文摘

背景。心脏衰竭的特点是激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统,这是参与调节心脏肥厚和高血压。最近,我们报道,Hdac8抑制减轻isoproterenol-induced和血管紧张素II-induced心脏肥大或高血压老鼠。此处的效果和监管机制的Hdac8选择性抑制剂PCI34051 overload-induced心力衰竭检测压力。方法和结果。在第6周posttransverse主动脉收缩(TAC),老鼠与PCI34051管理(3、10个或30毫克/公斤体重/天)2周。PCI34051的疗效TAC-induced心脏和肺肥大是由检查心脏weight-to-bodyweight和肺weight-to-bodyweight比率和心肌细胞截面积。超声心动图分析显示,PCI34051减轻TAC-induced减少射血分数和分数缩短。此外,Hdac8的表达调节在TAC小鼠的心脏和肺组织。傻乎乎的表达水平和Agtr1调节,而那些Ace2与Agtr2 TAC小鼠表达下调。PCI34051治疗或Hdac8击倒缓解炎症就是明证,差别Rela对这些Nfkbia upregulation在老鼠中,以及在心肌细胞中,但不是在心脏成纤维细胞。Hdac8 overexpression-induced Rela途径激活表达下调傻乎乎可拆卸的细胞。Picrosirius红染色、实时聚合酶链反应和免疫印迹分析表明PCI34051减轻纤维化和表达下调fibrosis-related基因。此外,PCI34051或Hdac8击倒在大鼠心脏成纤维细胞通过Tgfb1-Smad2/3途径减轻心肌纤维化。超表达和可拆卸的实验的结果表明,Hdac8和傻乎乎促进炎症和纤维化。结论。治疗PCI34051增强心脏和肺部功能TAC-induced心脏衰竭小鼠模型。这些数据表明,HDAC8小说是一个潜在的治疗心力衰竭伴有病理性肺部疾病的目标。

1。介绍

患病率、死亡率和患病率心脏衰竭的一种多因素疾病伴随结构和功能损害的组织(1,2),全球每年增加,包括美利坚合众国(美国)(3- - - - - -5]。心脏衰竭往往伴随着纤维化组织炎症反应。先前的研究已经报道,炎性细胞因子的水平,如肿瘤坏死因子-α(TNFα),interleukin-1β(il - 1β)和白细胞介素- 6 (il - 6)是调节在心力衰竭患者6,7)和横向主缢痕- (TAC)诱发心力衰竭小鼠模型(8]。心脏衰竭促进神经激素激活交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(老城),它在心血管的调节过程中起着至关重要的作用[9,10]。血管紧张素ⅱ,老城的关键分子调节心肌收缩性,促进不良重塑心脏衰竭(11]。傻乎乎催化血管紧张素I转换为血管紧张素ⅱ,虽然ACE2催化血管紧张素ⅱ转化为血管紧张素(1 - 7)或血管紧张素I血管紧张素(1 - 9),导致心血管效应在心力衰竭12,13]。ACE2在肺血管内皮细胞也表达了,因此预防急性肺衰竭(14,15]。在老鼠身上,Ace2不足导致早期心脏肥大(16),而傻乎乎超表达促进心房扩大(17]。因此,神经激素的封锁使用血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂和阻滞剂减少心脏引起心脏重构(18,19]。

最近的研究报告说,组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac)调节基因的表达。hdac分为四类。类我hdac包括HDAC1、HDAC2 HDAC3, HDAC8。在班级我hdac, HDAC2最佳特征它在心脏肥大的调制作用[20.,21]。例如,酶活性但不是HDAC2促进心脏肥大的表达式(22]。HDAC抑制剂,包括trichostatin和sk - 7041,肥厚和心力衰竭23- - - - - -25]。HDAC3增加产后心脏肌细胞增殖,但没有参与心脏肥大(26]。最近,有报道称PCI34051 HDAC8选择性抑制剂,减少血管紧张素II-induced高血压和isoproterenol-induced心脏肥大(27,28]。先前的研究已经表明,通过一种蛋白激酶/ GSK3 HDAC8调节心脏肥大β通路(29日]。然而,HDAC8在心力衰竭中的作用尚未阐明。上课我hdac相比,二类hdac,如HDAC5 HDAC9,抑制心肌肥大(30.]。

这项研究表明,药物抑制Hdac8减轻心脏failure-related差别或对这些疾病,包括心脏肥大,体内肺充血、纤维化和炎症(TAC-induced心脏衰竭小鼠模型)和体外。体外研究的结果表明,PCI34051或治疗Hdac8或傻乎乎击倒调节炎症和纤维化反应转化生长因子1 (TGF -β1)或肿瘤坏死因子α刺激。这是第一次研究证明HDAC8在心力衰竭的发病机制中的作用。

2。材料和方法

2.1。试剂

PCI34051(10444)从开曼群岛购买化学公司(美国安阿伯市MI)。Anti-Actb (sc - 47778), anti-Nppb (sc - 271185), anti-Acta2 (sc - 130617), anti-Ace1 (sc - 20791), anti-Ace2 (sc - 390851),和anti-Tgfb1 (sc - 146)抗体是来自圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX)。Anti-phospho-Smad2/3 (8828), anti-Smad2/3 (3102), anti-Rela(8242),和anti-Nfkbia(4812)抗体购自细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。Anti-Nppa和anti-Hdac8 (ab187139)抗体购自GeneTex (GTX109255;欧文、钙、美国)和Abcam(英国剑桥),分别。Anti-Fn1 (ma5 - 11981)和anti-Ccl2 (pa5 - 34505)抗体购自热费希尔科学公司(美国沃尔瑟姆,MA)。

2.2。TAC-Induced心脏衰竭小鼠模型的建立

所有动物实验动物实验委员会批准Chonnam国立大学医学院(CNUH iacuc - 18023)和根据指南进行护理和使用实验动物(美国国立卫生研究院的出版物,8^th版,2011)。雄性ICR小鼠(东方、韩国)6周保持在12岁在特定的无菌条件下h光/暗周期。鼠标皮肤消毒酒精,老鼠被腹腔注射氯胺酮的混合物麻醉(120毫克/公斤体重)和甲苯噻嗪(6.2毫克/公斤体重)。麻醉的老鼠在仰卧位固定在透明板上,连接到一个小动物呼吸机通过喉气管的插管。老鼠的肺特点如下:潮汐卷,0.1 - -0.3毫升和呼吸率,125 - 150次/分钟。主动脉弓被曝光,胸腺摘除。横向主动脉弓与一个以丝绸缝头臂动脉和左颈总动脉之间使用一个覆盖27 g针。收缩针小心地移除,胸部和皮肤切口使用4 - 0丝缝合伤口被关闭,通风是断开连接。老鼠放在热垫,直到他们手术后醒来。虚假的组接受相同的手术没有主动脉条带。 The animals were randomized into the following six groups (5–6 mice per group): sham+vehicle, sham+PCI34051 (10 mg/kg bodyweight/day), TAC+vehicle, TAC+PCI34051 (3 mg/kg bodyweight/day), TAC+PCI34051 (10 mg/kg bodyweight/day), and TAC+PCI34051 (30 mg/kg bodyweight/day). PCI34051 was intraperitoneally administered daily for 2 weeks. All animals were sacrificed using CO₂。

2.3。超声心动图

评价左心室功能,使用生动的S5进行超声心动图系统(美国通用电气医疗集团,芝加哥,IL)配备一个13兆赫线性阵列传感器如前所述[28]。在心功能测量之前,老鼠被腹腔注射麻醉三溴乙醇(三溴乙醇;114毫克/公斤体重)。M-mode(二维)图像和参数从的烈度衰减视图获得左心室乳头肌的水平。

2.4。组织学分析和Picrosirius红染色

老鼠心脏组织与3.7%多聚甲醛固定石蜡和嵌入。石蜡包埋组织切成4μ米厚的部分。部分是deparaffinized二甲苯,水化分级酒精系列,被苏木精和伊红染色())来测量心肌细胞在心肌组织的大小31日]。量化的细胞大小使用NIS元素执行软件(尼康Eclipse 80我显微镜下,日本东京)。

Picrosirius红色(Abcam)染色进行评估心脏纤维化。患者心脏组织都沾染了Picrosirius红色解决方案1 h。样品很快就洗两次以0.5%醋酸溶液和无水酒精冲洗1分钟。部分的安装与加拿大香脂和使用显微镜成像(尼康、东京、日本)在400 x放大。

2.5。隔离和细胞培养的主要新生儿心脏成纤维细胞

从大鼠心脏成纤维细胞分离新生儿心(15幼崽)(32]。短暂,心房被移除,使用剪刀切碎,并消化0.1%胶原酶二世在1×广告缓冲(116毫米氯化钠,20毫米玫瑰,10毫米不₂阿宝₄,5.5毫米葡萄糖,5毫米氯化钾,0.8毫米MgSO₄)在37°C和120 rpm瓶2 h。细胞中和使用胎牛血清(的边后卫,最终浓度10%)和离心机在1200转3分钟。成纤维细胞培养在杜尔贝科修改鹰中补充了10%的边后卫和1×antibiotic-antimycotic解决方案在孵化器37°C。通道2成纤维细胞用于实验。心脏成纤维细胞与TGF -进行预处理β1 (10 ng / mL) 1 h和培养的车辆(0.1%二甲亚砜(DMSO))或PCI34051 (10μ米)8 h。调查的角色Hdac8或纤维化傻乎乎,成纤维细胞转染与控制short-interfering RNAs (si-RNAs)或siRNAs反对Hdac8(si-Hdac8)或si-Ace1和孵化TGF -β1 (10 ng / mL) 9 h。

2.6。定量实时聚合酶链反应(存在)

从心脏组织总rna分离使用试剂盒试剂(表达载体和生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)。RNA浓度决定通过测量样品的吸光度在260和280纳米波长的。孤立的RNA (1μg) reverse-transcribed成互补DNA使用TOPscript RT DryMIX (Enzynomics、大田、韩国)。存在使用SYBR绿色PCR分析工具和特定的引物。使用2相对mRNA水平测定^−∆∆Ct方法。中使用的引物序列中存在分析补充表所示1。

2.7。西方墨点法

总蛋白质是孤立于心脏和肺组织使用radioimmunoprecipitation分析缓冲(如前所述28]。蛋白质浓度测定使用bicinchoninic蛋白质化验设备。等量的蛋白质受到钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳。解析后的蛋白质被转移到一个聚乙二烯二氟化物膜(孔隙大小:0.45μm;美国默克密理博,MA)。5%脱脂牛奶的膜被Tris-buffered盐水含有Tween-20 (TBST)(20毫米三、200毫米氯化钠和0.04%渐变20)1 h 25°C和探测与主抗体(1:1000)在一夜之间在4°C。接下来,膜清洗三次TBST 5分钟和孵化anti-rabbit或anti-mouse辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:3000)1 h 25°C。免疫反应性的信号检测使用止动剂免疫印迹检测试剂(EMD微孔,Billerica,妈,美国)。蛋白质的强度乐队使用ImageJ量化软件(https://imagej.net/)。

2.8。转染

过度表现Hdac8 H9c2细胞转染了1.6μ克pCMV-HA-myc或pCMV-Hdac8-HA-myc质粒2天使用Lipofectamine和加试剂,遵循制造商的指示。此外,H9c2细胞转染与1.6μ克pCMV6-SPORT6或pCMV6-SPORT6-Ace1质粒2天过度表现傻乎乎。的pCMV6-SPORT6-Ace1克隆是人类基因从朝鲜获得银行,医学基因组学研究中心,KRIBB、韩国。

来击倒Hdac8或傻乎乎,H9c2细胞转染100海里控制siRNAs(猫没有。sn - 1003, Bioneer、大田、韩国),si-Hdac8(猫没有。l - 096589 - 02 - 0005 Dharmacon,拉斐特有限公司,美国),或者si-Ace1(产品名称24310年,Bioneer)使用RNAiMAX试剂。

核序列如下:控制意义,5 - - - - - -ACG CCA AUU情事属实者,超声心动图u - 3和控制反义,5 - - - - - -ACG AAA UUG贵港市GCG UAG三大 ;si-Ace1 # 1, 5 - - - - - -中联科利AGU的AAU棉酚GCC UAC a - 3 ;si-Ace1 # 2 5 - - - - - -标出UUG ACG佐治亚大学GCA ACU u - 3 ;si-Ace1 # 3, 5 - - - - - -8月ACA AAC CCA ACC的煤炭u - 3 ;si-Hdac8 # 1: 5 - - - - - -8月UAG AAU广汽UAG GUU a - 3 ;si-Hdac8 # 2 5 - - - - - -以高斯CCA 8月UGC UCC UUU a - 3 ;si-Hdac8 # 3, 5 - - - - - -CAG标出8月GUC CUG AUU a - 3 ;和si-Hdac8 # 4: 5 - - - - - -CAG亚美大陆煤层气有限公司GGA UAU UUG ACU a - 3 。

2.9。核和胞质蛋白提取

使用TNF H9c2细胞α(50 ng / mL) 1 h与车辆(0.1% DMSO)或孵化PCI34051 (10μ米)5 h。胞质提取准备使用低渗的裂解缓冲(10毫米玫瑰(pH值7.9),10毫米氯化钾,EDTA 10毫米,1毫米二硫苏糖醇(德勤)IGEPAL 0.4%和1×蛋白酶抑制剂)。10分钟的提取孵化在冰摇臂和离心机13000 rpm和4°C 5分钟。上层清液被存储为胞质提取物。核颗粒在高盐缓冲resuspended(10毫米玫瑰(pH值7.9),400毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米德勤,和1×蛋白酶抑制剂)和孵化在冰上旋转瓶2 h。样本离心机在13000 rpm和4°C 5分钟获得核提取物。

2.10。统计分析

所有数据被表示为 。两组的方式使用学生的比较 - - - - - -测试,而三个或更多的团体使用单向方差分析比较,后跟一个Bonferroni多重比较检验。差异被认为是重要的 。所有统计分析使用GraphPad棱镜8.0.2版本(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。

3所示。结果

3.1。PCI34051减轻心脏肥大和恢复心脏功能TAC-Induced心脏衰竭小鼠模型

心脏肥大往往伴随着高血压和心力衰竭(33,34]。我们调查的影响,不同浓度的PCI34051(3、10和30毫克/公斤体重/天),一个HDAC8选择性抑制剂,同时使用TAC-induced心脏肥大心脏衰竭小鼠模型。时间轴的实验图所示1(一)。心脏大小TAC组显著高于在虚假的组。治疗的剂量PCI34051 10毫克/公斤体重/天并不影响心脏weight-to-bodyweight (HW / BW)比虚假的组。相比之下,所有三个剂量的PCI34051显著减轻TAC-induced增强HW / BW比率。HW / BW比率在PCI34051治疗组剂量30毫克/公斤体重/天是低于治疗组与PCI34051剂量的3和10毫克/公斤体重/天(图1 (b))。

接下来,心肌细胞的大小H&E-stained心脏组织检查。vehicle-treated之间的横截面积没有明显不同的骗局和PCI34051-treated虚假的团体。然而,PCI34051剂量依赖性降低TAC-treated组心肌细胞的横截面积(数字1 (c)和1 (d))。此外,存在数据1 (e)和1 (f))和免疫印迹(数字1 (g)- - - - - -1(我))分析表明,mRNA和蛋白表达水平的心脏肥厚性标记Nppa和Nppb TAC + PCI34051(3、10个或30毫克/公斤体重/天)组表达下调与未经处理的TAC组相比。

接下来,PCI34051对心脏功能的影响是使用超声心动图评估。在第6周post-TAC,左心室腔扩大,左心室壁增厚,心脏功能明显降低(补充图1)。内部尺寸收缩末期左心室内部尺寸(LVIDs)和左心室舒张末期(LVIDd)并不影响假组8周后(6周的TAC PCI34051 + 2周的剂量10毫克/公斤/天)。然而,PCI34051剂量依赖性管理减轻TAC-induced增强LVIDs和LVIDd(数字1 (j)- - - - - -1(左))。PCI34051效果的剂量30毫克/公斤体重/天高于PCI34051剂量的3和10毫克/公斤体重/天。部分缩短(FS)、射血分数(EF) TAC组明显减少。然而,PCI34051剂量依赖性增加FS和EF(数字1(米)和1 (n))。

3.2。PCI34051调节老城TAC小鼠的基因

心力衰竭的特点是神经激素激活(35,36]。在这项研究中,我们调查的影响在老城PCI34051 mRNA表达水平的评估傻乎乎,Ace2,Agtr1,Agtr2在心脏和肺组织。PCI34051剂量依赖性降低,TAC-induced upregulation傻乎乎信使rna水平(图2(一个)的差别),对这些Ace2信使rna水平在心脏组织(图2 (b))。类似的傻乎乎和Ace2表达模式观察肺组织(数字2 (c)和2 (d))。傻乎乎的表达水平下调在虚假的心脏组织。然而,TAC显著调节傻乎乎的水平,明显减轻PCI34051治疗。PCI34051减轻心脏组织中的Ace2水平差别TAC-induced对这些(数据2 (e)- - - - - -2 (g))。类似傻乎乎和Ace2表达模式在肺组织观察(数字2 (h)- - - - - -2 (j))。存在分析表明PCI34051减轻TAC-induced upregulationAgtr1信使rna水平,心脏和肺组织。相比之下,PCI34051减轻的差别TAC-induced对这些Agtr2信使rna水平(数据2 (k)- - - - - -2 (n))。

3.3。PCI34051会使Hdac8的表达,在TAC小鼠炎症标记物

先前的研究已经报道,HDAC8参与心脏肥大的感应28,29日]。我们假设通过HDAC8抑制心脏衰竭也可以缓解。为了验证这一假设,mRNA水平的类我hdac (Hdac1,Hdac2,Hdac3,Hdac8)测定在TAC小鼠。TAC并不影响心脏和肺的水平Hdac1,Hdac2,Hdac3(补充图2)。然而,TAC显著调节心脏Hdac8信使rna水平。PCI34051剂量依赖性降低,TAC-induced upregulation心脏Hdac8信使rna水平(图3(一个))。调节炎症生物标记物水平的报道导致心脏衰竭(37]。因此,PCI34051对炎性标志物表达的影响。PCI34051剂量依赖性降低,TAC-induced upregulation心脏Il1b,Ccl2,Rela信使rna水平(数据3 (b)- - - - - -3 (d))。此外,PCI34051减轻心脏的差别TAC-induced对这些Nfkbia信使rna水平(图3 (e))。TAC的影响和PCI34051表达模式Hdac8和炎症相关的基因在心脏组织中类似肺组织(数字3 (f)- - - - - -3 (j))。免疫印迹分析表明PCI34051剂量依赖性降低TAC-induced upregulation Hdac8, Ccl2, Rela心脏和肺组织中,与存在分析结果(数据是相一致的3 (k)- - - - - -3 (t))。PCI34051减轻Nfkbia的差别TAC-induced对这些(数据3 (o)和3 (t))。

3.4。在TAC小鼠PCI34051抑制心肌纤维化

先前的研究已经报道,间质心脏纤维化导致心力衰竭的发展(38]。PCI34051在心脏纤维化的治疗效果是使用Picrosirius红染色检查,存在,免疫印迹分析。如数据所示4(一)河畔4 (b),TAC提升胶原蛋白沉积在心脏的血管周围和间质区域。PCI34051剂量依赖性降低TAC-induced胶原蛋白的积累。心脏fibrosis-related基因的表达水平Col1a1,Fn1,Acta2,Tgfb1TAC组调节相比,这些虚假的组。治疗PCI34051显著下调这些基因的表达(数字4 (c)- - - - - -4 (f))。免疫印迹分析的结果是一致的与存在分析(数据4 (g)- - - - - -4 (j))。TGF -β据报道,1 / Smad2/3信号诱导纤维化的基因表达(39]。因此,磷酸化Smad2/3被检查的水平。治疗与PCI34051减轻TAC-induced upregulation心脏p-Smad2/3水平(数字4 (g)和4 (k))。

3.5。在TAC小鼠PCI34051减轻肺充血和纤维化

心脏衰竭促进病理肺改造(40]。PCI34051 TAC-induced肺上重建的效果是使用组织学检查的,存在,免疫印迹分析。LW / BW比率在TAC组高于骗局。PCI34051显著和剂量依赖性减轻TAC-induced增强LW / BW比率(图5(一个))。他走时染色显示肺组织肺泡空间没有显著vehicle-treated骗局和PCI34051-treated虚假的团体之间的不同。PCI34051减轻TAC-induced减少肺泡空间(图5 (b))。接下来,肺纤维化是评估使用Picrosirius红染色。PCI34051治疗剂量依赖性降低TAC-induced肺纤维化(Figurse5 (c)和5 (d))。为了进一步描述肺纤维化,fibrosis-related标记的表达水平检测使用中存在和免疫印迹分析。PCI34051显著减轻TAC-induced upregulationCol1a1,Fn1,Acta2,Tgfb1信使rna水平(数据5 (e)- - - - - -5 (h))。肺Fn1水平、Acta2 Tgfb1,磷酸化Smad2/3 TAC组调节相比,这些虚假的组。然而,PCI34051减轻TAC-induced upregulation Fn1, Acta2, Tgfb1,磷酸化Smad2/3肺组织(数字5(我)- - - - - -5(米))。

3.6。击倒的Hdac8或傻乎乎抑制TGF -β1-Mediated纤维化在初级鼠心脏成纤维细胞

心脏衰竭往往伴随着纤维化过程的特点是生产过剩激活成纤维细胞的细胞外基质(41,42]。检查HDAC8在纤维化体外的规定,主要鼠心脏成纤维细胞的存在与否与PCI34051孵化TGF -β1。PCI34051显著减轻TGF -β1-induced upregulation的Hdac8信使rna水平(图6(一))。此外,PCI34051减轻TGF -β1-induced upregulation fibrosis-related的基因Col1a1,Fn1,Acta2(数据6 (b)- - - - - -6 (d))。TGF -β1治疗调节的表达Tgfb1(图6 (e))。免疫印迹分析的结果是一致的(图中存在的分析6 (f)- - - - - -6 (j))。此外,PCI34051减轻TGF -β1-induced upregulation磷酸化Smad2/3水平(数字6 (f)和6 (k))。

确定TGF -β1-induced纤维化是依赖HDAC8,我们用si-Hdac8转染H9c2细胞。转染内生si-Hdac8明显下调Hdac8信使rna水平(图6(左))和减轻TGF -β1-induced upregulation的Fn1,Acta2,Tgfb1(数据6 (m)- - - - - -6 (o)),傻乎乎信使rna水平(图6 (p))。免疫印迹分析的结果是一致的与存在分析(数据6(问)- - - - - -6 (v))。此外,与si-Hdac8减轻TGF -转染β1-induced upregulation磷酸化Smad2/3水平(数字6(问)和6 (w))。

接下来,傻乎乎的角色在纤维化研究下调用siRNAs傻乎乎的表情。转染内生si-Ace1明显下调傻乎乎信使rna水平,而治疗TGF -β1调节傻乎乎信使rna水平在大鼠心脏成纤维细胞(补充图3A)。此外,转染与si-Ace1减轻TGF -β1-induced upregulation的Hdac8,Fn1,Acta2,Tgfb1(补充图mRNA水平3抵扣)。免疫印迹分析的结果是一致的与存在的分析(补充图3f - k)。此外,转染磷酸化水平si-Ace1明显下调的Smad2/3 TGF -β1-stimulated成纤维细胞(补充图3F和L)。

3.7。心脏炎症通过Hdac8-Ace1-Rela-Nfkbia轴调节

阐明PCI34051的监管机制,Hdac8和傻乎乎的角色在炎症检查。H9c2心肌细胞的转染pCMV或pCMV-Hdac8构造。Hdac8过度调节Hdac8和傻乎乎信使rna水平和表达下调Ace2信使rna水平。NF -κ据报道,B信号通路发挥关键作用在各种炎性疾病43]。Hdac8超表达显著调节Rela信使rna水平和表达下调Nfkbia信使rna水平(图7(一))。接下来,使用核Hdac8被撞倒的表达。转染与si-Hdac8显著降低内生Hdac8信使rna水平,但没有影响傻乎乎和Ace2信使rna水平。此外,与si-Hdac8转染表达下调Rela信使rna水平和调节Nfkbia信使rna水平(图7 (b))。调查傻乎乎的作用,细胞转染pCMV6或pCMV6-Ace1构造。傻乎乎过度调节内源性傻乎乎的水平和表达下调Ace2的水平。然而,傻乎乎超表达并不影响Hdac8水平。此外,傻乎乎超表达显著调节Rela水平和表达下调Nfkbia水平(数字7 (c)和7 (d))。与此同时,傻乎乎可拆卸的表达下调内生傻乎乎信使rna水平和调节Ace2信使rna水平。然而,傻乎乎可拆卸的并不影响Hdac8信使rna水平但显著调节Nfkbia信使rna水平(图7 (e))。评估的影响Hdac8击倒isoproterenol-induced炎症,H9c2心肌细胞转染了控制核或si-Hdac8与异丙肾上腺素治疗。转染si-Hdac8并不影响傻乎乎和Ace2信使rna水平。此外,si-Hdac8减轻isoproterenol-induced upregulation傻乎乎的差别,对这些基因的mRNA水平Ace2(补充图mRNA水平4a - b)。此外,si-Hdac8减轻isoproterenol-induced upregulationRela的差别,对这些基因的mRNA水平Nfkbia信使rna水平(数据7 (f)和7 (g))。接下来,傻乎乎的角色在HDAC8-mediated炎症反应是检查。H9c2细胞转染pCMV-Hdac8构造和si-Ace1。与si-Ace1并不影响转染Hdac8水平,建议傻乎乎是Hdac8的下游基因。Hdac8过度减轻si-Ace1-induced upregulation Ace2。此外,si-Ace1减轻Hdac8 overexpression-induced Rela upregulation和(差别Nfkbia对这些数字7 (h)和7(我))。分析HDAC8和炎症之间的关系,H9c2细胞孵化与PCI34051 TNF的存在与否α。NF -的本地化κB(核与胞质)评估。治疗与肿瘤坏死因子-α不影响傻乎乎的本地化和Hdac8核本地化的分数。PCI34051减轻TNF -α全身upregulation核胞质Nfkbia水平差别Rela水平和对这些(数据7 (j)和7 (k))。这些发现表明PCI34051产生心血管效应的差别通过对这些NF -κB信号通路。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现选择性HDAC8抑制剂(PCI34051)缓解病理心脏病和肺癌,减轻心脏功能障碍,抑制炎症和纤维化在TAC小鼠Hdac8-Ace1轴(图8)。

Hdac8的心脏和肺表达水平,但不是其他类我hdac (HDAC1、HDAC2 HDAC3)在TAC小鼠调节。这提出了一个截然不同的角色HDAC8在心力衰竭的规定。傻乎乎的表达水平和Agtr1调节,而那些Ace2和Agtr2 TAC小鼠的心脏和肺组织中表达下调。治疗与TAC-induced PCI34051减轻这些基因的表达水平的变化,这表明HDAC8提升老城的激活在心力衰竭。Hdac8过度调节傻乎乎Agtr1水平和表达下调Ace2 Agtr2水平在心肌细胞(图7(一)和补充图5)。先前的研究已经报道,老城被激活在心力衰竭患者44]。然而,老城组件的直接作用在心力衰竭的发病机制尚不清楚。本研究表明,过度的傻乎乎,Hdac8调节心肌细胞的炎性标志物的表达,这是减轻傻乎乎可拆卸的。傻乎乎和ACE2在炎症发挥重要作用[45,46]。因此,傻乎乎的表达水平和Ace2在TAC-induced检查小鼠模型。超表达Hdac8或傻乎乎的表达下调Ace2的水平,这表明Hdac8 Ace2表达的是一种新型的负监管机构。

最近,我们报道,PCI34051变弱catecholamine-induced心脏肥大(28]。在这项研究中,PCI34051剂量依赖性缓解心脏肥大和表达下调hypertrophy-specific基因的表达(Nppa和Nppb在TAC小鼠的心脏组织。TAC小鼠模型的特点是减少收缩功能和心脏衰竭的发展减少了EF (47]。PCI34051调节心脏重构(增加左心室腔的大小),从而改善心脏功能。心力衰竭通常是伴随着心脏肥大。HDAC2的角色,这是最好的HDAC特征,在心脏肥大之前已经报道过了20.- - - - - -22,48,49]。例如,sk - 7041,一个高度的选择性抑制剂HDAC1 HDAC2,减轻心肌肥厚大鼠TAC模型(23]。尽管HDAC2和HDAC8促进心脏肥大,底层的机制可能不同。HDAC2据报道的酶活性是至关重要的发展心脏肥大(21),而upregulation HDAC8表达促进心脏肥大是至关重要的。此外,心脏Hdac2和Hdac8表达水平调节在肾血管性高血压大鼠的心脏重塑过程中50]。一项研究报道,HDAC1的表达水平,HDAC2, HDAC8调节特发性肺动脉高血压患者(51]。张等人报道,钙钙调蛋白激酶ⅱ促进心脏功能障碍通过激活HDAC1和HDAC352]。然而,这些结果并不符合一些先前的研究,相关报道,HDAC3在产后心脏肌细胞增殖,而不是心脏肥大26]。本研究的结果表明,持续upregulation Hdac8 mRNA和蛋白水平有重要作用的过渡从心脏肥大心脏衰竭。

接下来,炎症相关的基因的表达水平在TAC小鼠的心脏和肺组织检查。TAC调节Rela水平和表达下调Nfkbia水平。治疗PCI34051减轻Rela upregulation和体内和体外差别Nfkbia对这些。此外,PCI34051减轻肿瘤坏死因子α全身核本地化Rela傻乎乎,Hdac8 Nfkbia的差别,对这些细胞溶质的心肌细胞。这些发现表明,PCI34051施加对炎症信号抑制的影响。有趣的是,的表达水平Rela和Nfkbia不影响TGF -β1-stimulated心脏成纤维细胞(补充图6)。以前,我们已经表明,PCI34051下调炎症标记物和粘附分子的表达在高血压27]。WK2-16 HDAC8抑制剂,据报道,在体内和体外都减轻神经炎症(53]。CCL2,炎症细胞因子,在心力衰竭的发病机制中扮演了重要的角色(54]。在这项研究中,PCI34051减轻心脏引起upregulation Ccl2。

此外,Picrosirius红染色结果显示PCI34051剂量依赖性减轻TAC-induced老鼠心脏和肺组织纤维化。这表明HDAC8纤维化的治疗目标是一个潜在的小说。TGF -β1、纤维增生生长因子调节的表达Hdac8和fibrosis-related基因。Tgfb1的表达水平和磷酸化Smad2/3调节在TAC小鼠和TGF -β1-treated心脏成纤维细胞。antifibrotic效应PCI34051或Hdac8可拆卸的可能是通过抑制TGF -介导的β1-Smad2/3途径。有趣的是,TGF -β1-induced纤维化是依赖傻乎乎。Fn1的表达水平和Acta2 TGF -表达下调β1-treated傻乎乎可拆卸的心脏成纤维细胞(补充图3)。此外,傻乎乎的信使rna和蛋白质水平显著调节TAC小鼠的心脏和肺组织。这些观察表明,老城的激活导致压力overload-induced纤维化。本研究的结果是一致的与那些在以前的报道,报道,傻乎乎是调节和ACE2表达下调在bleomycin-induced肺纤维化(55]。

心肌细胞治疗与放线菌素D,转录抑制剂,来阐明机制Hdac8 overexpression-mediated upregulation傻乎乎,Rela downregulation Ace2与Nfkbia和调节炎症和纤维化。放线菌素D减轻Hdac8 overexpression-induced upregulation傻乎乎,Rela。这表明Hdac8调节傻乎乎的表达水平,Rela在转录水平(补充图7)。

5。结论

本研究证明了HDAC8选择性抑制剂PCI34051缓解心脏肥大,肺充血、炎症、纤维化,导致心脏功能改善overload-induced心脏衰竭小鼠模型的压力。在课上我hdac中,只有Hdac8是调节心脏和肺组织的心脏衰竭小鼠模型。此外,这项研究表明,Hdac8和傻乎乎的促炎Rela通路和fibrosis-related TGF -β1-Smad2/3途径。因此,HDAC8心脏衰竭的小说是一个潜在的治疗目标。

6。研究的局限性

在这里,我们表明,选择性HDAC8抑制剂PCI34051缓解心力衰竭。然而,PCI34051在其他类型的hdac抑制效应的可能性不能排除。因此,未来的研究必须确认PCI34051在心力衰竭的治疗效果使用Hdac8基因敲除小鼠模型。此外,我们使用了心肌细胞细胞系来确定Hdac8或傻乎乎的影响过度炎症相关的基因的表达。通过一种蛋白激酶/ GSK3 HDAC8调节心脏肥大β通路,在这项研究中调查。此外,本研究使用了H9c2 TGF -细胞系调查机制β1-induced纤维化。与原发性心肌细胞相比,H9c2细胞不跳动的细胞。然而,H9c2肥厚性反应的细胞类似于主要的心肌细胞。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括补充信息文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

TZ执行实验,包括TAC手术,超声心动图,存在,免疫印迹和组织学分析。HJK构思和设计研究和准备手稿。SJK MHJ提供试剂和校对的手稿。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。

确认

本研究支持的基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(NRF - 2021 r1i1a3045431)。

补充材料

补充图1:超声心动图参数在第6周posttransverse小鼠主动脉收缩(TAC)。(一)超声心动图参数在老鼠属于虚假,在星期6 post-TAC TAC组。量化的(A)左心室内部直径end-systole (LVIDs,毫米),(B)左心室内部直径end-diastole (LVIDd,毫米),(C)室间隔(IVSd,毫米),(D)左心室后壁厚度(LVPWd,毫米),(E)部分缩短(FS, %)和(F)射血分数(EF %), ( 6)。数据了 和分析使用单向方差分析,其次是Bonferroni事后测试。补充图2:心脏和肺类我组蛋白去乙酰酶抑制剂的信使rna表达水平(hdac)横向主缢痕(TAC)老鼠。心脏(a - c)和肺(D-F) mRNA水平Hdac1,Hdac2,Hdac3的骗局,TAC, TAC + PCI34051(3、10个或30毫克/公斤体重/天)组检查使用定量实时聚合酶链反应。目标基因的表达水平是规范化的Gapdh。数据了 和分析使用单向方差分析,其次是Bonferroni事后测试。补充图3:傻乎乎降价会使fibrosis-related基因的表达主要鼠心脏成纤维细胞。(安妮)大鼠心脏成纤维细胞转染与控制或short-interfering rna傻乎乎(si-Ace1)与TGF -孵化β1。的mRNA水平傻乎乎,Hdac8,Fn1,Acta2,Tgfb1使用定量实时聚合酶链反应测定。(F-L)代表的屁股和傻乎乎的量化,Hdac8, Fn1, Acta2, Tgfb1 p-Smad2/3, Smad2/3水平的心脏组织。Actb被用作加载控制。数据了 和分析使用单向方差分析,其次是Bonferroni事后测试。补充图4:Hdac8击倒调节傻乎乎和Ace2 mRNA水平isoproterenol-treated H9c2细胞。(A, B) H9c2细胞转染与控制或short-interfering rnaHdac8与异丙肾上腺素(si-Hdac8)孵化。的mRNA水平傻乎乎和Ace2使用定量实时聚合酶链反应测定。目标基因的表达水平是规范化的Gapdh。数据了 使用单向方差分析和分析,Bonferroni紧随其后事后测试。补充图5:Hdac8超表达上调Agtr1,会使Agtr2 H9c2细胞。(A, B) H9c2细胞转染空向量或一个pCMV-Hdac8构造。的mRNA水平Agtr1和Agtr2使用定量实时聚合酶链反应测定。补充图6:PCI34051治疗或Hdac8傻乎乎击倒并不影响Rela Nfkbia和鼠心脏成纤维细胞的表达。(a - b)大鼠心脏成纤维细胞对车辆或PCI34051 TGF -的存在与否β1。的mRNA水平Rela和Nfkbia确定使用定量实时聚合酶链反应(存在)。与控制或(c - d)大鼠心脏成纤维细胞转染short-interfering rnaHdac8(si-Hdac8)处理TGF -β1。的mRNA水平Rela和Nfkbia确定使用中存在。(E-F)大鼠心脏成纤维细胞转染与控制或治疗si-Ace1 TGF -β1。的mRNA水平Rela和Nfkbia确定使用中存在。给出的数据 使用单向方差分析和分析,Bonferroni紧随其后事后测试。补充图7:Hdac8调节傻乎乎,Rela在转录水平的表达。(−E) H9c2细胞转染和向量pCMV-Hdac8治疗与放线菌素D(2.5吗μg / mL) 6 h。的mRNA水平Hdac8,傻乎乎,Ace2,Rela,Nfkbia使用定量实时聚合酶链反应测定。数据了 使用单向方差分析和分析,Bonferroni紧随其后事后测试。补充表1:rt - pcr引物。(补充材料)