文摘
数量有限的报道研究小分子核糖核酸的作用在骨肉瘤。在这项研究中,我们进行了骨肉瘤细胞系的microrna的表达分析,肿瘤样本,正常的人类成骨细胞。22个差异表达小分子核糖核酸被确定使用高通量实时PCR分析,和4 (mir - 135 b, mir - 150, mir - 542 - 5 - p,和mir - 652)被证实和验证在不同组的肿瘤。mir - 135 b和mir - 150之前已被证明是重要的癌症。我们假设失调差异表达的小分子核糖核酸可能导致肿瘤发生。他们也可能代表分子生物标记或在骨肉瘤药物开发的目标。
1。介绍
骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤在儿童和青少年时期。尽管许多肿瘤最初回应化疗,病人转移性疾病和/或复发疾病继续有极其不良的生存状况1]。更好的理解骨肉瘤生物学需要进一步优化治疗策略,生物标志物识别、和新化疗药物的开发。先前的研究已经表明不同基因改变在骨肉瘤细胞,包括结构异常、染色体的收益和/或损失,以及肿瘤抑制基因的突变(2]。表观遗传修饰基因组DNA甲基化和改变chromatin-associated蛋白质等也被卷入骨肉瘤致癌作用[3,4]。然而,非编码rna的作用,尤其是小分子核糖核酸,骨肉瘤的发生和发展中有待阐明。
小分子核糖核酸(microrna)是小非编码rna,可以调节基因的表达通过阻断mRNA翻译和/或影响细胞内信使rna稳定(5]。在过去的几年里,越来越多的证据表明,microrna是关键细胞监管机构;一个microrna的可以影响到数以百计的目标蛋白质编码基因的表达(6]。microrna的表达特异表达已经证明在许多人类疾病,包括癌症。microrna的表达的差别,和/或对这些基因在癌症表明microrna能函数作为经典的肿瘤抑制基因或致癌基因7,8]。进一步,microrna与肿瘤转移的发展(9]。虽然以前的出版物已经探索microrna的作用在许多成人和小儿癌症,在骨肉瘤的认识有限的作用。
研究骨肉瘤细胞系和原发肿瘤样本显示miR-34和p53之间的交互;肿瘤样本显示减少miR-34表达和抑制p53-mediated细胞周期阻滞和细胞凋亡10]。在另一项研究中使用骨肉瘤细胞在异种移植物模型,增加了mir - 140表达与药物抗性(11]。同一组最近报道,mir - 215在骨肉瘤细胞赋予了甲氨蝶呤药物抗性在体外通过抑制细胞cycle-regulated核和中心体蛋白(12]。在一项研究中使用8配对肿瘤和正常组织样本以及骨肉瘤细胞系mg - 63,紫嫣等人证明upregulation miR-21(著名oncomiR其他肿瘤类型)在骨肉瘤13]。击倒的miR-21细胞系导致减少细胞入侵和迁移13]。另一组确定的proapoptotic函数mir - 143 bcl - 2表达的差别通过对这些骨肉瘤细胞系和原发肿瘤样本(14]。
本研究的目的是确定差异表达microrna在骨肉瘤细胞系和肿瘤样本。我们筛选762成熟microrna在2骨肉瘤细胞系和4 formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)骨肉瘤样本。我们已经确认选定的microrna的表达用实时定量PCR (RT Q-PCR)在最初的样本和验证研究结果在3额外FFPE肿瘤。这些发现提供了一些见解的microrna在骨肉瘤中的作用和可能是新生物标志物识别的重要性和未来的药物设计。
2。材料和方法
2.1。患者样本
机构审查委员会批准后儿童纪念医院(IRB),总共10个主要nondecalcified FFPE块获得儿科患者的骨肉瘤治疗我们的机构在1997年和2010年之间。在所有情况下,最后病理诊断为传统的成骨细胞的骨肉瘤患者没有以前的治疗与化疗。代表从每个肿瘤块H & E幻灯片是和5 - 20 -准备的μ米厚的部分被削减,供进一步分析。
2.2。细胞培养
两个人类骨肉瘤细胞lines-HOS(写明ATCC没有。crl - 1543)和143 b(写明ATCC没有。crl - 8303) -来自美国类型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞培养和维持在37°C公司5%2鹰的最低基本培养基中含10% heat-inactivated胎牛血清和5%青霉素和链霉素(表达载体,加州卡尔斯巴德)。一个正常的人类成骨细胞细胞系,滚刀(c - 12720),获得了和生长在成骨细胞生长培养基(PromoCell,海德堡,德国)。为了减少人体组织的区别和控制成骨细胞,滚刀细胞颗粒状,福尔马林固定,嵌入在石蜡RNA提取如前所述(之前http://web.ncifcrf.gov/rtp/lasp/phl/immunohistochemistry.asp)。
2.3。RNA提取
RNA净化FFPE样本进行使用RecoverAll总核酸分离系统(Ambion、奥斯汀、特克斯)根据制造商的指示。在所有提供的部分病理部门以及嵌入式滚刀细胞,肿瘤区域仔细macrodissected使用手术刀和转移到1.5毫升离心管。石蜡100%二甲苯中移除50°C为3分钟。管离心机,二甲苯是丢弃,颗粒与100%乙醇洗两次空气干燥。的颗粒被蛋白酶消化50°C 15分钟,在80°C和15分钟和RNA与过滤净化墨盒。细胞系的总RNA提取(累积量和143 b)使用试剂盒(英杰公司)根据制造商的指示。RNA质量和数量决定使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop,威尔明顿▽)。的10个样品,7有高质量的RNA和用于进一步分析。四个样本用于最初的microrna测定实验,和3被用于验证的结果。
2.4。microrna的表达细胞系和初始肿瘤样本的分析
TaqMan microrna的分析被用来量化的水平762成熟microrna在骨肉瘤细胞株,正常的人类成骨细胞和4肿瘤样本如前所述[15,16]。对所有的细胞系实验进行了复制。每个逆转录酶反应(RT)包含纯化总RNA和TaqMan MicroRNA Megaplex逆转录工具包(应用生物系统公司,加州福斯特城)准备根据制造商的指示。30分钟的反应是孵化16°C,在42°C, 30分钟和5分钟85°C。由此产生的cDNA当时preamplified使用Megaplex前置放大器引物根据制造商的指示。实时PCR反应为每个microrna在900年进行µL反应混合物,包括9µL稀释和preamplified RT产品,450年µL 2 x TaqMan普遍PCR大师混合,没有AmpErase)(应用生物系统公司),和441 -µ无核酸酶的水。反应是在孵化应用生物系统公司在384 - 7900 ht快速实时PCR系统低密度阵列(TLDAs)为94.5°C 10分钟,其次是40周期在97°C 30年代和60°C为1分钟。
2.5。单个microrna的确认和验证
在最初的筛选之后,4差异表达microrna被选中,总RNA纯化肿瘤细胞系和最初的4样品,用于执行的microrna化验。每个逆转录酶反应(RT)包含总RNA和TaqMan个人微RNA逆转录引物(应用生物系统公司),准备根据制造商的指示。节中描述的反应进行2。4。
实时PCR反应为每个单独的microrna在20 -进行µL反应混合物,包括1.33 -µL(稀释RT产品,1 -µL 20 c TaqMan个人microRNA化验,10-uL 2 x TaqMan普遍PCR大师混合,没有AmpErase)(应用生物系统公司)和7.67 -µ无核酸酶的水。反应是孵化一式三份的应用生物系统公司7900年ht快速实时PCR系统在96 -孔板在上面描述的PCR条件。选中的microrna的表达水平被验证在另外三个肿瘤样本的总RNA,以前从未在这里描述使用相同的方法进行测试。
2.6。统计分析
microrna测定实验数据分析了使用实时StatMiner软件(版本4.0,Integromics)。microrna的探针都是中间的负Ct值集中的样本,然后对内生控制哺乳动物U6规范化。表达式值受到层次聚类的皮尔森相关使用Multiexperiment Viewer(4.5.1版本,http://www.tm4.org/mev/)。个人分析确认和验证,学生的t测试是用来评估肿瘤之间的相对microrna的表达之间的统计学意义和控制。对所有分析,双尾的价值被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。微分microrna的表达在骨肉瘤
实时qPCR是用来评估的相对表达762年成熟的microrna的表达水平在人类肿瘤和2 4骨肉瘤细胞系(累积量和143 b)相比,正常的人类成骨细胞细胞系(滚刀)。非监督聚类是使用相对执行所有样品和microrna的表达值调查。根据表达式的值,每组(正常的成骨细胞,人类肿瘤,骨肉瘤细胞株)聚集在一起,从而确认类似的microrna的表达谱(图1)。此外,肿瘤样本和骨肉瘤细胞株集群独立于正常的人类成骨细胞。
(一)
(b)
3.2。测试组的两两比较
实时StatMiner软件是用来比较之间的表达谱人类肿瘤和正常的人类成骨细胞。这一分析显示22显著差异表达microrna ()(表1)。两个额外的比较。成骨细胞骨肉瘤细胞系比较正常,5个人microrna相匹配的原始列表中被确认。最后,骨肉瘤细胞系和人类肿瘤比较,和14岁的22日之前确定microrna表现出显著的微分表达式。
3.3。选择候选人microrna的验证
最初的22个microrna标识,选择4个人确认(mir - 135 b, mir - 150, mir - 542 - 5 - p和mir - 652)基于他们在人类肿瘤的比较和差异表达成骨细胞骨肉瘤细胞株相比。此外,这些候选人的第3 (mir - 135 b, mir - 542 - 5 - p,和mir - 652)没有表达在肿瘤样本和骨肉瘤细胞株,最大限度地减少的可能性表达差异是由于永生化细胞系和异构的肿瘤样本之间的差异。尽管mir - 150验证表达式的差异比较肿瘤细胞系,这位候选人microrna的选择对于验证给定的表达式的振幅差异观察成骨细胞肿瘤相比时。
3.4。确认候选人microrna在原始样本
microrna化验进行总RNA从最初的肿瘤样本以确定mir - 135 b的表达水平,mir - 150, mir - 452 - 5 - p和mir - 652相比,正常的人类成骨细胞。所有4 microrna在肿瘤与正常相比成骨细胞如表所示2。
3.5。验证候选人microrna在测试样本
另外三个肿瘤样本的总RNA,以前并不用于microrna化验分析microrna的候选人。4探针,microrna是过表达相比正常的人类成骨细胞在一个类似的模式的第一个4肿瘤样本。的表达水平7样品如图2。
4所示。讨论
的目标识别microrna在骨肉瘤肿瘤发生的重要,我们执行microrna的表达分析两个骨肉瘤细胞行以及4 FFPE人类肿瘤样本使用TLDA数组。我们异形762 microrna并确定差异表达在骨肉瘤(表221)。此外,我们已确认和验证4候选人microrna在最初的肿瘤样本,和在一个测试组3额外的肿瘤样本。据我们所知,我们的研究是第一次执行TaqMan数组在骨肉瘤microrna测定样品使用FFPE样本。
在我们的研究中,我们能够可靠地提取microrna FFPE人类骨肉瘤的组织。几组已经讨论了使用的实用性和可靠性FFPE样品微rna表达分析(17,18]。基础研究在骨肉瘤的障碍之一是,大多数肿瘤组织脱钙之前组织学分析;因此,核酸是退化。然而,我们能够成功地执行分析nondecalcified从初级活检获得的肿瘤块。
在我们的研究中,所使用的肿瘤样本中mir - 135 b的大鹏发现显著的过表达在人类骨肉瘤成骨细胞相比正常。最近,表达分析在结肠癌和前列腺癌的研究显示一致的超表达mir - 135 b在受影响的组织(19,20.]。此外,最近的一项研究表明,低水平的mir - 135 b是重要的造骨细胞的正常发育和矿化。mir - 135 b的过度导致异常矿化,和无限制的成体干细胞的分化21]。我们假设高水平的mir - 135 b可能抑制正常干细胞向成骨细胞的分化,这或许可以解释骨肉瘤细胞的异常生长。然而,进一步的分析探索mir - 135 b的目标是必要的。
其他组已经表明,mir - 150的表达特定microrna的造血,是重要的B和T淋巴细胞的分化正常的造血作用[22]。mir - 150的异常表达在肿瘤由吴最近探讨et al .,他们高水平的报道mir - 150在胃癌组织。这种分析证实,mir - 150的超表达能够促进胃癌扩散在体外和在活的有机体内(23]。在我们的研究中,我们发现了一个近50倍mir - 150的超表达成骨细胞骨肉瘤样相比正常。重要的是,proapoptotic EGR2 P2X7受体(早期生长反应2)和已确认的目标mir - 150 (23,24]。P2X7受体参与信号转导和已经研究的很透彻了细胞凋亡的启动子在成骨细胞和破骨细胞(25]。基于这些分析和结果呈现在这里,我们假设upregulation mir - 150 P2X7受体表达下调可能导致骨肉瘤细胞不受控制的发展。
过表达和确认的两个小分子核糖核酸在这项研究中,mir - 542 - 5 - p和mir - 652,只有少数文献报道。最近,一组报道协会mir - 542 - 5 - p在有利的组织学,过度MYCN nonamplified神经母细胞瘤样本(26,27]。没有数据可在文献中关于mir - 652和癌症迄今为止;然而,生物信息学预测表明,这种microrna的有800多个潜在的靶基因。我们研究的结果对于mir - 542 - 4 p和mir - 652在骨肉瘤,需要进一步调查。
我们的microrna测定实验结果显示22差异表达microrna。考虑到本研究的范围,验证只做4个人的microrna。然而,许多其他的发现microrna在骨肉瘤肿瘤发生可能是重要的。mir - 210就是这样一个例子,它被发现显著升高我们的肿瘤样本,它已经在其他癌症研究。mir - 210是一个关键球员缺氧反应,它被发现是调节在所有细胞类型测试到目前为止在缺氧条件下(28]。最近,mir - 210被发现是一个积极监管机构通过抑制成骨细胞的分化AcvR1b(激活素受体1型b) (29日]。鉴于本研究的发现,mir - 210的作用在骨肉瘤应该进一步调查。
我们的研究结果与最近发表的一篇论文,分享一些相似之处市长等人的microrna的表达模式与成骨细胞冷冻骨肉瘤肿瘤标本进行比较。此外,基因表达数据在同一标本也用来探索microrna的放松管制的机制在骨肉瘤30.]。在别人,作者报道mir - 126的过度表达,mir - 142 - 3 - p和mir - 451也是我们的数据(表所示1)。在某些情况下,miRNA-overexpression microrna的编码序列与增长地区已知的染色体改变骨肉瘤。此外,一些underexpressed microrna也报道(30.]。结合我们的数据,这表明一个关键角色的microrna的表达,没有DNA复制改变骨肉瘤。
我们的研究有一些局限性,值得讨论。患者样本的数量只有7低10个样本含有RNA适合分析。剩下的3个样品上有大量的坏死代表)部分,这可能解释了RNA质量差。确认这些发现在更大的肿瘤样本的重要性。我们也承认,正常控制选择本研究正常成人成骨细胞细胞系。虽然有些microrna的差异可能是固有的细胞系和人体组织之间的差异,我们试图最小化通过同时使用“行肿瘤细胞以及组织样本选择的候选microrna确认。未来的研究中,儿童正常骨的成骨细胞和/或部分丰富了成骨细胞应考虑作为正常对照组。
总之,我们的研究是第一个使用骨肉瘤样FFPE执行microrna的表达分析TaqMan实时PCR在大规模和比较他们正常的人类成骨细胞。使用这种策略,我们能够识别22差异表达小分子核糖核酸,和4 (mir - 135 b, mir - 150, mir - 542 - 5 - p和mir - 652)被选为个人确认。超表达所选择的候选人microrna进一步验证3额外肿瘤FFPE样本。在我们的样本中,mir - 135 b明显过表达,它已经被证明有一个角色在正常成骨细胞的分化;高水平的mir - 135 b导致异常矿化。此外,mir - 150可能导致骨肉瘤的抑制肿瘤发生proapoptotic见其他癌症的基因。最后,其他几个差异表达小分子核糖核酸被发现在我们的研究中(例如,mir - 210)和保证在骨肉瘤肿瘤发生进一步评估。
利益冲突
作者没有披露的金融支持或可能构成利益冲突的关系。
确认
作者感谢迈克尔博士Kluppel(儿童纪念研究中心)提供人类成骨细胞细胞系为她和丽莎Setlak援助的准备部分FFPE组织块。这个项目是由科尔曼基金会的慷慨资助r·r·卢拉(芝加哥,病了),孩子们的研究基金会(克拉伦登丘陵,生病)和Roshni Arora的家庭(芝加哥,生病)。f·f·科斯塔得到了玛弗McNicholas纪念基金会和雅芳基金会(批准号01-2009-037)。研究赞助商没有参与研究设计、数据收集、或纸准备。