文摘
的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγ)是一个中央中介细胞脂质代谢和免疫细胞在炎症反应。这是由其作为促进转录因子以及DNA-independent蛋白质交互合作伙伴。我们解决如何在胞液和细胞氧化还原环境的核心脂多糖(LPS) /干扰素-γ——(干扰素γ-)和interleukin-4 (IL4)极化巨噬细胞(MΦ)启动PPAR的转译后的修改γ,进而改变其蛋白质功能。使用redox-sensitive GFP2 (roGFP2),我们验证了氧化和减少条件后古典和替代激活MΦ,而PPAR的氧化还原状态γ通过质谱分析确定。半胱氨酸残基位于锌指区域(氨基酸片段AA 90 - 115, 116 - 130 AA,和美航160 - 167)的PPARγ高度氧化,伴随着82年丝氨酸的磷酸化反应有限合伙人/干扰素吗γ,而IL4-stimulation激起了小82磷酸化丝氨酸和半胱氨酸氧化少,有利于还原环境。这些半胱氨酸突变,丙氨酸模拟一种氧化还原改性PPAR下降γ端依赖报告基因transactivation支持PPAR的功能性转变γ与米Φ表现型。这些数据表明不同调节PPAR的机制γ基于M的氧化还原状态的函数Φ。
1。介绍
活性氧(ROS)履行重要的中介功能不同的细胞信号通路调节方面的炎症、细胞增殖、分化、凋亡,铁内稳态,防御机制(1- - - - - -3]。此外,ROS触发redox-based转译后的修改(天车)改变蛋白质折叠和稳定性。这些化学反应的效率取决于不同的标准包括氧化剂和氨基酸之间的速率常数,残渣易访问性,其pKa,此外,相邻的氨基酸的性质(4]。redox-based修改的一个最重要的目标是redox-sensitive硫醇的半胱氨酸5]。半胱氨酸常常是局部的功能蛋白质域的核心单元。因此,硫醇的形状与其他半胱氨酸蛋白质构象形成二硫桥或将锌等金属离子。此外,亲核硫醇盐可以催化地活跃,半胱氨酸残基的连接与其他功能残留确保特殊蛋白质的性质。因此,改变它们的化学行为的彻底改变整个蛋白质的功能。有许多蛋白质,含有多个功能的蛋白质域包括不同的半胱氨酸。一个例子是过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ)。
PPARγ是一个广泛表达,ligand-dependent转录因子。这是一个主要玩家在调节脂质代谢的细胞免疫细胞反应和控制(6- - - - - -8]。作为PPAR家族的一员,蛋白质具有典型的蛋白质域结构。从n端,PPARs包含ligand-independent反式激活因子域(AF1), dna结合域(DBD),铰链域(HD),和一个二聚作用,分别配体结合域(小黑裙)ligand-dependent反式激活因子函数(AF2) [9,10]。这个域结构介导PPAR的dna和蛋白质的相互作用γ。此外,AF-domains导致绑定辅活化因子和抑制因子配体结合的效率。PPARγ包含十个半胱氨酸残基。其中8个位于DBD形成锌指图案,一个是定位在未知函数的高清,和一个驻留在小黑裙,在配体结合11]。考虑PPAR的结构γ,它调节基因转录时绑定到DNA或清除转录因子,辅阻遏物或辅活化因子,从绑定到目标基因的蛋白质相互作用。具体地说,它形成了一个dna结合异质二聚体和类维生素a X受体(RXR)和员工不同的辅活化因子启动转录(12]。此外,PPARγ直接与DNA-bound辅阻遏物引起的稳定和transrepression转录(8]。基于这些不同模式的行动,PPARγ影响不同的细胞在炎症反应也。
巨噬细胞(MΦ),第一个开始免疫细胞炎症和先天免疫反应,表达PPARγ。其为病原体识别的分子模式如脂多糖(LPS)或炎性细胞因子如干扰素γ(干扰素γ),米Φ促炎的极化,糖酵解巨噬细胞表型M(有限合伙人/干扰素γ)激活不同的代谢途径13,14]。细胞产生大量的活性氧作为有毒代理人对主机入侵病原体激活的NADPH氧化酶2复杂(NOX2) [15,16]。相比之下,解决炎症、伤口修复和恢复体内平衡是必要的。因此,抗炎的细胞被免疫系统释放抗炎介质像白介素4 (IL4) [17]。这个细胞因子极化MΦ成米(IL4)表型允许通过有氧新陈代谢的最佳能量回收(18]。因此,这些细胞被禁用产生高浓度的活性氧防御机制和使用ROS作为信号分子在代谢途径19]。因此,两个不同的MΦ表型M(有限合伙人/干扰素γ)和M (IL4)特性不同的氧化还原需求。
因此,我们想确定PPAR的转译后的修改γ基于细胞的细胞质和细胞核的氧化还原环境有限合伙人/干扰素γ和IL4偏振米Φ。
2。材料和方法
2.1。化学试剂
细胞培养基从Gibco购买(美国卡尔斯巴德)及其补充提供的PAA实验室GmbH (Colbe,德国)。原核介质和补品被命令从Clontech(豆类、日本)和罗斯GmbH(德国卡尔斯鲁厄)。金诺芬(AF)、有限合伙人tetradecanoylphorbol醋酸(TPA)、过氧化氢(H2O2)、二甲亚砜(DMSO)和PPARγ罗格列酮配体和2-chloro-5-nitrobenzanilide (GW9662)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,美国)。干扰素γ被命令从BioVision Inc .(美国苗必达)和IL4 Peprotech(德国汉堡)。酶是来自新英格兰获得生物学实验室(伊普斯维奇,英国)和聚合酶从安捷伦科技德国GmbH (Boblingen、德国)和Clontech(豆类、日本)。进一步的化学物质,如果不是表示,否则,被命令从AppliChem GmbH(达姆施塔特,德国),默克公司(达姆施塔特,德国),Promega GmbH德国曼海姆,罗氏诊断(瑞士巴塞尔),和Sigma-Aldrich。
2.2。细胞培养
小鼠J774A。1 (20.)米Φ细胞培养在RPMI1640和人类HEK293T [21)细胞在DMEM高葡萄糖在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。媒体都是补充与100 U / ml青霉素,100μg / ml链霉素,10% ( )heat-inactivated胎牛血清。细胞被播种前24小时治疗新鲜培养基。
米Φ由有限合伙人(极化1μg / ml)和干扰素γ(10 U /毫升)M(有限合伙人/干扰素γ)或IL4 (10 ng / ml) M (IL4) 24 h。此外,细胞被TPA刺激(1μ米,30分钟),AF (3μ米、40分钟)、H2O2(1μ打光最后一毫米,15分钟),或德勤(100μ米,5分钟)诱导氧化还原的压力。治疗由PPARγ罗格列酮配体(1μM)和GW9662 (10μ米)进行24 h。
N- - - - - -ethylmaleimide (NEM)半胱氨酸标记细胞总蛋白质含量,培养细胞在NEM孵化(RPMI介质20 mM) 10分钟在冰上,洗3次在PBS细胞收获,并在液态氮冷冻。细胞颗粒被储存在-80°C,直到进一步的处理。
2.3。克隆表达向量
表达向量Clover-PPAR稳定超表达的蛋白质γ、roGFP2 Grx1-roGFP2被替换EGFP pHR生成SIN-cPPT-SE [22)通过适当的编码序列由于在融合®(Clontech、豆类、日本)复合如前所述[23]。总之,原生质pcDNA3-Clover [24),pDsRed-Monomer-C1-hPPARγ1 (25],pQE-60_Grx1-roGFP2 [26)被用作模板。N - c端HA-tagged hPPARγ同样的方法产生的,细长的IRES序列来自pLVX-TRE3G-mCherry (Clontech),和一个额外Clover-sequence生成hPPAR吗γ-IRES-Clover表达式构造。因此,hPPARγ是融合哈编码序列5 - - - - - -ATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT3在n端和5 - - - - - -CCCCCTCCGCCCCCACCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTGA-3在糖基。半胱氨酸hPPAR丙氨酸突变体γ是由诱变的TGX GCX密码子使用PfuII聚合酶(安捷伦科技德国GmbH, Boblingen,德国)。相同的诱变方法被用于生成丝氨酸丙氨酸(TCT GCT)和丝氨酸谷氨酸hPPAR呕吐(TCT)突变体γ。
2.4。细胞转染、慢病毒转导和排序
生产稳定overexpressing细胞系,用慢病毒颗粒是由JetPRIME®(PEQLAB Biotechnologie GmbH,埃朗根,德国)与慢病毒载体转染的HEK293T psPAX2 (Addgene # 12260), pMD2。G (Addgene # 12259)和克隆载体如前所述23]。转导J774A。1cells were sorted for green positive cells using BD FACSAria™ III cell sorter (BD Biosciences, Heidelberg, Germany).
2.5。流式细胞仪测量
流式细胞仪测量使用双相障碍进行了流式细胞仪LSRFortessa™II流式细胞分析仪(BD生物科学、海德堡、德国)耦合的流式细胞仪天后™6.1.3软件。荧光的细胞被发现和评估使用FlowJo V10软件(美国亚什兰FlowJo)。M的荧光Φ表达roGFP2,其融合结构Grx1-roGFP2,roGFP2-PPARγ被监控的λ前女友405 nm和488 nm, 405/488 nm的定量计算的相对荧光强度(RFI)。为分析,氧化还原刺激MΦ洗了PBS、收获和分析在PBS。为了确保最好的可比性的不同浓度的细胞治疗H2O2,米Φ收获前治疗,分为subprobes,接种1μ米到10毫米H2O2在PBS冰并行。识别直接氧化还原修改,以应对可能的氧化压力,未经处理的细胞荧光,清洗和resuspendend在PBS,刺激2 - 5分钟前进行了分析。然后,氧化还原刺激被加入到管,彻底但轻轻混合,和荧光测定,直到一个常数值。
2.6。PPARγ端依赖Transactivation化验
PPARγ端依赖transactivation化验cotransfection后进行Clover-hPPARγ编码向量一起萤火虫和Renilla荧光素酶基因包含向量p (AOX)3-TK-Luc [27,28)和pRL-CMV (Promega GmbH)如前所述23]。Clover-hPPAR并行γ野生型构造,也半胱氨酸关于hPPAR丙氨酸突变体γ(C112A C109A C126A、C129A C146A, C150A, C160A, C163A, C168A,和C284A)使用。Transactivation测量使用96孔板格式密特拉神LB940多模读者(坏Wildbad Berthold技术,德国)。相对发光单元(RLU)计算双荧光素酶的方法,在萤火虫荧光Renilla规范化。向量(PPAR转染效率γwt和突变体)规范化Renilla荧光。
2.7。亚细胞的胞质及核提取物的分离
细胞总蛋白提取,细胞溶解在缓冲(pH值7.4)包含6.65尿素,10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液10% ( )甘油和1% ( )十二烷基硫酸钠(SDS),辅以0.02 U /μl Benzonase®核酸酶(默克公司,达姆施塔特,德国)在室温下1分钟。
分离细胞胞质及核蛋白质分数,由胞质细胞溶解提取(CE)缓冲区(10毫米玫瑰,10毫米氯化钾,0.1毫米EDTA, 0.3% ( )NP-40, pH值7.9)5分钟在4°C和多种混合时间使用5 x缓冲体积细胞的颗粒体积。离心(845克,5分钟后,4°C),上层为胞质蛋白质分数。沉积物与CE洗2次缓冲区没有NP-40然后处理核提取缓冲(20毫米玫瑰400毫米生理盐水1毫米EDTA, 25% ( )甘油)10分钟在4°C使用1 x缓冲体积的泥沙颗粒体积。离心(18000克,5分钟后,4°C),上层清液用作核蛋白质分数。所有的缓冲区包含1 x蛋白酶抑制剂(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)和1μM phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)以防止蛋白降解。
2.8。免疫沉淀反应
J774A冻丸。1 (细胞)制造出N - c端HA-tagged hPPARγ细胞溶解在裂解缓冲(500毫米氯化钠,1% ( )NP-40, 50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.5,5毫米EDTA, 0.5% ( )钠脱氧胆酸盐,0.1% ( )SDS),补充1 x蛋白酶抑制剂(罗氏诊断)和PMSF (1μ米),15分钟旋转条件下在4°C。溶菌产物是另外用数字声波降解器使用布兰森®(布兰森超声学、Eemnes、荷兰)10%振幅交替0.9秒脉冲和0.6秒打破总共10秒。10分钟后离心(21000克,4°C),包含蛋白质的上层清液加载在以前洗HA-beads(罗氏诊断)的浓度4每30毫克/毫升蛋白质μl珠泥浆。混合物在4°C孵化隔夜旋转,并进一步沉淀进行描述的制造商。
coimmunoprecipitation设置,细胞被立即处理收获后,细胞溶解在150毫米氯化钠包含溶解缓冲区,而不是用。
2.9。免疫印迹
蛋白质总浓度、胞质及核蛋白质提取物被洛瑞测量试验设备(Bio-Rad实验室GmbH,慕尼黑,德国)。100年μ克总蛋白提取用于标准12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - page) 30 mA和200 V,而只有50μ克亚细胞提取利用。因此,溶解产物与SDS补充样品缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液2% ( )甘油,2% ( )β巯基乙醇,1.6% ( )SDS, 0.004% ( )美国赛瓦蓝色的g - 250, pH值为6.8),煮5分钟在95°C。sds - page和1.5 h吸水后的蛋白质在Amersham™Protran™硝化纤维膜在1.8 mA /厘米2和25 V,膜与5%(孵化 )牛奶溶解在TBS(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液140毫米氯化钠,pH值7.2)在室温下1 h。免疫标记,具体主要GFP抗体(1:1000年,ab1218 Abcam plc剑桥,英国),HA(1: 1000、2367、细胞信号技术,丹佛,美国),和PPARγD69(1: 1000、2430、细胞信号技术,丹佛,美国)被用于5% ( )牛奶/ TBS 3 h在室温下或在4°C 16-48 h。另外β肌动蛋白anti-mouse(1: 10000年,A2228 Sigma-Aldrich),β肌动蛋白anti-rabbit(1: 5000年,A5441 Sigma-Aldrich),β微管蛋白(1:5000年,t - 4026, Sigma-Aldrich),和核纤层蛋白A / C e 1 (sc - 376248 1: 1000年,圣克鲁斯,达拉斯,美国)被用作蛋白质加载控制。三次洗涤后TBS-T (TBS补充0.05% ( )Tween-20),膜与IRDye孵化1.5 h®680或800 cw驴anti-mouse或驴anti-rabbit(1: 10000年,925 - 68072,925 - 32212,925 - 68073,925 - 32213,LI-COR GmbH,坏的小礼帽,德国)作为二级抗体,分别。免疫学检测进行了使用一个奥德赛®红外成像系统(LI-COR GmbH)。墨迹图分析图像工作室数字版本5.0 (LI-COR GmbH)。
2.10。LC / MS分析
免疫沉淀反应HA-tagged hPPARγ通过SDS - page, Coomassie SDS凝胶的染色和凝胶块的切割出大约的尺寸 。这种凝胶块在60%(使退色 )甲醇,50 mM ammoniumbicarbonate (ABC),洗在50 mM ABC (29日]。在1毫米德勤蛋白质减少,50 mM ABC 1 h在56°C和烷基化在5毫米D5-NEM 45分钟。样本消化16 h和LysC(测序年级,Promega GmbH)在50 mM ABC 37°C,蛋白酶马克斯(Promega GmbH) 0.01%, CaCl 1毫米2。肽在30%(筛选了 )乙腈和3% ( )甲酸,离心机进新鲜96板,干燥速度休假,解决1% ( )乙腈和0.5% ( )甲酸。
液相色谱/质谱法进行热科学™问Exactive +配备了一个超高液相色谱单元(热科学Dionex终极3000)和一个Nanospray Flex离子源(热费希尔科学GmbH, Dreieich,德国)。肽是加载在C18反相precolumn(热费希尔科学GmbH)其次是分离为2.4μm Reprosil C18树脂(Ammerbuch Maisch高效液相色谱GmbH博士、德国)内部包装picotip发射器(直径100μ米,15厘米从4%(新目标)使用一个梯度 )乙腈,0.1% ( )甲酸(40% )洗脱液B (99% ( )乙腈,0.1% ( )甲酸)30分钟和第二个梯度60% ( )B 5分钟流量400 nl /分钟。视数据采集记录的数据。完整的扫描范围是300 - 2000 m / z女士分辨率为70000,和一个自动增益控制的价值总离子计数最大离子注入160毫秒的时间。只有更高的带电离子(2 +)被选为MS / MS扫描分辨率为17500,2 m / z的一个隔离窗,一个自动增益控制的值设置为E5离子最大离子注入150毫秒的时间。MS1数据获得的配置模式。
女士Peaks7进行分析的数据(生物信息学Solutions Inc .)。蛋白质被确定使用鼠标参考蛋白质组数据库UniProtKB 52538条目,在2/2018,与人类hPPAR补充γ错误发现率为1%。酶的特异性将LysC与一个未指明的结束。NEM(+ 125.05),分别D5-NEM(+ 130.08)在半胱氨酸,磷酸化(+ 79.97)丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸脱酰氨基作用(+ 0.98)在天冬酰胺,谷氨酰胺和甲硫氨酸氧化(+ 15.99)变量的修改。第二个数据库搜索应用于确定二硫未配对碎片(-2.02)一起蛋氨酸(+ 15.99)和氧化脱氨基(+ 0.98)天冬酰胺,谷氨酰胺频繁修改。
2.11。统计数据
每个实验进行了至少3次。所有生成的相同的特征显示的数据 (SD)。统计数据进行了使用一个,或双向方差分析修改Bonferroni多重比较检验,分别未配对,配对的学生的 - - - - - -测试。分析适应审判的选择要求。显著差异设置如下: ; ; 。
3所示。结果
3.1。细胞氧化还原环境的M(有限合伙人/干扰素γ)- M和M (IL4)极化Φ不同诱导Redox-Based roGFP2天车
使用细胞redox-sensitive的超表达绿色荧光蛋白2 (roGFP2),我们监控细胞氧化还原环境的变化不同极化J774A。1米Φ。Redox-based天车的roGFP2改变了荧光团的光谱性质,可以计算相对荧光强度(RFI)的比例405/488 nm(图1)。RFI比率的降低细胞治疗后相比,如果控制细胞被解释为表明减少条件下,德勤治疗后观察到的(补充图1)。氧化条件所示增加405/488 nm,发现针对H2O2刺激。在第一次30分钟的M(有限合伙人/干扰素γ)和M (IL4)偏振,我们不能检测roGFP2细胞的氧化还原环境中显著差异(图1左面板)。这些初始阶段之后,M(有限合伙人/干扰素γ)极化的特征是一个重要的,指数增加细胞的氧化条件表示的RFI 1.02(±0.02)后1 h, 1.04 (±0.01) 2 h, 3.26(±0.3)在48 h。尽管RFI M (IL4)巨噬细胞比率达到1.01 (±0.02)1 h,相比他们呆在这个级别24 h ( )。仅48小时后,一个小,但并不显著增加到1.30(±0.14)可被检测到。在平行,我们检查极化标记基因的mRNA表达等伊诺M(有限合伙人/干扰素γ),__arg1M (IL4)(补充数据2和2 b)。总之,这些数据表明redox-sensitive GFP2适用于识别和显示氧化还原变化Φ,允许歧视两米Φ表型M(有限合伙人/干扰素γ)和M (IL4)。在这方面,经典激活有限合伙人/干扰素γ的米Φ导致更多的氧化还原环境。相反,IL4激活指向降低条件。
3.2。极化的Φ影响核本地化roGFP2-PPAR的氧化还原状态γ
根据roGFP2数据,我们很感兴趣,这些不同的氧化还原条件是否在MΦ极化可能影响PPARγ。PPAR的考虑γ是核受体,通过改变靶基因的表达结合在基因的启动子区域,我们首先分析是否ROS在米Φ无所不在地存在胞质或限制。因此,J774A。1米Φ并有一个向量编码roGFP2耦合hPPARγ。我们假设这个设置使生成的混合蛋白质本地化内生mPPAR类似γ。经过验证的功能表达质粒(数据未显示),roGFP2-hPPAR的细胞定位γ是由胞质及核分离。符合我们的假设,细胞转导roGFP2-hPPARγ构造(图2(一个)去年lane),显示核融合蛋白的定位,只有。相比之下,roGFP2位于胞质(图2(一个))。使用J774A。1米Φ表达roGFP2-hPPARγ,我们下决定是否M(有限合伙人/干扰素γ)或米(IL4)可能改变蛋白质的氧化还原状态位于细胞核。有趣的是,最多降低条件确认2 h后治疗的两个偏振设置。具体来说,M(有限合伙人/干扰素γ)刺激值减少到0.94(±0.04)和M (IL4)到0.87 (±0.02)。有限合伙人/干扰素γroGFP2-hPPAR的相对荧光强度显著增加γ细胞从4 h ( )在控制细胞和IL4分化细胞(图2 (b))。48小时后,RFI比率增加到3.33 (±0.36)。在平行IL4-treated roGFP2-hPPARγ细胞RFI比率为0.87(±0.03)后4 h和略增加到1.34(±0.28)后48 h。起始的极化是验证通过分析标记基因的mRNA表达,也就是说,伊诺M(有限合伙人/干扰素γ),__arg1M (IL4)(补充数据2摄氏度和二维)。
(一)
(b)
3.3。半胱氨酸的PPARγ的目标是Redox-Based天车
在成功证实氧化应激天车在胞质及核位于roGFP2(补充图3),我们决定是否hPPAR半胱氨酸γ也修改。作为第一步,我们对待HA-tagged hPPARγoverexpressing J774A。1cells under polarizing conditions, i.e., redox stress-inducing agents, and performed LC/MS analysis of immunoprecipitated hPPARγ。H2O2被用作直接活性氧的来源。金诺芬是硫氧还蛋白还原酶的抑制剂,从而阻断细胞抗氧化保护系统,从而导致增加氧化细胞环境(补充图3)。TPA最终是通过激活细胞ROS的间接诱导物NOX2复杂。现有redox-modified半胱氨酸的检测、细胞减少硫醇之前贴上NEM细胞收获,确保固定细胞条件下蛋白质的氧化还原状态。相反,氧化样品后处理过程中半胱氨酸与D5-NEM标记。LC / MS确定了特定的肽覆盖65%的免疫沉淀反应hPPARγ蛋白质(补充图4),包括九个十个半胱氨酸(表1),它可以检测到标签代理NEM / D5-NEM一谱以及二硫(补充数据5 - 9)。
有趣的是,我们发现增强半胱氨酸的氧化(D5-NEM)只在氨基酸片段AA 116 - 130和160 - 167 AA,作为第一和第二成员hPPAR的锌指地区γ(图3(一个))。更引人注目的是,只有有限合伙人/干扰素γ和TPA导致redox-based天车,而典型的氧化还原应力诱发H2O2金诺芬并没有。可用二硫化的检查这些氨基酸片段一起与上半年的锌指基序指出类似的方向,使推理的未完成的标签由D5-NEM氧化半胱氨酸(数字3 (b)和3 (c))。令人惊讶的是,降低半胱氨酸(NEM)肽AA 116 - 130和160 - 167 AA有限合伙人/干扰素γ和TPA刺激也增加(图3 (d))。沉重的量化(D5-NEM)光(NEM)比率证实两者的线性相关的标号(补充图10)。这建议治疗相关的可访问性的半胱氨酸的第二部分两个锌指由于NEM标记细胞收获之前,这将是第一步,后续的氧化。AA 168 - 188支持这些假设的数据显示类似的铝电解反应降低半胱氨酸168 hPPAR的铰链域内γ(图3 (e))。补充我们的数据,IL4治疗4 h和24小时导致氧化和降低半胱氨酸的检出率最低指先前建立减少氧化还原环境的刺激细胞(数字3(一个)- - - - - -3 (e))。然而,半胱氨酸在第一部分的锌指hPPAR域γ(AA AA 90 - 150, 141 - 154年)显示,几乎没有差异NEM-labeled半胱氨酸的检测水平,以应对任何诱导氧化还原压力(图3 (f))。然而,redox-based转译后的修改在hPPAR dna结合域的部分γ被检测到。最后,缺乏H2O2诱导多功能天车hPPAR的半胱氨酸γ尽管细胞诱导氧化还原压力验证通过BIAM开关试验使用的酶类的半胱氨酸修改3 (Prx3)作为选择治疗控制(补充图11)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。模仿Redox-Based hPPAR天车γ半胱氨酸指向一个改变dna结合蛋白的能力
验证一个假定的角色识别redox-mediated hPPAR天车γ半胱氨酸位于锌指蛋白区域的dna结合域(DBD),我们问这些修改是否与hPPAR功能变化有关γ端依赖transactivation。我们进行了短暂的PPARγ基于双荧光素酶系统的反式激活因子分析。分析改性半胱氨酸残基位于DBD的角色,我们半胱氨酸突变标明丙的LC / MS验证氧化hPPAR半胱氨酸γ(C129A C126A C160A和C163A)(图4)。此外,产生的突变nonredox决定284年半胱氨酸(C284A)。有趣的是,基础水平的荧光素酶活性锌指区域内的所有四个cysteine-containing突变是野生型(wt) hPPAR相比下降γ(图4(一))。相比之下,相对发光单元(RLU)突变C284A略,但不显著,增加。进一步研究不同突变体和野生型结构,细胞治疗与PPAR 24小时γ配体。罗格列酮是PPARγ受体激动剂,它强烈wt hPPAR反式激活因子活性的增加γ(图4 (b))。相比之下,对手GW9662略wt hPPAR transactivation的增加γ但同时阻止受体激动剂,即。,rosiglitazone-dependent transactivation。GW9662治疗细胞表达C284A突变导致类似transactivation作为wt hPPAR观察γ,但令人惊讶的是,刺激受体激动剂罗格列酮并不阻止。因此,半胱氨酸的假定的redox-modification C284位于hPPAR的配体结合的口袋里γ女士不能验证通过,由于缺少肽覆盖率,可以设想改变配体结合的转录因子。符合我们的期望,半胱氨酸hPPAR位于DBD的丙氨酸突变体γ完全阻塞hPPARγtransactivation(图4 (c))。只有hPPARγC163A表达细胞的反应与罗格列酮增强的荧光素酶活动的刺激。这些数据支持之间的连接半胱氨酸氧化hPPAR锌指区域内γ,引发损失的dna结合蛋白的能力,因此改变transactivating转录因子的功能。
(一)
(b)
(c)
3.5。磷酸化的丝氨酸hPPAR 82γ是一个先决条件Redox-Based天车起始
考虑了半胱氨酸氧化hPPARγH后2O2治疗,我们检查是否nonredox-based天车像磷酸化可能与我们先前的调查结果。因此,我们重新的LC / MS数据收集redox-modified hPPARγ磷酸化的丝氨酸、酪氨酸,threonine-residues。如图5,有限合伙人/干扰素γ刺激显著增加的磷酸化丝氨酸hPPAR 82 (S82)γ所示,也是TPA-treated细胞。相反,IL4刺激后最小的磷酸化S82被检测到。H2O2没有效果。这些线后,磷酸化的S82可能引发有关redox-based天车在hPPAR的半胱氨酸γ因为女士设置数据显示相同的刺激的依赖。
3.6。Redox-Modifications hPPAR的γ改变绑定到VIM
考虑到PPARγ被称为调节器具有双重功能的dna结合转录因子以及蛋白质相互作用的合伙人DNA-unbound状态,我们集中PPAR利息呢γ互动合作伙伴,经典有限合伙人/干扰素γ与替代IL4米Φ激活。因此,我们重新的LC / MS数据HA-immunoprecipitated hPPARγ搜索coimmunoprecipitated蛋白质。我们确定了波形蛋白(VIM)和微管蛋白β5链(TUBB5)作为细胞细胞骨架的已知的蛋白质(图6)。coimmunoprecipitated VIM(图的最高水平6(一))和TUBB5(图6 (b))蛋白质后被观察到的有限合伙人/干扰素γ——TPA-treatment。最低绑定在应对IL4-stimulation被发现。一个增强hPPARγ蛋白质相互作用后,可以验证hPPAR TPA刺激γvim交互通过免疫印迹分析(数据6 (c)和6 (d))。这些数据最终建议一个增强改性hPPAR蛋白质间交互作用γ与细胞骨架蛋白。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
米Φ是至关重要的免疫系统的哨兵,参与直接宿主抵御病原体入侵,而且在调节各种免疫过程(30.]。因此,米Φ可以分化成不同的表型,彻底改变他们的新陈代谢和细胞氧化还原状态建立最佳的细胞条件履行目的主机(13,14]。
因此,我们第一次的细胞氧化还原环境特征(有限合伙人/干扰素γ)和M (IL4)极化MΦ关于他们的能力,诱导redox-based天车细胞表达roGFP2作为半胱氨酸的氧化还原蛋白质标记。我们观察到MΦ表型建立氧化或减少条件经过短暂的初始阶段根据使用偏振政权(图1,补充图2)。在承认其为有限合伙人/干扰素分子模式γ巨噬细胞开始分化表型越来越多进入宿主防御机制,一个复杂的转变更厌氧代谢的需氧菌。这是通过增加能源发电通过糖酵解、磷酸戊糖途径,缩短柠檬酸循环的抑制呼吸链(14]。同时,细胞氧化还原状态增加了使用生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为辅助因子的生成活性氧(ROS)的形式∙O2- - - - - -NADPH氧化酶2 (NOX2) [31日]。这种激进的细胞可以被转化为活性物质,如过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HOCl)和N-chloramine (RNCl),加上没有用于杀死微生物(15]。这些线后,经典的潜在细胞氧化环境有限合伙人/干扰素γ激活米Φ似乎显著增强我们的实验或者IL4-activated细胞相比,不合格产生高水平的ROS由于他们缺乏NOX2激活和表达(18,19,32]。然而,特定的细胞氧化还原氧化水平的发展环境是一个耗时的过程和高度依赖于巨噬细胞的极化状态。
低浓度的ROS在细胞信号分子和无所不在的可以自由穿过细胞膜。因此,核具有抗氧化保护系统分离,这盾牌DNA对ROS的有害的氧化作用[33]。因此,硫氧还蛋白1 (Trx1)导入到核并行氧化应激和氧化还原缓冲在核间不断出口到胞质(34,35]。这将导致减少氧化还原电位和氧化反应在细胞核表达一个相对阻力。为了验证这种关系,我们使用过氧化氢(H2O2)作为直接的氧化剂,金诺芬和TPA在我们的研究。金诺芬和TPA只能间接导致细胞的氧化还原平衡发生变化,既是物质调节redox-relevant蛋白质的代谢途径和活动。因此,金诺芬作为一个特定的硒蛋白,如硫氧还蛋白还原酶抑制剂(TrxR)和thioredoxin-glutathione还原酶(TGR),削弱细胞抗氧化保护机制(36]。TPA,另一方面,导致细胞膜蛋白激酶C的易位,允许NOX2子单元的磷酸化。因此,功能性NOX2复杂的形成,能产生活性氧(37]。H2O2,金诺芬和TPA短期在细胞氧化还原氧化应力诱发减毒效果表达核位于荧光团指向一个活跃的抗氧化防御在细胞核中独立于保护细胞溶质(补充图3)。经典,有限合伙人/干扰素γ激活的Φ增加了氧化环境在之后的时间点在细胞核中,这甚至比胞质氧化还原状态(roGFP2-hPPARγ与roGFP2,图2(d)与图1(a))。这牵涉到一个特定的核保护系统的失活,这是合理的考虑所需的许多核蛋白质的氧化。相比之下,米(IL4)极化导致减少的扩展条件在第一小时细胞核。在极化,米Φ试着尽可能快的适应组织的需求和需要。因此,一个特定的氧化还原信号的放大,独立是否氧化或还原,可以有利于改变许多不同的转录的功能同时规定由redox-based天车。遵循这些原则,我们验证了不同的胞质及核氧化还原的氧化还原环境的挑战Φ,这表明redox-based hPPAR天车γ可能发生的。
PPARγ是一个转录因子参与许多细胞过程与脂肪酸代谢以及MΦ偏振(38- - - - - -41]。其广泛的能力是由双重维护功能改变蛋白质的转录基因依赖dna的和独立的7,8,42]。其活动是由构象改变,这是由天车的氨基酸在蛋白质和针对特定的配体结合的配体结合域(精神的小黑裙)43,44]。因此,hPPAR互动的状况γ转移,以支持或压制不同的蛋白质相互作用。乙酰化作用,因此,磷酸化,类泛素化ubiquitylation, O-GlcNAcylation已经确定没有连接可能redox-based修改(44]。因此,我们重点分析转录因子对氨基酸的改变,由变化引起的氧化还原环境,在M(有限合伙人/干扰素γ)和M (IL4)极化巨噬细胞。连接观察化学特征变化的细胞氧化还原环境、氧化还原的影响压力代理像H2O2金诺芬,通过质谱和TPA并行监控。有趣的是,H2O2金诺芬并没有半胱氨酸氧化的转录因子,而半胱氨酸氧化(二硫化和D5-NEM图3在锌指hPPAR的图案γ年代dna结合域TPA后增加或巨噬细胞极化到M(有限合伙人/干扰素γ)表型。,米(IL4)极化巨噬细胞显示氧化半胱氨酸。这些数据表明hPPARγ是由细胞氧化的氧化还原环境,但它的起始是最有可能的耦合redox-independent过程。正如我们roGFP2所示实验,TPA诱导只有弱细胞氧化条件相比其他氧化剂使用。然而,它介导ROS生成不仅是伴随着积极NOX2复杂的形成,而且还通过磷酸化和激活的蛋白激酶C (PKC)和增殖蛋白激酶(MAPK)途径45,46]。
后者是也参与hPPAR的良好的磷酸化γ在丝氨酸S82 (S112 hPPARγ同种型(2)47- - - - - -50]。分析的磷酸化状态转录因子在我们的系统显示相关性的磷酸化S82 (pS82)和半胱氨酸氧化(图3与图5)。一般来说,磷酸化在靠近半胱氨酸促进硫醇的氨基酸残基,因此降低其氧化敏感性通过静电调制(51]。但S82 hPPARγ坐落在ligand-independent激活域AF1的蛋白质,因此分开cysteine-containing DBD。此外,磷酸化S82已表现出广泛的hPPAR构象的变化γ改变蛋白质的反式激活因子活动(52]。这是执行AF1的分子内相互作用域的小黑裙。这支持了我们的假设的磷酸化的耦合机制,改变蛋白质的三级结构和可能的可访问性氨基酸,引入半胱氨酸氧化。确定氧化半胱氨酸有条不紊的女士,我们固定所有降低半胱氨酸的氧化还原状态之前NEM-labeling细胞收获。有趣的是,我们发现不同程度的NEM半胱氨酸,只有提升TPA -和有限合伙人/干扰素γM的刺激Φ同时,已经提到的半胱氨酸氧化反应和S82磷酸化。这种机制指向一个微分hPPAR的可访问性γ半胱氨酸在细胞培养条件下,由由于磷酸化蛋白质结构的变化如前所述。特别是C168的数据在168 - 188 AA hPPAR肽γ其氨基酸位于柔性铰链域的转录因子能够促进我们的假设stimulation-dependent微分可访问性半胱氨酸的蛋白质。在这种背景下,降低识别的平行于氧化半胱氨酸似乎可信。减少了硫醇在DBD也决不能因此锌和蛋白质构象中已经促进进一步氧化。
其他因素也可能控制hPPAR的氧化还原状态γ半胱氨酸是氨基酸的当地静电影响附近的残留(51]。因此,带负电荷的侧链的谷氨酸和天冬氨酸减少半胱氨酸通过促进中性硫醇的氧化敏感的状态。相反,带负电荷的硫醇盐半胱氨酸可以激起和稳定的带正电的侧基精氨酸、半胱氨酸残基的氧化敏感性增加。凑近看,有许多在靠近带电氨基酸半胱氨酸在DBD hPPARγ(图7)。然而,对于大多数的氨基酸,影响半胱氨酸的氧化还原敏感性可以排除由于侧链的位置。有趣的是,R157的侧链和R164伸出直接进入锌的活性中心2 +络合半胱氨酸。从这一点,可以认为半胱氨酸残基氧化是青睐。另一方面,D114也可以参与这个氧化还原调控微调。
它已经表明,锌调节有关hPPAR不同方面γ对于PPARγ信号(54,55]。因此,半胱氨酸的可访问性可以另外监管通过锌平衡的细胞。讨论了锌体内平衡很有争议的是文献中有关巨噬细胞极化。一般来说,锌抗炎和抗氧化功能而闻名。在这一过程中,它变弱氧化的革兰氏阳性后巨噬细胞金黄色葡萄球菌感染和干扰生产通过抑制ROS NADPH [56- - - - - -58]。同时,锌等许多蛋白质PKC和MAPK至关重要,参与不同的信号和炎症通路的古典有限合伙人/干扰素γ极化巨噬细胞(59,60]。因此,hPPAR的锌指结构和相应的功能γ也可以影响细胞的锌。进一步的实验必须澄清造成影响的关系。
我们的数据获得免疫沉淀反应hPPARγ来自米(IL4)偏振米Φ进一步支持磷酸化之间的耦合机制,构象变化,转录因子的半胱氨酸氧化。IL4刺激PPAR而闻名γ活动在米Φ信号传感器和激活的转录6 - (STAT6)依赖的方式(61年,62年]。因此,PPAR激活γ结合DNA,直接和PPAR的转录γ目标基因启动没有磷酸化S82 [48]。女士,我们的数据显示最低pS82以及轻微氧化半胱氨酸在平行于最高PPAR的感应γ目标基因__arg1 IL4刺激(图3与图5和补充图2)。关注TPA治疗,PPAR的转录活动γ降低,尽管S82本身不会降低dna结合蛋白的磷酸化蛋白质的活动(48]。因此,提出的问题是,是否氧化半胱氨酸redox-modified hPPARγ调解transactivation变化。我们的数据,使用PPARγ端依赖反式激活因子化验分析transactivation hPPARγwt cysteine-to-alanine突变体,提供证据证明损失的只有一个半胱氨酸在DBD hPPARγ减少PPARγ端依赖transactivation(图4)。这些半胱氨酸本地化在两个锌指图案,每个组成的四个半胱氨酸络合一个根据NCBI锌离子守恒的域搜索。硫醇的氧化可能因此导致锌的释放2 +和中断的锌指基序,导致dna结合活性的丧失(63年]。考虑到半胱氨酸的氧化可能是细胞由磷酸化hPPAR控制γ,依赖dna的监管机构的损失函数可以转录因子的功能转移到其DNA-independent角色。此外,我们分析了hPPARγ284年半胱氨酸突变体,位于配体结合域(精神的小黑裙),和发现一个改变的交互与配体相比wt构造。C284的转录因子与配体结合而闻名(64年]。因此,redox-modified C284 hPPAR可以改变配体结合的状况γ。尽管存在氧化还原天车在C284不能验证通过女士由于缺少蛋白质覆盖率,hPPAR的观察γC284A反式激活因子的活动符合其他建立研究磷酸化S82转录因子,它报道减少配体结合亲和力的蛋白质(52]。我们的反式激活因子变异研究的一个限制是,我们不能完全排除,观察完全基于氧化还原规定但在构象变化。因此,我们假设,redox-modified hPPARγ特性的主要功能在调节过程DNA-independent方式可能通过影响微分蛋白质-蛋白质之间的关系。在这方面,它已经知道核PPARγ可以调节转录也完全是由其与辅阻遏物和辅活化因子没有绑定DNA (65年]。此外,在胞质、蛋白质可以与激酶直接交互,即。、MEK1和PKCα,细胞色素c还原酶(66年- - - - - -69年]。此类DNA-independent机制的优点是深植的基础相对快速启动所需的细胞效应,而依赖dna的作用方式可以采取小时由于其基因组处理结构(70年]。因此,对于一个快速建立一个特定的MΦ表型,存在redox-modified PPARγ可能是有益的。
支持交互配置文件的改变的假设redox-modified hPPARγ,我们发现hPPAR protein-protein-interactionγ波形蛋白中间丝蛋白(VIM)和微管蛋白beta-5链(TUBB5)改变氧化还原刺激巨噬细胞。为蛋白质,hPPARγ有限合伙人/干扰素后绑定是最大的γ——TPA-stimulation和最小IL4-treatment后(图6)。VIM和TBB5细胞细胞骨架的重要组成部分,核之间形成纤维网络,endoplasmatic网(ER)和线粒体71年,72年]。因此,他们与hPPAR交互γ可以显示一个特定的细胞氧化还原改变PPAR的传输机制γ可能通过细胞质高尔基体,线粒体,呃,一个VIM和PPAR的一般交互γ已经注意到(73年]。因此,一个可能的连接这些phospho-sites这个任务仍然需要证明。此外,准确的功能redox-modified hPPARγ,它的特点是磷酸化和半胱氨酸氧化、及其构象,仍然是未知的,未来的研究需要进一步解决。
5。结论
我们的研究显示,一个新颖的机制的redox-based天车调节hPPARγ,这是由微分极化M细胞氧化还原环境Φ成经典的有限合伙人/干扰素γ和替代IL4-activated表现型。因此,我们的数据表明S82磷酸化之间的连接和hPPAR半胱氨酸氧化γ蛋白质(图8)。这些redox-modifications可能引发hPPAR的功能转变γ从依赖dna的DNA-independent函数改变其蛋白质交互配置文件。
缩写
| AA: | 氨基酸 |
| AF1/2: | 反式激活因子域1和2 |
| AOX: | 抗氧化剂 |
| DBD: | dna结合域 |
| 呃: | Endoplasmatic网 |
| h: | 人类 |
| 高清: | 铰链域 |
| 干扰素γ: | 干扰素γ |
| IL4: | 白介素4 |
| 小黑裙: | 配体结合域 |
| 腰痛: | 配体结合的口袋里 |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| m: | 小鼠 |
| 米Φ: | 巨噬细胞 |
| MAPK: | 增殖蛋白激酶 |
| MEK1: | 增殖蛋白激酶激酶1 |
| 女士: | 质谱分析 |
| NEM: | N- - - - - -ethylmaleimide |
| NOX2: | NADPH氧化酶2复杂 |
| PKC: | 蛋白激酶C |
| PPARγ: | 过氧物酶体proliferator-activated受体γ |
| 铝: | 转译后的修改 |
| RFI: | 相对荧光强度 |
| RLU: | 相对发光单元 |
| roGFP2: | 氧化还原敏感的绿色荧光蛋白2 |
| ROS: | 活性氧 |
| RXR: | 类维生素a X受体 |
| pS82: | PPAR的磷酸化丝氨酸82γ |
| STAT6: | 信号传感器和激活的转录6 |
| TPA: | Tetradecanoylphorbol醋酸 |
| Trx1: | 硫氧还蛋白1 |
| TUBB5: | 微管蛋白β5链 |
| VIM: | 波形蛋白 |
| ZF: | 的锌指基序。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
附加分
高光。(我)古典巨噬细胞极化的有限合伙人/干扰素γ造成氧化,而IL4激活一个还原细胞内氧化还原环境。(2)巨噬细胞极化redox-regulation PPAR的原因γ。(3)PPAR的氧化γ是由nonredox-based刺激引起的。(iv) Redox-modification PPARγ改变DNA结合蛋白质相互作用
的利益冲突
不存在竞争的经济利益。所有的数据是可用的。
确认
本研究支持的协作研究中心“氧化还原监管”(SFB815) Z1 (IW), TP A03 (AvK)和TP A08 (BB),通过研究资助计划Landes-Offensive苏珥Entwicklung wissenschaftlich-okonomischer Exzellenz黑森州的卢安克,德国和其他Kroner-Fresenius基金会培训项目”转译研究Innovation-Pharma”(旅行)。我们感谢Jana Meisterknecht优秀的技术援助为质谱样品制备。
补充材料
RNA提取方法,qPCR, BIAM切换试验。roGFP2读出系统的验证和极化目标基因的表达(间接宾语与Arginase1)。短期的影响氧化还原强调胞质及核蛋白质的氧化还原状态。蛋白质输入进行LC / MS和代表女士PPAR的光谱γ肽来自AA头寸90 - 188。重(D5-NEM)光(NEM) hPPAR的比率γ半胱氨酸氧化还原后压力和H的验证2O2全身的天车半胱氨酸的蛋白质通过BIAM开关试验(75年]。(补充材料)