.2μM;美国职业足球大联盟1765年3.2μ1.6 M],达沙替尼(美国职业足球大联盟402年μM;美国职业足球大联盟1765年4.0μ10.4 M],索拉非尼(美国职业足球大联盟402年μM;美国职业足球大联盟1765年9.9μM],和舒尼替美国职业足球大联盟402年3.8μM;美国职业足球大联盟1765年1.7μM]),以及蛋白酶体抑制剂bortezomib[美国职业足球大联盟402年0.03μM;美国职业足球大联盟1765年0.06μM]和eIF4E抑制剂4 egi-1[美国职业足球大联盟402年,8.2μM;美国职业足球大联盟1765年4.8μM](图1(一)和1 (b))。黏液样脂肪肉瘤细胞也高度敏感的化学疗法阿霉素和氟尿苷。
(一)
(b)
接下来,我们评估的有效性最高的药物抗增殖活动(那些细胞生存能力减少了70%或更多的筛选试验),通过测量的抗增殖活性药物稀释系列(补充图S1)。有针对性的治疗,抗增殖活动的顺序(最高到最低),确定从half-maximal抑制浓度(IC50(补充表)值),是cyt - 387、盐霉素axitinib,达沙替尼,egi-1舒尼替,4。
找出更有效的治疗策略比单一的代理,我们结合对药物。药物组合基于灵敏度高(即被选中。,较低的集成电路50),偏爱靶向治疗和合理组合(例如,RTK抑制剂和细胞凋亡诱导物)(补充表和补充数据S2-S8)。我们检查了药物对细胞生长的影响,单独和组合,利用MTS扩散试验。几双,特别是包含proapoptotic盐霉素药物组合,展示了增强抗增殖活动相结合。axitinib和盐霉素的组合协同活动对美国1765年和402年对MLS添加剂活动(补充图S2)。abt - 737和盐霉素组合协同活动对黏液样脂肪肉瘤细胞系(补充图S5)。达沙替尼+盐霉素(补充图S6)和abt - 737 + axitinib(补充图S7)协同活动反对1765毫升。4 egi-1和盐霉素组合协同活动对美国402年和1765年对MLS添加剂活动(补充图S4)。相比之下,axitinib和4 egi-1是敌对的两个细胞系(补充图S3),要么是结合阿霉素时,没有观察到增强细胞死亡(补充图S8)。这些结果表明,结合药物治疗涉及proapoptotic代理和有针对性的疗法可能对黏液样脂肪肉瘤是高度有效的。
3.2。FUS-CHOP黏液样脂肪肉瘤细胞生存和eIF4E是至关重要的
我们选择了两个代理的小组基于他们的抗增殖活性高、能力目标黏液样liposarcoma-specific proteins-4EGI-1和axitinib-and黏液样脂肪肉瘤的特征目标的重要性。我们也为FUS-CHOP的重要性,鉴于这种融合蛋白的广泛存在在黏液样脂肪肉瘤。这个目标不是屏幕因为没有检查的候选人或批准FUS-CHOP疗法这一目标。
eIF4E抑制剂4 egi-1的成功在我们的初始屏幕指着一个角色在黏液样脂肪肉瘤癌蛋白。这是一个以前的报告显示,支持eIF4E黏液样脂肪肉瘤和过表达可能是肿瘤发展的关键(6]。调查的重要性FUS-CHOP黏液样脂肪肉瘤和eIF4E表达,我们执行的siRNA可拆卸的排骨(使用CHOP-directed siRNA也目标FUS-CHOP)或eIF4E黏液样脂肪肉瘤细胞系。FUS-CHOP击倒的特定FUS-CHOP和野生型切,决定通过执行一系列的免疫印迹药物诱导表达野生型切(补充图S9 (a))。此外,野生型切并不是出现在黏液样脂肪肉瘤细胞系(补充图S9 (C))。因此,siRNAs特定和按预期运行。治疗用siRNA导致明显减少蛋白表达与治疗相比Lipofectamine只有:FUS-CHOP蛋白质的数量降低了60%在每个黏液样脂肪肉瘤细胞系(图2(一个)补充图S9 (A)), eIF4E蛋白质的数量降低了75%,美国1765年美国职业足球大联盟(图402和82%2 (b)和补充图S9 (B))(切:美国402年,,1765年美国职业足球大联盟;eIF4E:美国402年和1765年美国职业足球大联盟,)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
然后我们调查的影响siRNA-mediated击倒砍或eiF4E细胞生存和扩散通过使用MTS增殖细胞治疗CHOP-directed核数量明显低于细胞争夺控制核处理,减少了45%的美国职业足球大联盟402个细胞减少39%,美国1765个细胞(图2 (c))。同样,eIF4E-directed siRNA显著降低细胞增殖,62%,美国402个细胞为83%,美国1765个细胞(图2 (c))。因此,eIF4E和FUS-CHOP黏液样脂肪肉瘤细胞增殖和生存的关键。
3.3。FUS-CHOP eIF4E促进血管生成属性
除了肿瘤细胞增殖,VEGFR信号,促进血管生成,被牵连的司机黏液样脂肪肉瘤和其他肉瘤(19- - - - - -21]。具体来说,VEGFA是人类黏液样脂肪肉瘤中普遍检测到肿瘤(22],FUS-CHOP可以上调VEGFR1当表达在人类纤维肉瘤细胞(HT108023]。与这些研究结果一致,我们的药物屏幕识别VEGFR抑制剂axitinib,索拉非尼,舒尼替强有力的黏液样脂肪肉瘤细胞生长抑制剂。同样,eIF4E也已被证明能够提升血管生成因子(24]。检查潜在的关联FUS-CHOP eIF4E表达式和黏液样脂肪肉瘤细胞的血管生成活动,我们检查的影响siRNA击倒proangiogenic表达和活性的因素。
击倒的FUS-CHOP CHOP-directed siRNA显著降低VEGFR1的表达(VEGFA)及其配体(混乱),相比之下,1765年美国核细胞(图2 (d))。此外,媒介来自美国402个细胞治疗CHOP-directed siRNA显著降低内皮细胞管相比,形成积极的控制介质()(图2 (e)),进一步突显出angiogenesis-promoting FUS-CHOP的属性。
同样,eIF4E击倒显著降低VEGFR3的表达()和配体对VEGFR1 VEGFA ()和VEGFB ()与1765年美国争夺siRNA细胞(图2 (d))。从402毫升细胞条件培养基使用eIF4E-directed siRNA也显著降低内皮细胞管形成与细胞条件培养基从402毫升小干扰rna(使用混乱)(图2 (e))。
来证实这些发现,我们使用4 egi-1活性抑制eIF4E。MLS 1765细胞和402毫升细胞显著减少的表达VEGFR1(402年美国职业足球大联盟,;1765年美国职业足球大联盟,402年),VEGFR3 (MLS,;1765年美国职业足球大联盟,402年),VEGFA (MLS,;1765年美国职业足球大联盟,402年),VEGFB(美国职业足球大联盟,;1765年美国职业足球大联盟,)后4 egi-1治疗,而vehicle-control-treated细胞(图3(一个))。其他VEGFR受体VEGFR2,表示只有微量的黏液样脂肪肉瘤细胞系(补充图9 (D));因此,抑制VEGFR2不大可能影响黏液样脂肪肉瘤细胞系。VEGF的配体和受体表达与4 egi-1证实药物抑制后eIF4E促进血管生成一些黏液样脂肪肉瘤细胞系的属性。这一发现进一步证实了显著减少血管生成细胞条件培养基从配体使用4 egi-1,导致显著减少内皮细胞管形成相比,车辆控制()(图3 (b))。因此,eIF4E和FUS-CHOP导致血管生成在黏液样脂肪肉瘤细胞通过血管生成的调控受体和配体。
(一)
(b)
(c)
3.4。VEGFR信号是细胞增殖所必需的
黏液样脂肪肉瘤细胞系的建立依赖于血管生成的自分泌活动受体及其配体,我们测量细胞增殖的变化响应VEGFR1和VEGFR3配体陷阱,模拟相应的受体配体和隔离,从而防止受体的活动。配体陷阱显著抑制细胞增殖(MLS 402 (VEGFR1 9%,;VEGFR3 79%,1765)和美国(VEGFR1 31%,;VEGFR3 76%,结合]和[美国402 (VEGFR1 + VEGFR3 91%,)和美国1765 (VEGFR1 + VEGFR3 94%,(图)与汽车相比治疗3 (c))。因此这些数据表明VEGFR1 VEGFR3促进黏液样脂肪肉瘤细胞增殖,细胞有强烈的依赖VEGFR3信号。
3.5。Axitinib磷酸化的抑制血管生成受体
鉴于上述结果,我们决定描述axitinib抗血管新生药物的抗肿瘤作用,抗增殖活性高,在细节。鉴于VEGFRs的重要性在血管生成和肿瘤细胞增殖,我们调查了axitinib影响血管生成的激活受体,激活的信号转导分子,表达血管生成分子,形成内皮管,细胞周期的进展,细胞凋亡,肿瘤异种移植的增长。
首先,我们评估的影响axitinib磷酸化,从而激活,其血管生成和cell-proliferation-promoting RTK目标(VEGFR1/2/3,血小板源生长因子受体α/β(PDGFRα/β)和c - kit)。使用MILLIPLEX鉴定磷酸化c - kit, PDGFRα和PDGFRβ,我们发现显著减少phospho-c-Kit(402年美国职业足球大联盟,;1765年美国职业足球大联盟,)和phospho-PDGFRβ(美国402年和1765年美国职业足球大联盟,)axitinib治疗后,而控制(图4(一))。还有一个在phospho-PDGFR显著减少β(美国402年和1765年美国职业足球大联盟,402年)和phospho-c-Kit(美国职业足球大联盟,;1765年美国职业足球大联盟,)与伊马替尼治疗,而车辆控制。Phospho-PDGFRα这些细胞水平低于检测水平。此外,美国1765个细胞治疗axitinib相比显著降低磷酸化VEGFR3车辆控制(),尽管没有VEGFR3的总水平(图的变化4 (b))。这些数据表明,axitinib抑制血管生成的激活,cell-proliferation-promoting受体VEGFR3 c - kit和PDGFRβ。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。Axitinib抑制二次信号分子的磷酸化
确定细胞内axitinib治疗的影响,我们进行了Bio-Plex化验检查的胞内信号分子磷酸化已知的下游血管生成受体:AKT, ERK1/2,我κBα、JNK1/2和p38 MAPK。我们发现显著减少一种蛋白激酶的磷酸化(402年美国职业足球大联盟,;1765年美国职业足球大联盟,),并显著减少的磷酸化ERK1/2 axitinib治疗后(402年美国职业足球大联盟,;1765年美国职业足球大联盟,细胞系(图)4 (c))。没有改变我的磷酸化κBα、JNK1/2和p38 MAPK(数据没有显示)。这些数据表明,axitinib的影响可能是通过减少ERK1/2和AKT介导的活动(25]。
3.7。Axitinib抑制血管生成的属性
确定是否axitinib还能抑制由黏液样脂肪肉瘤细胞可溶性血管生成因子的表达,我们检查了VEGFR和VEGF的表达。Axitinib治疗显著降低VEGFR1、VEGFR3 VEGFA, VEGFB 402毫升细胞(,,,、职责)和VEGFR1 VEGFA 1765毫升细胞(和、职责),相比之下,车辆控制(图4 (d))。此外,在形成试验的管道,从402毫升细胞条件培养基,对待axitinib管形成诱导显著低于从vehicle-treated MLS 402个细胞条件培养基()(图4 (e))。
3.8。Axitinib停止细胞周期进程和凋亡
进一步描述的抗肿瘤效应axitinib黏液样脂肪肉瘤细胞系,我们进行了细胞周期检测和膜联蛋白V凋亡检测。与汽车相比,axitinib-treated MLS 1765细胞群有较高比例的细胞周期G1期细胞,显著减少在S期细胞的比例,而且几乎没有细胞G2 ()(图5(一个))。这个结果清楚地表明,axitinib治疗抑制黏液样脂肪肉瘤细胞通过细胞周期的进展。来验证这一发现,我们还研究了细胞周期蛋白D1的表达,细胞周期的关键调节器,G1 / S所需的过渡。我们观察到显著减少的表达细胞周期蛋白D1在两个细胞系(402毫升,;1765年美国职业足球大联盟,axitinib治疗后(图)5 (b))。减少了细胞周期进程和细胞周期蛋白D1表达会导致细胞增殖下降。
(一)
(b)
(c)
确定axitinib减少通过细胞凋亡和坏死细胞的生存,我们测量诱导凋亡标记膜联蛋白v axitinib治疗早期凋亡细胞的比例增加,膜联蛋白V-positive (Q3)(美国1765个细胞,车辆,积极的3%;axitinib,积极13%)(图5 (c))。坏死也评估,通过测量坏死7 aad标志。同样,axitinib 7 aad阳性细胞的比例增加(Q1)(美国1765个细胞,车辆,4%的阳性细胞;axitinib, 6%)。细胞阳性膜联蛋白V和7 aad (Q2),代表凋亡后期,也增加了axitinib治疗(MLS 1765个细胞,车辆,积极的9%;axitinib积极的26%)。在一起,这些数据表明axitinib减少细胞增殖和生存通过抑制细胞周期进展和诱导细胞凋亡和坏死。
3.9。Axitinib抑制肿瘤生长在活的有机体内
评估是否axitinib也有活动在活的有机体内,我们建立了一个动物使用美国1765个细胞异种移植模型。异种移植的治疗开始时接种肿瘤后7天100 - 200毫米3。白天6治疗(接种后13天),axitinib-treated肿瘤(毫米3)明显小于车辆控制(毫米3),由卡尺测量。Axitinib-treated肿瘤小得多(毫米3比vehicle-treated肿瘤)(毫米3白天)20)(图6(一))。实验结束时(接种后20天,因为道德限制),测量肿瘤切除,重(图6 (b)),拍照(图6 (c))。组内观察到肿瘤大小的变化是一致的,我们和其他人在异种移植实验中观察到。也有显著减少的重量axitinib-treated肿瘤(g)与车辆控制(g) ()。四治疗剂量后,小鼠的肿瘤接受车辆只有,平均体积增加了一倍,而在治疗组已经成为静态的。白天21日vehicle-treated肿瘤体积的三倍,而治疗组保持静态。因此,axitinib显著减少黏液样脂肪肉瘤肿瘤的生长在活的有机体内。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
本研究评估肿瘤发生的分子基础在黏液样脂肪肉瘤和鉴定了大量的潜在的治疗。具体来说,本研究为特征的重要性VEGF受体和配体黏液样脂肪肉瘤细胞生存和中介目标的有效性VEGF和VEGFR信号,如axitinib和4 egi-1。
黏液样脂肪肉瘤是一种罕见的恶性肿瘤,其特点是融合蛋白的表达FUS-CHOP [11]。FUS-CHOP击倒的黏液样脂肪肉瘤细胞抑制细胞生长,诱导细胞周期阻滞,减少VEGFR1表达和血管生成配位体VEGFA。这些发现表明,FUS-CHOP介导(至少部分)通过诱导细胞转化活动自分泌血管生成信号循环。这个假说是一致的与之前报道20倍增加VEGFR1表达细胞表达外源FUS-CHOP [23]。此外,当FUS-CHOP-negative细胞系SW872 axitinib处理或舒尼替,IC50值明显升高(6.2μM和15.1μM, resp)与MLS FUS-CHOP-positive细胞系相比,表明减少敏感性VEGFR抑制。这些数据表明,黏液样脂肪肉瘤细胞系表现出更加敏感的抑制血管生成因素,表明肿瘤生长的可能机制。
我们发现VEGFR3配体陷阱,结合VEGFC VEGFD,明显抑制黏液样脂肪肉瘤细胞的生长证实可溶性血管生成因素,至少在一定程度上推动这些细胞的生长。阿瓦斯丁是一种单克隆抗体,目标VEGFA,主配体负责血管生成。尽管黏液样脂肪肉瘤肿瘤表达VEGFA VEGFR2的表达(VEGFA的主要受体)在这些细胞是可以忽略的。VEGFR3的表达是黏液样脂肪肉瘤细胞株,升高有可能针对VEGFR3和/或配体VEGFC或VEGFD将是有益的。这些试剂不是现成的诊所,针对VEGFR受体提供了一个更有效的选择。通过这种方式,针对黏液样脂肪肉瘤细胞的血管生成途径仍然是一个可行的选择,而阿瓦斯丁的效用可能是有限的。
FUS-CHOP超表达的几个upregulation细胞系导致的PDGFRA HGF,见面的时候,白细胞介素6(8),而VEGFR基因(23]。从我们的药物分析数据(补充表S1),这两个试剂,是最有效的减少黏液样脂肪肉瘤细胞生长(即。,这两个最低的IC50值),专门针对这些rtk axitinib和舒尼替。索拉非尼,目标VEGFR2/3 PDGFRβBRAF,表现出高集成电路50年代,表明更依赖VEGFR1和PDGFR FUS-CHOP-containing细胞α信号。然而,这不是FUS-CHOP-negative细胞的情况下,表现出很低的IC50索拉非尼。这些数据表明,FUS-CHOP RTK表达和监管作用,导致微分反应有针对性的治疗。
可以看到,mls - 402和mls - 1765被axitinib显著抑制和舒尼替,和由于其他刺激基因,将这些药物与其他抑制剂进一步提高其功效。当FUS-CHOP沉默在两个黏液样脂肪肉瘤细胞,抑制发生增长60%。此外,FUS-CHOP沉默也显著降低VEGFR1的表达(表达的细胞可以忽略不计VEGFR2)和阻止内皮细胞管形成(血管生成的一个指标)。在一起,这些数据表明FUS-CHOP表达式黏液样脂肪肉瘤细胞增长的贡献是显著的,针对融合基因和/或其下游VEGFR1和PDGFR等目标α引发重大的黏液样脂肪肉瘤的抑制肿瘤的生长。
另一个已知蛋白促进血管生成是eIF4E。其他表明FUS-CHOP结合致癌基因的启动子转录因子eIF4E,导致其过度(6]。我们的研究结果表明,eIF4E表达对黏液样脂肪肉瘤细胞存活和增殖至关重要。化学抑制和siRNA击倒eIF4E明显下降的可行性两个黏液样脂肪肉瘤细胞株,证明eIF4E的表达和活动所需的黏液样脂肪肉瘤细胞生长。类似于我们发现FUS-CHOP促进血管生成,我们也证明了eIF4E促进血管生成因素的生产在黏液样脂肪肉瘤细胞株,为eIF4E siRNA可拆卸的显著降低VEGFA的表达,VEGFB, VEGFR3。同样,药物抑制eIF4E 4 egi-1 VEGFR1的表达减少,VEGFR3, VEGFA, VEGFB黏液样脂肪肉瘤细胞系。这一发现表明,eIF4E上调VEGFR信号,从而导致黏液样脂肪肉瘤肿瘤发生。其他人已经表明,过度eIF4E可以上调VEGFA表达式(26,27]。前面展示VEGFA增加HUVECs VEGFR1表达的能力和发展中内皮细胞(28,29日)或许可以解释为什么我们观察到减少VEGFA和eIF4E抑制VEGFR1表达式。细胞条件培养基从eIF4E-directed siRNA-treated黏液样脂肪肉瘤是一管形成刺激试验比车辆控制。这个观察提供了一个功能演示eIF4E的活动之间的联系和刺激血管生成。此外,这些研究证实VEGFR的重要性在黏液样脂肪肉瘤细胞株信号。
代理4 egi-1是一个高度互动的特定和竞争性抑制剂eIF4E和如果25μM和专门抑制帽依赖翻译通过upregulation 4 e-bp-1 [30.]。本研究中使用的黏液样脂肪肉瘤细胞表现出IC508.2和4.8的值μ米,下面范围说明强烈的敏感性到代理。相比之下,FUS-CHOP-negative脂肪肉瘤行SW872 IC展出5025μ米,这表明这些细胞不敏感的代理(补充表图S11 S1和补充)。在一起,这些发现表明,4 egi-1抑制剂eIF4E非常具体,增加黏液样脂肪肉瘤细胞eIF4E抑制的敏感性。这个代理的进一步评估诊所因此保证FUS-CHOP-positive肿瘤。
我们最初的药物屏幕识别axitinib黏液样脂肪肉瘤细胞系的有效抑制剂。通过针对血管生成Axitinib抑制细胞生长,这是一个重要的生存过程的黏液样脂肪肉瘤细胞系和黏液样脂肪肉瘤的临床进展19,31日,32]。我们的结果显示angiogenesis-associated分子的总水平明显下降(VEGFR1, VEGFR3、VEGFA VEGFB),以及减少VEGFR3磷酸化,axitinib后治疗。我们还表明,与vehicle-pretreatment不同,从黏液样脂肪肉瘤细胞条件培养液用axitinib预处理降低了血管生成配体的表达,如图所示由内皮细胞减少管形成。血管生成是肿瘤发生的一个关键过程:抑制VEGFR1的活动或VEGFR3减少乳腺癌或结直肠癌细胞系的增殖在体外,抑制肿瘤的生长在活的有机体内(33- - - - - -36]。血管生成的重要性在我们的实验中突出显示的高灵敏度黏液样脂肪肉瘤细胞系VEGFRs代理这一目标,如axitinib,索拉非尼和舒尼替。此外,VEGFR1的重大影响和VEGFR3配体陷阱对细胞生存建立VEGFR黏液样脂肪肉瘤细胞生存信号可能是至关重要的。
除了抗血管新生的影响,axitinib限制rtk和下游的表达和/或活动第二信使。PDGFR Axitinib减少VEGFR3的磷酸化βc - kit,以及下游分子AKT(1765毫升)和ERK1/2。AKT特征明显和ERK1/2 VEGFR3介质,PDGFRβ,c - kit信号和已知重要的角色在调节细胞生存、增殖和血管生成(37- - - - - -41]。此外,axitinib高度有效的针对黏液样脂肪肉瘤异种移植小鼠和应该探索作为潜在的治疗诊所。我们的研究结果进一步支持西et al .,还是证明了抗癌药物trabectedin抑制黏液样脂肪肉瘤的生长由针对异种移植血管生成(19]。
两个软组织肉瘤的临床试验已经使用有针对性的疗法pazopanib和索拉非尼,执行有限的成功(42,43]。这种缺乏功效可能反映了这些药物的特异性VEGFRs [44),特别是低于axitinib。此外,脂肪肉瘤亚型没有报道;因此,这些药物可能对黏液样脂肪肉瘤没有评估。
RTK抑制剂时非常有效的肿瘤是由有限数量的致癌基因启动子,在CML bcr - abl等。克服异构肿瘤如黏液样脂肪肉瘤肿瘤(和其他人),然而,RTK抑制剂必须目标不止一个致癌途径(如axitinib)或必须结合其他RTK抑制剂或化疗。与阿霉素axitinib[0.02的结合μM]在美国1765个细胞减少了axitinib IC50从3.17μ米至0.5μ米在体外。因此可能这个组合将是有效的,并将毒性低于剂单独使用,并进一步调查axitinib潜在用途的诊所是十分必要的。
从我们的研究中的一个明显的发现是VEGFR3在黏液样脂肪肉瘤细胞系的重要性。Axitinib治疗显著降低VEGFR3的磷酸化,c - kit和PDGFRβ。此外伊马替尼,目标相同的受体axitinib,除了VEGFRs,减少了c - kit的磷酸化和PDGFRβ但没有抑制黏液样脂肪肉瘤细胞增殖/生存在一个生物相关的剂量。因此,选择性的有效性axitinib可能是因为axitinib VEGFRs的抑制。我们已经表明,美国402年和1765年美国职业足球大联盟不表达VEGFR2,我们无法检测VEGFR1磷酸化的两个细胞系(数据未显示),这表明VEGFR1可能不是在黏液样脂肪肉瘤细胞活跃。重要的是,VEGFR3配体陷阱强有力地抑制黏液样脂肪肉瘤细胞生存能力,而VEGFR1配体陷阱只有温和的影响。这些结果支持的发现VEGFR酪氨酸激酶抑制剂二世,这目标VEGFR1 VEGFR2, c - kit,生理上和Src相关剂量并没有显着影响的3黏液样脂肪肉瘤细胞株的增殖(包括402毫升和1765毫升)或纤维肉瘤细胞系转染与FUS-CHOP [23]。因此,VEGFR3(而不是VEGFR1或VEGFR2)是细胞生存和增殖的重要受体黏液样脂肪肉瘤细胞。此外,VEGFR3已被证明是重要的在其他肿瘤类型。击倒VEGFR3表达式的siRNA结肠癌或乳腺癌细胞系被证明能减少肿瘤细胞增殖在体外并显著抑制肿瘤的生长在活的有机体内(35,36),这表明VEGFR3抑制足以抑制肿瘤的生长。总的来说,我们的研究结果强调VEGFR3黏液样脂肪肉瘤的一个关键受体细胞生存和表明,黏液样脂肪肉瘤细胞可能致癌VEGFR3瘾信号显示。
黏液样脂肪肉瘤是异构的肿瘤,因此,针对FUS-CHOP或者下游FUS-CHOP仅仅是部分有效的目标。结合有针对性的疗法,如axitinib FUS-CHOP下游效应器(目标)与化疗(阿霉素)、抗生素(盐霉素),一个细胞凋亡诱导物(abt - 737),或eIF4E抑制剂(4 egi-1),协同和拮抗组合识别。许多组合导致微分响应之间的两个细胞系,包括对抗一个细胞系和合作在其他(补充表S2)。这表明,任何联合治疗在黏液样脂肪肉瘤的未来需要个性化。
有一些警告我们的数据应该被考虑。两种细胞系和SV40无限增殖,这可能影响他们的生物学以意想不到的方式。此外,而美国402年典型的1型FUS-CHOP记录中发现24%的患者黏液样脂肪肉瘤(45,美国1765年有一个罕见的类型8成绩单(46]。虽然两个细胞系药物评估显示类似的反应在体外,只有1765毫升细胞在小鼠肿瘤异种移植。因此,我们的在活的有机体内数据可能不代表黏液样脂肪肉瘤细胞系有典型的FUS-CHOP融合。然而,在撰写本文时,这两个细胞系是唯一黏液样脂肪肉瘤行文献中报道,因此是最有效的细胞模型。
三个确定的11个化合物的高剂量(10μ米)初始屏幕有显著的抗血管新生的活动。滴定的axitinib(增刊。表)显示其集成电路50是1 - 3μM跨两个黏液样脂肪肉瘤细胞系。axitinib在这个剂量,可能是其抗肿瘤活性是通过其抑制介导rtk PDGFR等。我们试图解决这种可能性在两个方面。首先,我们使用VEGFR1和VEGFR3配体陷阱非常具体的血管生成因子和没有不相干的活动,发现这些也抑制了黏液样脂肪肉瘤细胞株的生长。第二,我们评估对伊马替尼的反应,目标相同的激酶axitinib除了VEGFR的家庭,并发现它没有对黏液样脂肪肉瘤细胞株抗肿瘤活性。我们没有足够数量的配体陷阱异种移植研究,因此有限axitinib。因此,我们不能确切的抗肿瘤活性在活的有机体内纯粹是由axitinib的抗血管新生的活动,其中一些可能导致其他rtk的抑制。
5。结论
我们发现,VEGF受体信号,特别是通过VEGFR3,有一些黏液样脂肪肉瘤细胞系的生存。此外,axitinib治疗代理目标VEGFRs(包括VEGFR3),显示了抗肿瘤活性与黏液样脂肪肉瘤细胞系和显著减少美国1765异种移植小鼠的生长。我们的数据表明,axitinib应该继续评估作为一个潜在的治疗黏液样脂肪肉瘤患者。
信息披露
杰奎琳·f·多诺霍的现在地址是妇科研究中心,墨尔本大学,7级,皇家女子医院,弗兰明路,Parkville维克3052年,澳大利亚。
相互竞争的利益
没有利益冲突。
作者的贡献
劳伦·t·克尔和杰奎琳·f·多诺霍同样这工作和被认为是平等的第一作者。特伦斯·g·约翰斯和劳伦·t·克尔负责构思和设计。劳伦·t·克尔特伦斯·g·约翰,杰奎琳·f·多诺霍,亚历山大·l·威尔丁负责开发的方法学。劳伦·t·克尔和杰奎琳·f·多诺霍负责采集的数据。劳伦·t·克尔负责数据的分析和解释。劳伦·t·克尔特伦斯·g·约翰,杰奎琳·f·多诺霍是负责撰写,评论,和/或修改的手稿。特伦斯·g·约翰斯和杰奎琳·f·多诺霍的贡献同样研究监督。
确认
作者感谢p·罗杰斯捐赠HUVEC细胞。作者感谢d . Dadley-Moore编辑稿件。这项工作有部分是由NHMRC拨款1028552(特伦斯·g·约翰)。亚历山大·l·威尔丁从莫纳什大学举行的博士奖学金。这项工作是支持的维多利亚时代的政府运营和基础设施支持计划。
补充材料
补充材料文件包含以下:补充方法。补充表1:药物IC50制表。补充表2:药物组合制表。补充图S1:药物稀释系列测定IC50: 402毫升和1765毫升。补充图S2: Axitinib和盐霉素组合试验。补充图S3: Axitinib和4 egi-1组合试验。补充图S4:盐霉素和4 egi-1组合试验。补充图S5:盐霉素和abt - 737组合试验。补充图S6:试验的组合盐霉素/达沙替尼和盐霉素/阿霉素对1765毫升。补充图S7:试验的组合ABT-737/4EGI-1和abt - 737 / axitinib 1765毫升。 Supplementary Figure S8: Trial of combinations of doxorubicin/4EGI-1 and doxorubicin/axitinib against MLS 1765. Supplementary Figure S9: Molecular characterization of MLS 402 cells. Supplementary Figure S10: Hematoxylin and eosin microphotographs of MLS 1765 xenograft tissue. Supplementary Figure S11: Drug dilution series to determine IC50: SW 872.