对线粒体和金属毒性的保护依赖于ATP13A2的功能性脂质结合位点

抽象

已故的内切/溶酶体P-型ATP酶ATP13A2（PARK9）在帕金森氏病有关（PD）和Kufor-Rakeb综合征，早发性震颤麻痹的非典型。在N-末端与细胞在胁迫条件下的信令脂质磷脂酸（PA）和磷脂酰肌醇（3,5）二磷酸（PI（3,5）P2），其调节ATP13A2活性ATP13A2相互作用。在此，我们分析了稳定的人SHSY5Y细胞系过表达野生型（WT）或，其中三个N-端脂质结合位点（LBS1-3）被突变ATP13A2突变体。我们探讨LBS1-3的调节作用在由ATP13A2对鱼藤酮诱导的线粒体应激的细胞保护和发现LBS2-3突变体显示废止保护作用。此外，相对于WT的LBS2和LBS3突变体较差响应，分别PI（3,5）P2和PA形成药理学抑制。我们进一步表明，PA和PI（3,5）P2也需要对有毒金属的锰ATP13A2介导的保护^{2 +}，锌^{2 +},菲^{3 +}，提示ATP13A2的各种PD相关的胁迫条件一般脂质依赖性活化机制。我们的研究结果表明ATP13A2介导的保护需要PI（3,5）P2到LBS2和PA到LBS3结合。因此，针对ATP13A2的N-端脂质结合位点可能会提供一种治疗方法，以减少各个PD损伤包括线粒体应力的细胞毒性。

1.简介

线粒体是在ATP产生中起关键作用的细胞器^{2 +}信令，活性氧类别（ROS），产生和凋亡性细胞死亡[1- - - - - -3.]。由于远离细胞体的位置需要高能量，神经元尤其依赖健康和动态的线粒体来激发膜的兴奋性，并执行神经传递和可塑性[4,5]。不足为奇的是，有缺陷的线粒体动力学牵涉在各种神经病学病症，包括帕金森氏病（PD），一个共同的渐进的运动障碍，其特征在于多巴胺能神经元在一个严重损失黑质致密部(6]。PD的特点是聚集性的积累α共核蛋白为路易体中的神经元黑质和具体的脑干，脊髓，和皮层区域[7,8]，而且线粒体缺陷是常见[9- - - - - -11]。在PD线粒体功能障碍强烈支持来自观测，1 - 甲基-4-苯基-1,2,3,4-四氢吡啶（MPTP），一种有效的线粒体复合物I抑制剂，触发PD样综合征[12,13]。此外，一些PD相关的基因，主要是帕金和PINK1，发挥通过自噬在线粒体动力学中发挥作用和清除，这加强了线粒体功能障碍和/或受损的线粒体间隙是紧密相连的PD发病的概念[9,10]。

在本研究中，我们着重研究ATP13A2 / PARK9，编码晚期内切/溶酶体膜蛋白，属于P-型ATP酶的表征不良亚科，即P5型转运与未分配的功能和底物特异性。到目前为止，ATP13A2的三维结构是未知的，但可以基于其它P型ATP酶（即，SERCA1a，H的公知的结构进行建模⁺腺苷三磷酸酶,Na⁺/ K⁺-ATP酶，和Cu^{2 +}-ATP酶）。在突变ATP13A2与PD和Kufor-Rakeb综合征相关，Kufor-Rakeb综合征是PD伴痴呆的一种严重早发常染色体隐性遗传形式[15]。ATP13A2对Mn诱导的金属毒性提供细胞保护^{2 +}(16,17]，锌^{2 +}(18]，和Fe^{3 +}(19]，它被认为是PD的环境危险因素。此外，ATP13A2在几种模式提供保护α-核蛋白毒性(16,18]。虽然ATP13A2导致的损失溶酶体功能障碍[20.]，有趣的是，ATP13A2和线粒体功能障碍之间有很强的链路/清除正在出现。患者的非功能性的成纤维细胞ATP13A2一般表现出线粒体功能障碍，包括降低的ATP的产生，提高的氧消耗率，和线粒体网络的碎片[21]。此外，敲除ATP13A2的（KD）在小鼠皮质神经元或成神经细胞瘤的人类细胞SHSY5Y触发器线粒体片段化和ROS产生[22]，而在在锌患者来源的神经球的嗅觉培养结果ATP13A2不足^{2 +}糖代谢异常，可导致线粒体功能障碍[18]。最后,在细胞PD模型SHSY5Y细胞暴露在线粒体复杂我抑制剂鱼藤酮诱导的线粒体压力,授予cytoprotection ATP13A2活动,自WT ATP13A2的过度表达,但不是一个催化死突变体,防止,而KD ATP13A2加重细胞毒性的14,23]。

有趣的是，所述信令脂质磷脂酸（PA）和磷脂酰肌醇（3,5）二磷酸（PI（3,5）P2）在ATP13A2 N末端相互作用，刺激自身磷酸化反应，这是其催化活性的一个标志[14]。PA是一种锥形的磷脂，可以改变膜的曲率或作为一种局部信号脂，例如，磷脂酶D (PLD)产生。磷脂酰肌肽PI(3,5)P2由PIKfyve脂质激酶形成，主要位于内溶酶体的晚期，在那里它作为细胞器标签发挥作用。药物抑制PLD(防止PA的产生)或PIKfyve(防止PI(3,5)P2的产生)抵消了atp13a2介导的对鱼藤酮诱导的线粒体毒性的保护作用[14,23]。总之，这些结果表明，PA和PI所需的ATP13A2的线粒体胁迫条件的激活（3,5）P2。三个假定脂质结合位点（LBS1-3）先前在ATP13A2 N末端通过蛋白脂质结合与ATP13A2的纯化的突变型和野生型N-末端蛋白片段测定法鉴定的（图1(一)）14]。

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图1

突变ATP13A2抑制活性的关键脂质结合位点，但没有亚细胞靶向。（一）在先前确定的脂质结合位点多正电荷残基[14(蓝色带下划线的)被替换为Ala。LBS3与另一个剪接位点重叠，在ATP13A2的剪接变体1中插入了五个额外的残基。妈,膜相关地区。(b)用一抗ATP13A2抗体免疫印迹法分析ATP13A2的表达水平，并与GAPDH作为负荷对照。通过蛋白酶体抑制剂MG-132的处理来评估LBS突变蛋白的降解情况(100)μM) for 6 h. The same gel for the expression of ATP13A2 between cell lines has been provided at both low and high intensities. OE, overexpression. (c) Autophosphorylation assay (EP) on microsomes of ATP13A2 WT or LBS mutant expressing SHSY5Y cells. At the top, the same gel was depicted twice at different exposure times. Below, equal protein loading on the SDS-PAGE gel was confirmed by Coomassie staining. We consider that the double bands visible in LBS2 and LBS3 at longer exposure time are background levels while the actual ATP13A2 related EP band (visible in LBS1 and WT-OE) is located in between, but closer to the double band. Quantification of ATP13A2 expression ((b) ATP13A2/GAPDH) and autophosphorylation levels ((c) EP/Coomassie) are depicted. (d) Expression and localization of endogenous (FLUC), WT-OE, LBS1, LBS2, LBS3, or LBS1.2.3 ATP13A2 were confirmed by colocalization experiments with the lysosomal marker LAMP-1 and captured using Olympus IX73 fluorescent microscope. Representative enlarged images of colocalization for all cell lines have been provided as image inserts. Data are representative of 3 independent experiments. Scale bars represent 10 μM.

为了验证PA和PI(3,5)P2是否是线粒体应激条件下ATP13A2细胞保护作用的关键介质，通过直接相互作用和激活全长ATP13A2，我们比较了稳定表达WT ATP13A2和LBS1-3突变体的SHSY5Y细胞株。我们进一步探讨了类似的PA和PI(3,5) p2依赖的ATP13A2激活机制是否也可提供细胞对金属(Mn)的保护^{2 +}，锌^{2 +},菲^{3 +}）诱导的细胞毒性。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

SHSY5Y神经母细胞瘤细胞系稳定表达萤火虫萤光素酶（FLUC，对照），WT ATP13A2，三推定的N端LBS的突变体（LBS1：⁶⁵FRWKP→FAWAP;LBS2：⁷⁴RLRLRALALA;LBS3：¹⁵⁵KRVLRAAVLA;LBS1.2.3: LBS1-3突变组合)或sh-ATP13A2 (KD [14,23]）通过慢病毒转导产生并如前所述维持[14]。

2.2。药物治疗

将细胞暴露于鱼藤酮（ROT，1 μM;R8875，Sigma公司），MPP +（50 μM, DO48, Sigma)，锌(ZnCl₂, 150年μM;Z0152, Sigma)，锰(MnCl₂, 2μM;和铁(FeCl)_3.,1。5 mM; 157740, Sigma) for 24 hours (h). The final concentration of each agent was chosen from a dose response analysis to obtain a submaximal inhibition of cell viability. Prior to stressor addition, cells were pretreated for 1 h with YM-201636 (PIKfyve inhibitor, PIK, 200 nM; 524611, Millipore) or 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (PLD inhibitor, FIPI, 100 nM; F5807, Sigma) to inhibit the production of PI(3,5)P2 or PA, respectively. To inhibit the proteasome, cells were incubated with MG-132 (100 μM;M7449, Sigma) 6小时。

2.3。荧光显微镜

Cells were fixed with 4% paraformaldehyde at 37°C (30 min) and permeabilized with 0.1% Triton X-100 at room temperature (10 min). After blocking in PBS containing 1% BSA and 10% goat serum for 1 h at room temperature, samples were incubated with primary antibodies targeting ATP13A2 or LAMP-1 (Sigma) overnight at 4°C. Thereafter, samples were washed and exposed to Alexa Fluor 488 (green) or Alexa Fluor 647 (red) secondary antibodies. Cells were counterstained with DAPI (1 μg/mL)静置10分钟，用延长金防褪色剂固定，过夜固化。图像获得奥林巴斯IX73荧光显微镜使用63x物镜和尺寸cellSens软件。比例条代表10μM.

2.4。细胞死亡

细胞死亡通过碘化丙啶（PI）排除法确定。简言之，将细胞在指定的时间点用胰蛋白酶消化并用1孵育 μg / mlπ。pi阳性(死亡)细胞通过流式细胞仪(Attune流式细胞仪，Life Technologies)定量。

2.5。细胞活力

在96孔板中每孔接种5000个细胞。PBS洗涤处理细胞，37℃，用0.01 mg/mL MUH(4-甲基伞形基庚酸，Sigma)溶解于PBS中30 min。利用分子装置(Flex Station plate reader)测定荧光，激发波长355 nm，发射波长460 nm，截止波长455 nm。

2.6。蜂窝分馏

Cells were seeded in 15 cm dishes at a density of 1.5 × 10⁶。处理后收集细胞，重悬于10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM MgCl的低渗缓冲液中₂和SigmaFast蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma))，并在冰上孵育10分钟。在Dounce匀浆器中涂抹40下，加入1 M缓冲溶液(0.5 M蔗糖，10 mM Tris-HCl pH 7.3, 40)匀浆细胞μM CaCl₂，0.23 μM phenylmethylsulfonyl fluoride, and 1 mM dithiothreitol (DTT)) 20 additional strokes were performed. The total cell lysate was subjected to differential centrifugation: the nuclear fraction (1,000 g; 10 min), the mitochondrial/lysosomal fraction (12,000 g; 20 min), and, lastly, the microsomal and cytosolic fractions (200,000 g; 35 min; pellet and supernatant, resp.). Microsomal pellets were resuspended in a 250 mM sucrose solution supplemented with protease inhibitor cocktail. All fractionation steps were carried out at 4°C. After solubilization, samples were aliquoted, flash-frozen in liquid nitrogen, and stored at −80°C. The protein concentration was determined by the Qubit fluorometric method (Life Technologies).

2.7。免疫印迹

10 μ微粒体级分的g蛋白质上分离预制的NuPAGE 4-12％的BisTris使用电泳缓冲液（Life Sciences）上MOPS凝胶，接着转移到根据制造商的说明书聚偏氟乙烯膜（Millipore）。After blocking in TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) supplemented with 5% nonfat dry milk and 0.1% Tween-20 (Sigma), blots were incubated for 1 h with primary polyclonal anti-ATP13A2 (1/1,000 dilution; A3361, Sigma) and anti-GAPDH antibodies (1/5,000 dilution; G8795, Sigma) and 45 min with horseradish peroxidase conjugated IgG secondary antibodies (1/2,000 dilution; Bioke). Expression was detected using enhanced chemiluminescence substrate (Pierce) and the Bio-Rad ChemiDoc MP imaging system. Quantification was performed with ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/)。

2.8。自身磷酸化检测

40μ微粒体部分的克加入到95的终体积 μL反应缓冲液(160 mM KCl, 17 mM Hepes, 2 mM MgCl)₂、1毫米数码地面电视及5毫米NaN_3.)。自磷酸化检测通过添加[γ-³²P] ATP（2 μCi) and stopped after 1 min with 400 μL of ice-cold stop solution (20% trichloroacetic acid, 10 mM phosphoric acid). Samples were incubated on ice for 30 min to precipitate protein and centrifuged at 20,000 g for 30 min at 4°C. The pellet was washed twice with 400 μL冰冻停止溶液，最后溶解在样品缓冲液(10% LDS, 10mm NaH)中₂PO₄， 0.01% SDS, 10 mM 2-巯基乙醇，0.15 mg/mL溴酚蓝)。将样品装上NuPAGE 4-12% BisTris凝胶(Life Sciences)后，在含有0.1% SDS和170 mM MOPS (pH 6.3)的运行缓冲液中电泳1.5 h (40 mA, 170 V)。在7.5%醋酸中固定后，凝胶暴露在磷化成像仪屏幕上(GE Healthcare)，第二天，在磷化成像仪扫描仪上(Storm 860, GE Healthcare)显示放射性。使用Image QuanT(分子动力学)和ImageJ软件包(http://rsbweb.nih.gov/ij/)。

2.9。统计分析

数据以三个独立实验的平均±SD表示。统计分析是通过单向方差分析(ANOVA)与Dunnett’s或Bonferroni事后校正。考虑

3.结果

3.1。LBS2-3突变阻止ATP13A2激活和细胞保护作用

以前，使用纯化的ATP13A2 N-末端片段的蛋白质的脂质覆盖检定，我们描述了LBS1和LBS2主要需要用于与PI（3,5）P2（PA在较小程度上）的相互作用，而LBS3为PA相互作用所必需(14]（图1(一))。在这里，我们测试是否ATP13A2在鱼藤酮诱导线粒体毒性的条件下的保护作用可以通过一个特定的和PI（3,5）的直接相互作用来解释P2和PA全长ATP13A2蛋白。为此，我们产生与ATP13A2 KD稳定SHSY5Y细胞系（在ATP13A2 mRNA水平％的减少相比，FLUC [14)或过表达FLUC(萤火虫荧光素酶，对照)、ATP13A2 WT和在假设的n端脂质结合位点的4个突变体(LBS1、LBS2、LBS3和LBS1.2.3)。

首先，我们证实通过免疫，像WT ATP13A2过表达时，LBS1，LBS2，LBS3，和LBS1.2.3突变体在SHSY5Y细胞的LAMP-1阳性细胞器（也表示图1（d）)。值得注意的是，LBS突变体的表达远远高于内源性ATP13A2蛋白水平(FLUC)，因为在FLUC中只能检测到内源性的ATP13A2表达(图)1（d））14]。这些结果表明，LBS的突变体在内 - 晚/表达溶酶体远远高于内源性ATP13A2，这是通过免疫印迹确认水平（图1 (b)相比，在FLUC细胞系ATP13A2水平落入低于检测限[14)和LBS突变体)。根据免疫印迹分析，LBS突变细胞株的蛋白表达水平至少比WT低10倍，在不同病毒载体稀释的情况下，我们反复观察到WT和LBS突变细胞株蛋白表达的差异。此外，MG-132对蛋白酶体的抑制仅部分增强了突变蛋白的表达水平，提示蛋白不稳定可能不是主要问题(图)1 (b))。

接下来，我们证实了ATP13A2 WT的过表达保护，而ATP13A2敏感细胞对鱼藤酮的KD（图图2（a）)，与我们先前的研究结果一致[14]。此外，PIKfyve的药理学抑制脂质通过YM-201636或由FIPI的PLD活性的激酶防止ATP13A2过表达细胞系中的细胞保护，但对ATP13A2 KD细胞没有显著作用，提示这两种脂质上的直接和激活作用ATP13A2（图图2（a）)。值得注意的是，抑制剂施加在无鱼藤酮（无显著毒性作用图图2（a）)。

（一个）

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(c)

(d)

(e)

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(b)
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图2

LBS突变阻止ATP13A2介导的细胞保护作用。（一个）ATP13A2’s protective response at 24 h exposure to rotenone (Rot, 1 μM) and the effect of pharmacological inhibition of PIKfyve lipid kinase with YM-201636 (PIK or P, 200 nM) and inhibition of PLD with FIPI (F, 100 nM) on cell death were assessed via a propidium iodide (PI) based assay.FLUC与WT-OE/sh-ATP13A2的统计学差异细胞系内的统计差异在用抑制剂（1分处理，;2标志,;3马克，）（ANOVA和Bonferroni事后检验）。（（B） - （e））的稳定的细胞系暴露于1 μ鱼藤酮((b)-(c)) M或50μmmpp + ((d)-(e)) 24小时后，采用PI染色流式细胞仪检测细胞死亡，采用MUH协议检测细胞活力。数据为3次独立实验的平均值±标准差。FLUC和WT-OE / SH-ATP13A2 / LBS1 / LBS2 / LBS3 / LBS1.2.3（1标记之间的统计学差异，;2标志,;3马克，）（ANOVA和Bonferroni事后检验）。

为了进一步评价在线粒体水平ATP13A2的作用，我们比较我们的细胞系对鱼藤酮和MPP +，另一个复合物I抑制剂（图的灵敏度图2（b）- - - - - -2 (e))。数据表明，对于鱼藤酮，ATP13A2 WT保护和KD致敏细胞MPP +毒性（图2 (d)和2 (e))。有趣的是，与WT的LBS2，LBS3的过度表达，并LBS1.2.3突变体比较失败，以防止任何rotenone-或MPP +诱导的线粒体压力，符合LBS2 / 3的网站在ATP13A2介导的关键作用细胞保护（图图2（b）- - - - - -2 (e))。此外，相比于FLUC，LBS1证实在细胞生存力测定抵抗鱼藤酮或MPP +比WT稍弱，但显著保护作用。相较于鱼藤酮，LBS1对MPP +保护是不是在细胞死亡测定显著（图图2（b）和图2（c）)。所述LBS2-3突变体的故障，以防止任一鱼藤酮或MPP +不仅仅涉及其表达水平较低，因为对于任一细胞死亡诱导（图图2（b）和2 (d)）或细胞存活力的抑制（图图2（c）和2 (e)在LBS2、LBS3和LBS1.2.3细胞系中，均观察到ATP13A2 KD水平显著致敏，而在LBS1中未观察到这种致敏作用。最后，我们测试了关键脂质相互作用位点的突变是否影响了ATP13A2的自磷酸化特性(图)1 (c))。在LBS2/3/1.2.3细胞中未观察到自磷酸化信号，而在LBS1细胞中检测到微弱但可重复的自磷酸化信号。

总之，这些数据片段表明，在线粒体应激条件下，LBS2-3突变对ATP13A2功能的抑制作用。

3.2。PA和PI（3,5）P2介导的保护针对线粒体胁迫具体地说经由ATP13A2发生

我们研究了PA和PI（3,5）P2生产的药理学抑制是否可影响LBS细胞系对鱼藤酮诱导的线粒体应力的响应（图3.)。在LBS1及LBS3细胞系，抑制的PIKfyve通过YM-201636显著增加鱼藤酮诱导的毒性（图3(一个)和3 (b))。相比之下，YM-201636在LBS2或LBS1.2.3细胞系中均不能引起进一步的胁迫。在PA情况下，FIPI对PLD的抑制不能增强鱼藤酮引起的LBS3和LBS1.2.3的毒性(图)3 (c)和3 (d))。然而，对于LBS1细胞，FIPI显著增强了鱼藤酮诱导的毒性(图)3 (c)和3 (d)），而在LBS2的情况下，FIPI的显著效果仅在细胞生存力测定观察到的（图3 (c))。这些观察结果与先前观察结果很好地相关的是，PI（3,5）P2主要与LBS2和PA与LBS3 [相互作用14]。总之，这些结果与上ATP13A2活性的N-末端，它是由特定的反转的抑制作用线和引导在鱼藤酮诱导的线粒体胁迫条件PA和PI（3,5）P2的结合位点LBS。

（一个）

(b)

(c)

(d)

（一个）
(b)
(c)
(d)

图3

PA和PI（3,5）P2介导的保护线粒体应力经由ATP13A2发生。SHSY5Y细胞稳定表达FLUC，shRNA的用于ATP13A2，ATP13A2，ATP13A2和与突变的推定的脂质结合位点的全长突变体（LBS1-3）的KD暴露于鱼藤酮（ROT，1 μM) in the presence or absence of 1 h pretreatment with the pharmacological inhibitors of PIKfyve lipid kinase (((a) and (b)) YM-201636, 200 nM) or phospholipase D (((c) and (d)) FIPI, 100 nM). Following 24 h exposure to rotenone, cells were assessed for cell viability ((a) and (c)) or death ((b) and (d)) by, respectively, MUH and propidium iodide (PI) assays. Data are the mean of 3 independent experiments ± SD.FLUC与WT-OE/sh-ATP13A2/LBS1/LBS2/LBS3/LBS1.2.3细胞系内的统计差异在用抑制剂（1分处理，;2标志,;3马克，）（ANOVA和Bonferroni事后检验）。

3.3。PA和PI（3,5）P2提供ATP13A2介导的保护对PD相关金属毒性

ATP13A2对各种金属离子(Mn)的保护作用^{2 +}(16,17]，锌^{2 +}(18]，和Fe^{3 +}(19]）取决于ATP13A2的催化活性，因为催化死突变体是不能提供的细胞保护。在这里，我们测试ATP13A2期间金属毒性的激活是否还取决于PA和/或PI（3,5）P2。在稳定的SHSY5Y细胞系，我们观察到相似的鱼藤酮和MPP +毒性ATP13A2过表达对受保护的，而KD在暴露于锌致敏细胞毒性金属^{2 +}，锰^{2 +},菲^{3 +}（数据4(一)和图4（b）)，与以往的报告一致[14,16,17,19,23]。

（一个）

(b)

(c)

(d)

(e)

（一个）
(b)
(c)
(d)
(e)

图4

PA和PI（3,5）P2提供ATP13A2介导的保护到PD相关的金属的毒性。((a)-(b)) The SHSY5Y cell models stably overexpressing FLUC, WT-OE, or sh-ATP13A2 were exposed for 24 h to rotenone (Rot, 1 μ男，阳性对照）和MPP +（50 μ以及重金属Zn^{2 +}（150 μ米)、锰^{2 +}(2μM），和Fe^{3 +}(1.5 mM). Cell viability was evaluated by the MUH assay (a), whereas cell death was assessed by propidium iodide (PI) stained flow cytometry (b). To test whether the protective role of ATP13A2 depends on the signaling lipids PI(3,5)P2 and PA, the SHSY5Y cell lines were pretreated for 1 h with the PIKfyve inhibitor (200 nM; P or PIK) and/or the phospholipase D inhibitor (100 nM; F or FIPI) prior to the addition of the heavy metals Zn^{2 +}(c)、锰^{2 +}(d)和铁^{3 +}（E）。细胞保护的水平通过PI染色流式细胞术进行评价。数据为3次独立实验的平均值±标准差。FLUC和WT-OE之间的统计学差异，细胞系内的统计差异在用抑制剂（1分处理，;2标志,;3马克，）（ANOVA和Bonferroni事后检验）。

接下来，我们讨论了ATP13A2介导的保护金属的毒性是否还取决于PA和PI（3,5）P2的相互作用。类似于在鱼藤酮的条件下（图图2（a）），PI的抑制（3,5）P2形成显著钝化保护作用以下两个FLUC和WT过表达细胞中观察到金属露出，但不存在于KD细胞系（图图4（c）- - - - - -图4（e）)。与YM-201636获得的数据一样，FIPI也减弱了ATP13A2对金属离子Zn的保护作用^{2 +}，锰^{2 +},菲^{3 +}（数据图4（c）- - - - - -图4（e）)。然而，与YM-201636，FIPI增加FLUC和WT表达细胞的敏感度高达ATP13A2 KD细胞的水平，而YM-201636和FIPI的coexposure并没有进一步增强细胞死亡。最后，在ATP13A2 KD细胞YM-201636或FIPI没有施加金属离子毒性的效果，而在用任一YM-201636或FIPI单独不诱导细胞死亡的所有细胞系的治疗（图图4（c）- - - - - -图4（e）)。

此外，LBS1-3细胞暴露于所述金属离子的Zn^{2 +}或Mn^{2 +}和细胞毒性和细胞死亡进行了评估（图5)。与ATP13A2 WT和FLUC相比，LBS3和LBS1.2.3均表现出ATP13A2对Zn的保护作用明显丧失^{2 +}或Mn^{2 +}（数据图5（a）- - - - - -图5（d）)。虽然LBS2表现出显著，虽然小，减少在基于细胞死亡测定法的保护能力，无显著差异在细胞存活测定法发现LBS2，这表明增感重金属毒性在LBS3最一致和显著细胞系。

（一个）

(b)

(c)

(d)

（一个）
(b)
(c)
(d)

图5

ATP13A2的容量与PA / PI（3,5）P2是必不可少的，以防止重金属诱导的细胞毒性进行交互。SHSY5Y细胞系稳定过表达FLUC，ATP13A2的shRNA，ATP13A2 WT和突变体LBS1-3暴露于Zn中有毒的重金属浓度^{2 +}（150 μM（（A）和（b）））或Mn^{2 +}(2μM (c)和(d)))。采用基于碘化丙啶(PI)的流式细胞术((a)和(c))评估细胞死亡诱导，采用MUH法((b)和(d)评估细胞活力。数据为3次独立实验的平均值±标准差。FLUC和WT-OE / SH-ATP13A2 / LBS1 / LBS2 / LBS3 / LBS1.2.3（1标记之间的统计学差异，;2标志,;3马克，）（ANOVA和Bonferroni事后检验）。

4。讨论

4.1。通过N-末端ATP13A2活性的抑制由PA和PI（3,5）P2相互作用反转

ATP13A2的催化活性提供了对等线粒体应力各种PD相关的损伤的细胞保护[14,23和金属暴露(Mn^{2 +}(16,17]，锌^{2 +}(18]，和Fe^{3 +}(19]）。在这里，我们建立了这些不同的细胞保护作用取决于涉及的N-末端脂质开关ATP13A2的相同的激活机制。我们的研究结果表明，无论是PI（3,5）P2和PA都需要施加ATP13A2介导的细胞保护，这是由一个特定的和PI的直接相互作用（3,5）P2解释和PA在ATP13A2 N-末端脂质结合位点分别LBS2和LBS3。

而突变体LBS1.2.3不响应要么PIKfyve或PLD抑制，PIKfyve或PLD的药理学抑制了在分别的LBS2和LBS3细胞系，这强烈表明PI（3,5）P2结合于鱼藤酮毒性没有影响LBS2和PA到LBS3。这与蛋白质的脂质覆盖与ATP13A2的纯化的N-末端片段[以前的结果一致14]。此外，我们的数据表明，脂质都需要结合在一起，以允许激活ATP13A2，由于仅PA或PI（3,5）P2形成的药理学抑制足以废除ATP13A2 WT的细胞保护鱼藤酮。用于LBS2 / 3 / 1.2.3突变体中没有检测到自身磷酸化信号，而对于LBS1检测到弱信号，这表明LBS2 / 3 / 1.2.3突变体可能会表现出自身磷酸化活性的损失。然而，我们不能完全排除自身磷酸信号可能已经跌破了试验的检测水平由于突变体的表达水平较低。但由于我们以前表明，PA和PI的应用（3,5）P2刺激自身磷酸化反应[14而我们现在的研究表明，ATP13A2的保护作用依赖于脂质对LBS2/3的相互作用，我们可以合理地推测，具有功能的LBS2-3位点是催化自磷酸化反应所必需的。

总之，我们的观察强调了ATP13A2的激活依赖于膜相关n端区域的脂质相互作用，并提示n端可能是阻止ATP13A2活性的自抑制区域。N端或c端区域对p型atp酶的自抑制经常被观察到，例如在人的质膜Ca中^{2 +}-ATP酶PMCA [24和植物中的质子泵[25]。

令人惊讶地，LBS2 / 3 / 1.2.3但不LBS1细胞系显示要么鱼藤酮或MPP +的敏感性增加相比FLUC对照细胞，并作为KD细胞中观察到类似达到毒性水平。这个结果可能指向LBS2 / 3 / 1.2.3突变体抑制内源性ATP13A2的保护作用的显性失活效果。有趣的是，这种显性负作用与LBS1（图观察2）或催化死突变体D508N [14]，它们都含有完整的LBS2 / 3位点。因此，LBS2 / 3突变的N-末端可能由直接的相互作用或通过不可逆地捕获用于ATP13A2活化所需的调节蛋白和/或脂质抑制内源性ATP13A2。可替代地，内源性WT ATP13A2水平可能在所述LBS2 / 3 / 1.2.3突变体，其也解释了为什么与对照相比，细胞中的LBS突变细胞系显示线粒体应力的敏感性增加的表达被降低。这些可能性将在未来的实验来解决。

4.2。在帕金森病中，溶酶体和线粒体功能障碍密切相关

到目前为止ATP13A2的确切细胞功能仍不清楚，因为ATP13A2的运输基板尚未确定。然而，ATP13A2的线粒体和蛋白质的清除作用正在逐步显现。ATP13A2参与生物合成和释放外来体介导的αα-突触核蛋白间隙[18]，而ATP13A2的自噬依赖途径作用也已经提出，但机制的细节缺乏[21,22,26]。事实上，SHSY5Y细胞中的ATP13A2 KD降低了自噬通量[22，而溶酶体介导的自噬体清除在患者来源的ATP13A2中受损^{- / -}成纤维细胞[20.]。降低与ATP13A2缺乏相关的可能严重影响线粒体的质量控制的自噬通量，这可以解释线粒体片段化和升高的ROS产生[22]。

的兴趣，ATP13A2活化对PA和PI（3,5）P2进一步所连接ATP13A2自噬介导的清除途径[依赖性14,23]。事实上，PLD1调节α-通过自噬清除synuclein [27]，而PI（3,5）P2内切的调节作用/溶酶体形态和还参与自体吞噬[28,29]。通过刺激ATP13A2活动都可能血脂调节自噬并促进线粒体质量控制和整体细胞的健康。ATP13A2活性可能在线粒体应力和损坏，这可以通过各种损伤诱导的条件下特别需要，如复合物I抑制剂鱼藤酮/ MPP +或者也可通过毒性浓度的Zn^{2 +}，锰^{2 +}或Fe^{3 +}(30.,31]。事实上，在嗅觉神经球文化ATP13A2的损失导致锌^{2 +}营养失衡，顾名思义，它会导致线粒体功能障碍[18]。

PD研究突出的线粒体维修和清理由PINK1重要性/帕金介导的自噬，涉及缺陷的线粒体自噬体封装[一巨自途径32- - - - - -34]。但是溶酶体如何接受用于经由自噬途径或替代路由随后的降解线粒体如线粒体来源的囊泡[35]什么ATP13A2的作用，在这里仍然知之甚少。尽管如此，溶酶体和线粒体功能障碍可以紧密地连接在PD。此外ATP13A2，同样在溶酶体蛋白葡萄糖脑苷脂酶（GBA）的突变导致溶酶体受损神经鞘脂的降解，线粒体片段化，对PD遗传风险因素和升高的ROS水平[36]。此外，LRRK2影响溶酶体功能和调节线粒体动力学[37,38]。

总之，PA和PI（3,5）P2所需的ATP13A2介导的保护，以鱼藤酮/ MPP +诱导的线粒体应力和有毒的Mn^{2 +}/锌^{2 +}/铁^{3 +}提示一般脂依赖的ATP13A2激活机制可以解除n端自抑制。因此，针对ATP13A2的n端脂质结合位点，可能提供一种激活ATP13A2并降低多种PD损伤细胞毒性的治疗方式。

泄露

Shaun Martin和Sarah van Veen是第一批作者。Tine Holemans和Sarah van Veen是佛兰德斯研究基金会的研究员。

利益争夺

作者声明不存在利益竞争。

致谢

这项工作是由比利时科学政策办公室（P7 / 13）和鲁汶大学的吸引力校际波兰人资助（OT / 13/091和C1研究项目C16 / 15/073）。

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