齐墩果酸提高有益的预处理对PC12细胞的影响

文摘

预处理引起内源性保护后续接触更高浓度的一种神经毒素。在这项研究中,我们调查是否暴露于齐墩果酸(OA)提高了预处理的保护作用对PC12细胞暴露于6-hydroxydopamine (6-OHDA)。浓度的响应曲线构造使用6-OHDA(50、150、300和600μ米)。这个实验是由6组:治疗,OA,组1:细胞接受6-OHDA (50μ米)1小时、组2:细胞接受6-OHDA (150μ米)1小时,第三组:细胞接受6-OHDA (50μ米)30分钟之后6小时,治疗6-OHDA (150μM) 30分钟,第四组:细胞视为在3组也接受了OA第二6-OHDA后立即治疗。细胞生存和凋亡率评估使用MTT和膜联蛋白V染色试验,分别。在预处理细胞,我们发现细胞暴露于6-OHDA(150后生存能力仍然很高μ米)。治疗OA增强预处理的保护作用。同样,随着膜联蛋白V凋亡试验,预处理保护细胞,这增强了OA。因此,预曝光6-OHDA PC12细胞低浓度可以防止后续不良侮辱6-OHDA和OA增强了此保护。

1。介绍

自由基的形成和一个能力受损的细胞抵抗压力可以导致细胞损害所有主要的大分子包括蛋白质,核酸,脂质(1]。活细胞抗氧化应激的一种方式;包括解毒、生产蛋白质的监护人,如热休克蛋白清除受损的分子,增加了DNA修复酶的水平(1]。后者酶是增强细胞暴露于轻度应激时,这被称为预处理/毒物兴奋效应(1- - - - - -3]。因此预处理过程细胞暴露于轻度抗氧化应激,从而使他们更当随后暴露于更严重的氧化应激(1]。在预处理bioprotective机制,包括感应cytoprotective通路(分子伴侣’),抗氧化系统、DNA修复系统和免疫系统受到刺激。这些分子机制已被证明保护细胞免受各种形式的细胞死亡(4,5]。

帕金森病是一种神经退行性疾病,其患病率继续升级一般人群的预期寿命增加。尽管许多研究其管理仍不满意。基于细胞治疗是一种新兴的治疗帕金森症和它的使用已经承诺自某些干细胞也被证明有能力提高内源性神经发生(5]。然而,患病的大脑是一种严重的恶劣的环境威胁生存和/或纠正这些植入细胞分化[5]。

它已经表明,预处理细胞内也可能出现的神经系统6]。这项研究表明暴露的亚致死浓度的多巴胺细胞系6-hydroxydopamine (6-OHDA)防止后续暴露于高浓度的6-OHDA。这些结果表明,多巴胺能细胞的低浓度化学处理时,可能使细胞能够更好地生存在大脑神经退行性。

齐墩果酸(OA)是一种相对无毒的化合物已被证明有antitumoric7],王亚南[8,抗炎9],antihyperlipidemic [8),降糖药或那些10),和抗菌8]属性,除了作为止痛剂,抗溃疡的,anti-infertility,抗癌剂(7]。齐墩果酸因此似乎有各种各样的促进健康和预防疾病的特点。在这项研究中,我们调查了预处理对PC12细胞的细胞生存能力的影响和评估OA治疗是否会增强预处理的保护作用。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

我们获得了肾上腺phaeochromocytoma细胞系(通常称为PC12细胞株)的生物化学、夸祖鲁-纳塔尔大学的(南非)。rpmi - 1640生长培养基从高原生物(企业)有限公司购买(南非)。6-OHDA Heat-inactivated马血清,胎牛血清,胰蛋白酶,二甲基噻唑基diphenyltetrazolium盐(MTT)和OA从Sigma-Aldrich购买(南非)。抗坏血酸是来自SAARchem(南非)。青霉素、链霉素的解决方案是来自Biochrom AG(南非)。膜联蛋白V工具包是购自BD生物科学(南非)。所有的解决方案都是每个实验或试验前准备的新鲜。

2.2。细胞培养

组织培养的PC12细胞生长康宁烧瓶(怀特黑德科学、南非)。rpmi - 1640中含300 mg / L谷酰胺,4.5 g / L d -葡萄糖,1.5 g / L碳酸氢钠,1毫米丙酮酸钠,和10毫米消息灵通的缓冲区作为经济增长的一个组成部分中以以下方式:生长介质由83% rpmi - 1640, 10% heat-inactivated马血清,5%胎牛血清,2% penicillin-streptomycin解决方案(10.000青霉素10.000 U /毫升,链霉素µg / mL),并保持在37°C湿润孵化器提供5%二氧化碳(有限公司₂)。细胞生长直到confluency是达到70 - 80%。当足够的细胞生长,细胞被trypsinised,进行细胞计数使用纽鲍尔光显微镜下计数室和细胞被镀在96 - microtitre板(MTT试验)和24-well板(膜联蛋白V凋亡测试),在电镀密度每口井的50 000年和1000年的000个细胞,分别。一夜之间,细胞被留给坚持板表面(12到15个小时)。在细胞治疗中井是吸气和细胞治疗与6-OHDA溶解在中等或中等。6-OHDA股票的解决方案是准备使用一个包含2%抗坏血酸盐溶液。所有的解决方案都与无血清培养基稀释,最终浓度。治疗后,媒体与毒素吸气和细胞与血清媒体的孵化24小时前细胞生存能力和细胞凋亡进行了分析。

2.3。量效曲线

四个浓度的6-OHDA(50、150、300和600μ米)被用来治疗细胞持续时间为1小时。24小时后MTT试验和膜联蛋白V染色测试进行评估细胞生存和凋亡率,分别。

2.4。预处理方案

六组的细胞用于实验。这些包括2对照组(未经处理的细胞和细胞治疗OA (5µ米)。组1细胞(50µ(150米)和组2细胞µ米)暴露在6-OHDA 1小时。组3细胞暴露于6-OHDA (50µ米)30分钟之前接触6小时后6-OHDA (150µ米)进一步30分钟。组4组细胞被视为3但也治疗OA (5µ米)在一段时间内完成后24小时内使用的协议组3细胞。细胞凋亡率的可行性评估MTT可行性测试24小时后的膜联蛋白V凋亡检测。

2.5。细胞生存能力测试:MTT过程

MTT试验被用来测试对PC12细胞的可行性。这些细胞被镀的密度在96 - 5万细胞/微量滴定板12至15个小时的实验。每个细胞治疗后协议在前一节中提到的,这些细胞在37°C孵化器孵化24小时。这之后,这些细胞被孵化20µL (MTT(5毫克/毫升)3.5小时37°C的孵化器。在孵化后,媒体被没有扰乱细胞和DMSO (150µL)被添加到溶解甲瓒晶体。板块从光屏蔽使用箔和留在轨道振动器保持在600转/分钟15分钟。由此产生的紫色spectrophotometrically测量解决方案。细胞与正常的线粒体代谢活性和增殖产生MTT甲瓒的数量增加,因此形成吸光度的增加。MTT甲瓒产品形成的数量取决于测量吸光度(A)使用一个微型板块读者(Bio-Tek)波长630纳米。

2.6。膜联蛋白V-Propidium碘化过程

膜联蛋白V试验是用来测量凋亡比率(部分凋亡细胞:部分可行的细胞)的PC12细胞。这些细胞被镀100万细胞的密度在24-well板实验之前12到15个小时。在细胞治疗协议,细胞无血清培养系统孵化了。在这之后,细胞处理如下。媒体是废弃的井和细胞被洗两次0.90% w / v磷酸缓冲盐(PBS, 500µL)。胰蛋白酶是添加到每个(足够的覆盖表面)和孵化发生5分钟35°C激烈的孵化器。孵化后,盘子都轻了,直到所有的细胞都脱离表面。PBS (500µL)被添加到每个中和胰蛋白酶。从每个细胞悬液被转移到猎鹰管,用移液器吸取上下打破团,在冷冻离心机和离心机在12000 g (Hermle Labortechnik GmbH,德国)5分钟后在4°C的上层清液被移除,颗粒在管。

2.7。染色过程

绑定缓冲准备根据制造商的指示(BD Pharminogen)和100µL细胞悬液加入到猎鹰管。FITC膜联蛋白V (5µL)被添加到每个样本添加碘化propidium(5紧随其后µL)。地铁旋涡混合器(s)涨跌互现,孵化20分钟在室温(25°C)在黑暗中之后,绑定缓冲(400µL)被添加到每个管。流式细胞术分析了反应管(BD FacsCalibur)在1小时内(每个样本混合在一个旋涡混合器在阅读之前)。

2.8。统计分析

数据分析使用软件程序GraphPad棱镜(第5版)。结果报告为均值±SEM 3实验。数据受到Shapiro-Wilk正常测试,发现有偏态分布。随后进行了非参数测试(克鲁斯卡尔-沃利斯检验Mann-Whitney紧随其后测试)。一个值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。量效曲线

有一种神经毒素与150年对PC12细胞治疗的影响µ米、300µ米,600µ米6-OHDA)(0µ与150、300和600µ米,,数据1(一)和1 (b))。有最小的细胞损伤组治疗50µM 6-OHDA(浓度数据1(一)和1 (b))。

3.2。预处理和OA 6-OHDA暴露后治疗

有一种神经毒素影响细胞暴露于更高浓度的6-OHDA (150µ米)(治疗组与组2,,图2)。有神经保护作用细胞最初接触6-OHDA(50浓度较低µ米)(组2和组3,,图2)。这个神经保护被暴露在OA进一步加强(组3和4)。

同样当使用膜联蛋白V化验确定凋亡我们发现对细胞有毒害神经的影响暴露于更高浓度的6-OHDA (150µ米)(治疗组与组2,,图3)。有神经保护作用细胞最初接触6-OHDA(50浓度较低µ米)(组2和组3,,图2)。这个神经保护被暴露在OA进一步加强(组3和4)。

4所示。讨论

6-OHDA已被证明是一个有效的神经毒素研究帕金森病的发病机制都在体外和体内11,12]。以前的研究已经表明6-OHDA抑制线粒体呼吸,产生胞内活性氧,引发异常的细胞周期再入,最终导致多巴胺能神经元死亡(11]。然而,亚致死的6-OHDA水平已被证明对后续提供细胞保护有毒浓度6-OHDA的现象称为预处理/毒物兴奋效应(6]。在这项研究中,我们调查了预处理的综合效应和齐墩果酸(OA)培养的PC12细胞。

在这项研究中我们发现,与150年治疗的细胞μM 6-OHDA诱导氧化应激的启动序列事件,减少细胞活动导致凋亡细胞死亡。我们表明,预处理PC12细胞暴露到低浓度的6-OHDA前短时间内随后暴露在较高的浓度导致更大的细胞生存能力,因此更少的细胞死亡。这类似于一项研究显示,使用亚致死浓度6-OHDA之前暴露于有毒浓度保护细胞通过激活抗氧化反应系统(6]。在我们的研究显示,这种神经保护效应的预处理增强了随后的接触的细胞三萜齐墩果酸。

不同的强度、持续时间、频率和/或一个特定的应力刺激确定是否强大到足以刺激引起的反应足够作为预处理级触发,或太强劲,因此是否有害13]。在类似的实验中我们的研究,结果表明,浓度小,适应性管理的H₂O₂这些细胞PC12细胞保护对百草枯和6-OHDA导致的后续的氧化损伤14]。H的保护作用₂O₂是由于抗氧化酵素的活化细胞(14]。它也表明,保护通过预处理可能涉及MAPK和PI3K / Akt通路(15]。这些信号通路在调节凋亡细胞死亡中非常重要的发展和在疾病状态(15]。因此这些结果表明预处理可能是一个有前途的方法来治疗活性氧species-mediated疾病如帕金森病(14]。

虽然齐墩果酸的机制提供了防止氧化应激是未知的,大多数的合成类似物的研究齐墩果酸表明它激活Nrf2 /信号通路控制数组的upregulation基因抗氧化反应,热休克伴护蛋白质,和线粒体保护基因(16- - - - - -18]。齐墩果酸治疗已被证明导致氧化谷胱甘肽水平较高的保留强调细胞(19]。齐墩果酸治疗也还原谷胱甘肽过氧化物酶的水平,氧化强调PC12细胞中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(19]。它已经表明,齐墩果酸降低丙二醛的形成是存在氧化应激的标记(19]。它也表明,白细胞介素- 6 (il - 6)的浓度和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)氧化强调PC12细胞增加;然而,这种增加接触齐墩果酸(19]。il - 6和TNF -α也可以扮演一个角色在与帕金森病相关的神经炎症20.]。齐墩果酸的神经保护效应也在多发性硬化的动物模型研究表明齐墩果酸在其他神经炎症疾病的作用21]。在我们的研究中我们能够表明,添加5µ米齐墩果酸(22)加剧了包含细胞系预先处理这些多巴胺的神经保护效应。

尽管大多数研究改性和生物增强分子的影响,在我们的研究中我们用父母分子,齐墩果酸,我们的结果显示这个分子的有利影响氧化应激的细胞培养模型。

5。结论

暴露干细胞预处理在干细胞为基础的治疗可以使这些细胞抗有毒环境目前在帕金森症等神经退行性的大脑。这可能是增强与齐墩果酸治疗这些干细胞可能减弱或减缓疾病的过程,因此持续改善帕金森症患者的生活质量接受这种治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢国家研究基金会和夸祖鲁-纳塔尔大学的健康科学学院的金融支持。这项工作的一部分,硕士学位论文的作者之一(公元前Ndlovu)。

引用

1. t . v . Arumugam m . Gleichmann研究所。唐,m·p·马特森“激效/预处理机制,神经系统和老化,“老化的研究评论,5卷,不。2、165 - 178年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 美国Hoshida:山下式,k .大津,m . Hori“锰超氧化物歧化酶在延迟预处理的重要性:活性氧和细胞因子的参与,“心血管研究,55卷,不。3、495 - 505年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. a . Nakano c·p·贝恩斯s . o . Kim et al .,“孤立兔心脏缺血性预处理激活MAPKAPK2: p38 MAPK的参与的证据,”循环研究,卷86,不。2、144 - 151年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. c .快活和r。森本晃司,”热休克反应和分子伴侣’的作用在肿瘤形成和细胞死亡,”美国国家癌症研究所杂志》上,卷92,不。19日,1564 - 1572年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. g .王”,毒物兴奋效应、细胞死亡和再生医学神经退行性疾病,”剂量反应,11卷,不。2、238 - 254年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. r·k·泄漏,a . k . f . Liou和m . j . Zigmond“亚致死6-hydroxydopamine对响应的影响,随后在多巴胺能细胞氧化应激:预处理的证据,”神经化学杂志,卷99,不。4、1151 - 1163年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. t . a . Tran m·k·麦科伊·m·b·斯波恩和m . g .提出,诉讼”合成三萜CDDO-methyl酯调节小胶质活动,抑制TNF生产,并提供了多巴胺能神经保护,”《神经炎症第十四条,卷。5日,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j .刘“齐墩果酸和熊果酸的药理学,”民族药物学杂志卷,49号2,页57 - 68,1995。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. l, n . y . Calingasan托马斯b . et al .,“三萜的神经保护效应,CDDO甲基酰胺,Nrf2-mediated转录的强有力的诱导物,”《公共科学图书馆•综合》,4卷,不。6篇文章ID e5757 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. c . t . Musabayane m·a·塔夫茨,r·f·Mapanga”之间的协同抗高血糖药影响植物的齐墩果酸和胰岛素在体外糖尿病老鼠,”肾功能衰竭,32卷,不。7,832 - 839年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 曹x z, t . Wang,金黄色的太阳,和l .王”6-OHDA PC12细胞的细胞凋亡周期再入和通过ERK1/2信号通路的激活,“华中科技大学学报(医学)卷,29号1,第100 - 97页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. w·多尔和美国Przedborski帕金森病:机制和模型”,神经元,39卷,不。6,889 - 909年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j . m . Gidday“脑预处理和缺血性宽容,”神经系统科学自然评论,7卷,不。6,437 - 448年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. Z.-H。陈,吉田y, y齐藤,e . Niki“适应过氧化氢提高忍受PC12细胞氧化损伤,”神经学字母,卷383,不。3、256 - 259年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. h·h·汉h . Wang, s .奈特尔和z王,“氧化预处理和细胞凋亡在L-cells:角色的蛋白激酶B和增殖蛋白激酶,”生物化学杂志,卷276,不。28日,第26364 - 26357页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. a . t . Dinkova-Kostova k . t .立白k·k·斯蒂芬森et al .,“极其强大的三萜抗病诱导剂的第二阶段反应:防氧化剂和炎性应激的相关性,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷102,不。12日,第4589 - 4584页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. a . Neymotin n . y . Calingasan e·威利et al .,“神经保护作用Nrf2 /活化剂,CDDO ethylamide和CDDO trifluoroethylamide,在肌萎缩性脊髓侧索硬化症小鼠模型,”自由基生物学和医学,51卷,不。1,第96 - 88页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. c .堆栈,d . Ho·e·威利et al .,“常用药用CDDO-ethyl酰胺和CDDO-trifluoroethyl酰胺改善行为表型和大脑病理学在亨廷顿氏舞蹈症的转基因小鼠模型,”自由基生物学和医学卷,49号2、147 - 158年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. S.-J。蔡,M.-C。阴”,抗氧化和抗炎保护齐墩果酸和熊果酸在PC12细胞中,“食品科学杂志,卷73,不。7,H174-H178, 2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. p . Garcia-Esparcia f . Llorens m·卡蒙,费雷尔,“放松管制和表达复杂的细胞因子和免疫反应的介质在帕金森病的大脑区域的依赖,”大脑病理学,24卷,不。6,584 - 598年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. r·马丁·m·埃尔南德斯、科尔多瓦c和m . l .分担”自然实验性自身免疫性脑脊髓炎的三萜调节免疫炎症标记:对多发性硬化症治疗影响。”英国药理学杂志》上的报告,卷166,不。5,1708 - 1723年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. s . o .赵j.y.禁令,j . y . Kim et al .,“Anti-ischemic活动楤木属cordata和它的活性成分,齐墩果酸,“档案调药的研究,32卷,不。6,923 - 932年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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