Olaparib:从实验克罗恩病临床应用PARP抑制剂保护和维护屏障完整性通过改善生物能疗法通过拯救在结肠上皮细胞糖酵解

文摘

克罗恩病(CD)是一种炎症性疾病的肠上皮屏障功能障碍和粘膜损伤的特征。保利(ADP-ribose)的活动polymerase-1 (PARP-1)是深入参与炎症的pathomechanism因为它导致能源枯竭和细胞内线粒体的失败。专注于上皮细胞的上皮屏障完整性和生物能疗法,我们调查是否临床应用PARP抑制剂olaparib可能改善实验CD。我们使用了口服PARP抑制剂olaparib 2, 4, 6-trinitrobenzene磺酸- (TNBS)诱导小鼠结肠炎模型。炎症评分、细胞因子水平,结肠组织学、血液分析、和肠道渗透性进行了研究。Caco-2单层培养是利用作为上皮屏障模型,我们使用qPCR和光学显微镜成像,并测量impedance-based屏障的完整性,FITC-dextran渗透率、细胞凋亡、线粒体耗氧率,和细胞外酸化率。Olaparib减少炎症评分,il - 1的浓度β和il - 6、il - 10的水平,增强和降低TNBS-colitis肠道通透性。血液细胞比率,如淋巴细胞,单核细胞比率,血小板,淋巴细胞比率,嗜中性粒细胞和淋巴细胞比率提高了。在H₂O₂对待Caco-2单层,olaparib形态变化,降低屏障通透性,保护屏障的完整性。在氧化应激,olaparib增强糖酵解(细胞外酸化率),它改善线粒体功能(线粒体耦合效率、最大呼吸和呼吸产能闲置)在上皮细胞。Olaparib, PARP抑制剂用于人类癌症治疗,改善实验CD和保护肠道屏障的完整性,防止其充满活力的崩溃;因此,它可以被用来治疗克罗恩病。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)是一种慢性和不懈的肠道炎性疾病。超过100万居民在美国和欧洲的大约250万名患有炎症性肠病,和它的发病率是永久上升1]。IBD展品两种主要形式,即溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)和它出现在冲突和缓解阶段(2]。尽管加州大学和CD是两种截然不同的形式的炎症性肠病,他们分享上皮屏障功能障碍的现象。障碍失败往往导致肠道通透性增加,一个条件称为“肠漏”(3]。在这个障碍,肠道微生物群可以直接进入结肠组织和诱导免疫细胞的激活导致慢性炎症(4,5]。肠道通透性增加的发起者不是清楚地阐明,但它通常是建议增加渗透率是改变能量代谢的结果和肠道上皮细胞的线粒体功能障碍(IEC) (6]。与conplastic鼠标菌株为例,调查,共享相同的核基因组但有不同的线粒体基因组,证明这些老鼠高粘膜呼吸链活动和ATP浓度升高开发不如那些激烈的结肠炎生产小数量的粘膜ATP (7]。在CD患者中,增加回肠黏膜渗透性是伴随着线粒体肿胀和ATP浓度下降(8]。此外,复杂的活动二世(CII)线粒体电子传递链的一部分(等),发现被废除的UC患者结肠(9]。另一组发现低水平的CI和文明在IBD患者与对照组相比,还测量了低ATP浓度(10]。此外,增强乳酸水平被发现在CD患者与健康人相比,这与疾病活动(11]。所有这些结果表明线粒体功能障碍,干扰氧化磷酸化和增强糖酵解活性的粘膜炎症性肠病病人。

在生理条件下,iec用丁酸作为主要能源来源(12]。丁酸盐是由几个种类的微生物群,它是在iec通过异化β氧化和柠檬酸循环(CAC) [13- - - - - -15]。此外,脱氢酶的分解代谢的途径减少河畔⁺和时尚NADH + H⁺和FADH₂促进减少线粒体呼吸链的CI和人民16]。此后,CI、CIII和文明的质子泵内膜对面的矩阵膜间隙提高质子梯度(16]。等年底文明消费O₂并降低H₂o .最后,质子梯度驱动F_OF₁ATP酶,从ADP和ATP的P_我(16]。

然而,在炎症、线粒体功能障碍和mitochondria-derived ROS增加。在这种情况下,iec开关的代谢氧化磷酸化(OXPHOS)有氧糖酵解(13,17]。在有氧糖酵解,葡萄糖转换乳酸没有耗氧量,虽然足够的氧气存在于细胞(18]。在这种情况下,糖酵解产生ATP和,作为一个副产品,由丙酮酸合成乳酸是由乳酸脱氢酶(17]。由于线粒体活性氧的主要来源(19),分解代谢的通路通过糖酵解和乳酸脱氢酶绕过了线粒体和线粒体ROS不提要生成(20.]。因此,细胞关闭线粒体保护自己免受线粒体ROS (21]。这个概念被发现加强促炎细胞因子(TNF -α,il - 1β和干扰素-γ)增加了大鼠肠上皮细胞的糖酵解率,也引发了ATP营业额(22]。也c . rodentium有氧糖酵解和诱发小鼠感染增强sodium-glucose运输车4和乳酸脱氢酶a的水平同时,酶CAC和OXPHOS表达下调(23]。最重要的是,一个强大的表达糖酵解酶被发现在IBD患者的结肠24]。在活跃的CD,乳酸水平与对照组相比显著升高(11]。因此,在结肠炎,有氧糖酵解成为ATP的主要来源。然而,在严重的炎症,激活酶的聚(ADP-ribose) -polymerase-1 (PARP-1)块糖酵解25),即。,我t terminates the “last safe way” of energy production and forces the cells along the death pathway causing strong mucosal damage with severe ulceration and compromised barrier function.

PARP-1一直参与癌症发展和炎症。因此,PARP-1^{- / -}老鼠保护在2、4、6-trinitrobenzene磺酸- (TNBS)诱导结肠炎(26)和药理抑制剂PARP-1改善葡聚糖钠sulfate-induced [27和TNBS-induced结肠炎28在啮齿动物)。PARP-1激活DNA损伤和催化polyADP-ribosylation使用NAD (PARylation)众多核蛋白质⁺作为底物(29日]。这个过程是一个部分的DNA损伤反应导致DNA修复酶的激活(30.]。然而,过度的PARP激活可以完全耗尽河畔⁺池,使细胞能量代谢不可能(31日]。几行证据证明PARP激活不仅耗尽河畔⁺池也抑制了己糖激酶的酶,这种酶催化糖酵解的第一步(25]。因此,抑制糖酵解无法养活CAC与乙酰辅酶a(由丙酮酸脱氢酶糖酵解成品丙酮酸),和CAC不能减少河畔⁺和时尚喂养线粒体等OXPHOS [32),因此PARP-induced线粒体功能异常产生,至少部分,从基质流量的减少糖酵解CAC等(25]。以后,在严重的结肠炎,糖酵解是ATP的主要来源(因为线粒体关闭)(21),同时也抑制了糖酵解PARP (25],iec与精力充沛的崩溃,他们不得不面对失去形成一个强大的能力和连续障碍(7]。

在目前的研究中,我们调查是否olaparib, PARP抑制剂用于治疗人类癌症,有有益的影响在CD小鼠模型,因此,它是否可以被用来治疗CD。要回答这个问题,我们应用期间olaparib TNBS-induced实验性结肠炎模型。此外,由于iec的第一道防线的结肠癌和障碍中断是IBD的标志,我们使用Caco-2结肠上皮细胞屏障功能和能源生产调查在体外。

2。材料和方法

2.1。动物和实验性结肠炎

男性CD1小鼠(美国杰克逊实验室,巴尔港,我)在SPF动物培育和维护设施部门的免疫学和生物技术,佩奇大学医学院。6 - 8周时,他们被运到我们的动物房设施和标准化的情况下适应了两周。标准实验室食物和水随意。实验过程是动物研究审查委员会批准佩奇大学医学院(许可证号码:BA02/2000-4/2017)。结肠炎的实验中,我们使用车辆(阿明费),TNBS, TNBS + olaparib (TNBS + olap)治疗组。总共72只动物被使用;1只老鼠死于实验前的评估。在我们的实验环境中,每组包含3 - 9的动物。我们执行3独立实验包括总共9 VEH 26 TNBS 9 olaparib TNBS + 20毫克,27 TNBS + 50毫克olaparib)。年龄(8 - 10周),sex-matched(男性),和bodyweight-matched (30 - 40 g)动物被随机分为组技术员。 During the experiments, mice were individually housed to avoid aggressive behavior. Individual housing was approved by the Animal Research Review Committee of the University of Pécs. The experimental period lasted in total for 4 days (Figure1(一))。第一天,olaparib治疗开始(预处理),之后,我们每天服用一次3次(因此,总的来说,我们执行4 olaparib治疗)。0天,动物对待TNBS(1丸)和3天,小鼠麻醉和安乐死。Olaparib (AZD2281 MedChemExpress,新泽西,美国)是管理腹腔内注射(单)前一天TNBS挑战,其次是日常管理为3天的剂量20或50毫克/公斤体重。应用剂量的olaparib选择基于文献数据(33]。车辆组包含4% DMSO溶液和30% PEG300无菌蒸馏水。12小时禁食后,老鼠和5%异氟烷麻醉(匈牙利百特有限公司,布达佩斯,匈牙利)在麻醉室100%的氧气。结肠炎是由一个感应intracolonic注入TNBS 100年(4毫克μl 30%的乙醇;Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)通过导管插入3厘米到结肠。VEH组同等体积的30%乙醇。在实验和动物体重每天牺牲后72小时TNBS管理。老鼠和5%异氟烷麻醉和斩首轻轻地专用手术剪刀收集尽可能高的干血。动物研究审查委员会批准的这项技术是大学的胸大肌。树干血液收集;冒号被移除,测量、加权和纵向剖开检测宏观结肠损伤。组织样本进行进一步的分析处理。治疗和宏观得分进行盲目的。

2.2。肠道通透性测量

肠道通透性是由测量的浓度异硫氰酸荧光素(FITC)右旋糖酐(40 kDa;在血清Sigma-Aldrich密苏里州,美国)。TNBS治疗3天后,FITC-dextran解决方案(100μl 60毫克/毫升的解决方案)是intrarectally管理。血清收集1小时后管理和荧光强度都检测到Promega GloMax板读者(激发,490海里;发射,510 - 570 nm)。标准曲线生成的连续稀释FITC-dextran PBS。

2.3。血液分析

端点的TNBS模型,小鼠和5%异氟烷麻醉和斩首轻轻地专用手术剪刀,直接和树干血液收集到microtainer管(正、匈牙利)包含EDTA抗凝。血液参数测定Sysmex xn - 1000 v Multispecies血液学分析仪(Sysmex美国公司,美国)在2小时的抽样。淋巴细胞,单核细胞比率(LMR),血小板淋巴细胞比率(PLR),中性粒细胞淋巴细胞比率(NLR)和中性粒细胞单核细胞比率(NMR)计算分别从每个动物的细胞绝对计数。

2.4。宏观得分

结肠组织损伤评分由宏观评估评分系统前面描述的(34]。简单地说,个人点添加溃疡为每个0.5厘米(0.5分),粘连(0点=缺席,1点= 1附着力,和2分= 2或更多粘连或器官粘连),结肠缩短,平均长度的基础上健康的结肠(1点= > 15%,2分= > 25%),壁厚(以毫米),一致性的凳子上,和便血的存在(出血、便血或腹泻总点增加1)。

2.5。结肠组织的组织学

段的远端结肠钉持平到纸板与粘膜一面neutral-buffered 10%福尔马林固定至少24小时。组织脱水和嵌入在石蜡,和标准苏木精染色进行5μ米厚的部分。为此,幻灯片deparaffinized,清除在二甲苯中,水化下行乙醇系列与苏木精染色解决方案根据吉尔II和清除自来水。图像是用一个奥林巴斯DP50相机和处理cellSens成像软件(奥林巴斯,维也纳,奥地利)。

2.6。结肠组织的细胞因子水平

炎性细胞因子il - 1的水平β、il - 6、TNF -α,il - 10测定结肠组织。组织均质机械在提取缓冲补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)。布拉德福德化验(美国加州Bio-Rad实验室)是用来测量总蛋白的浓度。随后,正常化的蛋白质浓度和细胞因子水平取决于执行Ready-Set-Go ELISA试剂盒(美国加州eBioscience)根据制造商的指示。

2.7。上皮细胞培养

Caco-2人类结肠上皮细胞癌行从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚写明ATCC)和鹰的最低基本培养基培养(Biosera、法国)补充20%胎牛血清(美国纽约康宁)和1%的非必要氨基酸溶液(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)。细胞被维护在包含5%的湿润孵化器有限公司₂在37°C。

2.8。RNA隔离和qPCR

总RNA提取Caco-2单层使用NucleoSpin RNA +工具包(Macherey-Nagel、德国)根据制造商的协议。这是量化使用Nanodrop分光光度计和量子位2.0荧光计(美国热费希尔科学)。1μ克总RNA reverse-transcribed M-MuLV RT(最大值合成第一链cDNA装备,热费希尔科学、美国)。100 ng cDNA用于20μl反应实时PCR使用Xceed qPCR SG 2×混合(Praha-Strašnice应用生物技术研究所,捷克共和国)和CFX96触摸实时PCR检测系统(美国Bio-Rad)。后40 PCR反应的周期,产品运行在1.5%琼脂糖凝胶使用20 bp DNA梯(Lonza、巴塞尔、瑞士)。数据分析ΔCt方法。作为一个参考基因表达,我们使用β肌动蛋白的表达。引物的研究基因表达如下:(i)β肌动蛋白(121个基点):5 - - - - - -GCATGGGTCAGAAGGATTCC-3 ,反向5 - - - - - -CAGATTTTCTCCATGTCGTCCC-3 ;(2)PARP-1(109个基点):5 - - - - - -CGAGTCGAGTACGCCAAGAG-3 ,反向5 - - - - - -CATCAAACATGGGCGACTGC-3 ;(3)PARP-2(97个基点):5 - - - - - -GCCAGCAAAAGGGTCTCTGA-3 ,反向5 - - - - - -CATGAGCCTTCCCCACCTTG-3 ;及(iv) PARP-3(115个基点):5 - - - - - -CCTGAGGCTCATGGAGAGTTG-3 ,反向5 - - - - - -TGGAGCCATGGCCAAGAAAA-3 。反应是在所有情况下的效率接近100%。

2.9。Impedance-Based屏障完整性测量

首先,上皮屏障完整性决定通过测量阻抗使用xCELLigence RTCA DP实时细胞分析仪(美国加州究其生物科学)。Caco-2细胞被播种RTCA E-plates的密度(E-plate 16) 10⁵细胞/。我们应用控制(CTRL)和H₂O₂或H₂O₂+ olaparib治疗组。实现confluency之后,单层膜治疗与不同浓度的H₂O₂(100,200,500,1000μ或者olaparib(10米)μ米)预处理,30分钟前H₂O₂。CTRL和H₂O₂治疗组接受相同数量的DMSO olaparib-treated细胞。细胞指数(CI)由设备24小时连续监控。

2.10。FITC-Dextran上皮细胞通透性测定

磁导率是评估通过测量通量的FITC-dextran上层舱舱Transwell低板(0.4孔隙大小μm;聚酯膜,康宁,纽约,美国)。Caco-2细胞生长,直到全部confluency 12 Transwell板块。在这里,我们应用相同的治疗组中描述impedance-based技术。细胞治疗的1000μM H₂O₂或者使用10μM olaparib 30分钟。24小时后,FITC-dextran解决方案(1毫克/毫升)被添加到参议院。1小时后,从众议院中收集和荧光强度检测到一个Promega GloMax板读者(美国Promega)在490 nm励磁和510 - 570 nm发射波长。

2.11。测定细胞凋亡

鼠标膜联蛋白V &死细胞工具包(美国马萨诸塞州默克密理博)是用于生活的定量分析,早期、晚期凋亡和坏死细胞。Caco-2细胞被播种到6-well 10板的密度⁶细胞/。治疗和治疗组完全相同的如上所述FITC-dextran化验。治疗后24小时,细胞使胰蛋白酶化和收集;样品制备是按照制造商的建议执行。简单地说,100年μ与100年L细胞悬液的孵化μl缪斯膜联蛋白V &死细胞试剂的20分钟,在室温下在黑暗中。染色后,进行分析与缪斯细胞分析仪(流式细胞分析仪)。

2.12。海马XFp细胞水压力测试

测量的耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)在海马XFp Caco-2层是由细胞外流量分析仪(美国加州安捷伦科技)。前一天化验,海马XFp传感器盒与XF Calibrant水化溶液,并保持在37°C有限公司₂一夜之间无孵化器。Caco-2细胞被播种XFp Miniplates密度 细胞/。达到100%融合后的细胞处理准确描述FITC-dextran化验。治疗后,一个完整的生长介质换成了一个无缓冲的,无血清安捷伦XF基地试验介质,pH值7.4。XFp水压力测试工具是用来测试线粒体功能。寡霉素注射,羰基cyanide-4 (trifluoromethoxy)苯腙(FCCP),和鱼藤酮和抗霉素A允许确定生物能量学的关键参数:基础呼吸、ATP根据呼吸(ATP生产),最大呼吸,呼吸产能,nonmitochondrial呼吸、质子漏,耦合效率。寡霉素抑制F_O亚基的F_OF₁atp合酶,从而表明ATP-linked OCR,即。,ATP合成的水平。ATP-linked呼吸基线计算的区别是OCR和OCR寡霉素注射后。分散nonmitochondrial呼吸的OCR FCCP注射后代表最大呼吸。FCCP线粒体解偶联剂,分离磷酸化的活性和氧化。在这种情况下,等可能与最大速度和消耗大量的O₂不发展膜电位线粒体内膜的双方。多余的呼吸能力被定义为最大和基底呼吸之间的区别。鱼藤酮的混合物和抗霉素抑制CI和CIII分别;因此,线粒体等和O₂消费被屏蔽。的最终浓度调节器是1μm . OCR鱼藤酮/抗霉素注射后代表nonmitochondrial呼吸。ATP-linked呼吸除以基底呼吸揭示耦合效率。

2.13。光学显微镜成像

Caco-2细胞被播种密度的10⁶细胞/ 6-well板块。达到confluency后,层被完全描述FITC-dextran化验。24小时后,膜被evo XL可视化核心细胞成像系统(热费希尔科学、美国)使用20×目标。

2.14。统计分析

实验数据分析了利用GraphPad棱镜软件(美国加州GraphPad软件有限公司)。统计组建立了学生之间的区别 - - - - - -测试,Bonferroni调整;值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Olaparib TNBS-Colitis改善老鼠

评估olaparib在实验性结肠炎的影响,我们使用了TNBS-colitis模型(图1(一)),一个CD的小鼠模型35]。Olaparib被用作预处理在20到50毫克/公斤体重剂量。一方面,olaparib未能显著改善减肥TNBS-challenged动物(图1 (b))。但另一方面,减少炎症得分超过50毫克/公斤(~ 50% ),但不是在20毫克/公斤剂量( )(图1 (d))。因此,我们使用50毫克/公斤剂量进一步的实验。Olaparib阻碍组织学损伤在冒号(图1 (c)),减少溃疡的数量( )(图1 (e))和他们的长度( )(图1 (f)),最重要的是,减少FITC-dextran渗透率( )(图1 (g))相比CTRL组( )。炎性细胞因子水平也被调制。Olaparib降低il - 1β(图2(一个))和il - 6(图2 (b)促炎细胞因子的水平,但增强抗炎il - 10(图生产2 (c)在冒号() )。有趣的是,我们找不到显著改变在肿瘤坏死因子-α水平(图2(一个))。我们也评估大量血液参数colitic老鼠(图3(一个))。我们发现只有两个参数,即大量的淋巴细胞和单核细胞,显著调节治疗。与他人一致的发现在结肠炎模型,TNBS大大减少小鼠的淋巴细胞数量( ),虽然olaparib抵消这种效应( )。相比之下,单核细胞数量较高TNBS组( ),而这是大大减少TNBS + olaparib组升高(图3(一个))( )。我们计算特定的血液细胞比率,这以前在CD[被改变36基于个人血细胞计数。类似于CD,中性粒细胞淋巴细胞比率(NLR)(图3 (e))和血小板淋巴细胞比率(PLR)(图3 (c)在TNBS-colitis)都增加了,他们被olaparib治疗明显下降。再次,如CD,淋巴细胞,单核细胞比率(LMR)(图3 (b))降低实验性结肠炎,PARP抑制剂的修改。不幸的是,TNBS-induced中性粒细胞单核细胞比例的变化(NMR)(图3 (d)相比)没有达到统计学意义。然而,olaparib提高核磁共振相关TNBS-treated组。

3.2。Caco-2结肠上皮细胞表达PARP-1, PARP-2 PARP-3

Olaparib已表现出抑制PARP酶家族的三名成员,即PARP-1 ( 海里),PARP-2 ( 海里),PARP-3 ( 海里)(37]。因此,我们调查了基底表达谱的三个目标亚型在未经处理的Caco-2细胞形成单层融合。我们检测到连续PARP-1、PARP-2 PARP-3 mRNA表达(数字4(一)- - - - - -4 (c)),但是使用不同的表达率(PARP-1 > PARP-2 > PARP-3)(图4 (c))。在Caco-2细胞,PARP-1同种型是最高度表达。PARP-2和PARP-3 mRNA表达~ ~ 9倍和335倍左右弱PARP-1相比(图4 (c))。

3.3。Olaparib上皮屏障功能改善单层氧化应激

Caco-2单层膜被广泛用作肠上皮屏障模型(38]。PARP-1活动以来,PARP-2 PARP-3亚型可以引起dna损伤(39),氧化应激引起粘膜损伤在炎症性肠病(40,41),我们测试了不同H₂O₂浓度(100 - 1000年μ在单层Caco-2 M)。我们评估impedance-based屏障完整性的技术(图4 (d))。低浓度的H₂O₂(100 - 500μ米)并没有大幅修改细胞指数(CI;计算从te阻抗值)意味着他们没有损害屏障的完整性。然而,1毫米H₂O₂迅速和永久CI有所下降。24小时后,1毫米H₂O₂强烈侵蚀上皮细胞单层(图4 (d))。因此,在进一步的实验中,我们应用1毫米的浓度H₂O₂挑战障碍。Olaparib预处理、H前30分钟₂O₂曝光,提高CI相比,H₂O₂细胞治疗和保护单层完整性(图5 (b))。来证实这些发现,我们还FITC-dextran执行反式上皮细胞通透性测定在同一个模型的端点impedance-based测量,24小时后孵化(图5(一个))。我们发现~ 20倍增加FITC-dextran H后荧光强度₂O₂治疗(即。,FITC-dextran could pass the monolayer) in relation to CTRL. In contrast, olaparib reduced H₂O₂全身FITC-dextran渗透率接近水平的控制(图5(一个))。进一步完善我们的结果,我们执行显微成像和观察形态学变化后上皮单层结构的H₂O₂治疗。我们意识到,在一些地方破碎的单层,大概是死细胞,即单层的邻居失去了联系。Olaparib阻止这些形态变化和保持细胞作为屏障的组成部分在正常上皮表型(图5 (c))。

3.4。Olaparib防止氧化应激在上皮屏障细胞死亡

评估是否氧化应激障碍障碍包括上皮细胞死亡我们进行了流式细胞术分析使用膜联蛋白V / 7-AAD标签(图5 (d))。H₂O₂(1毫米)诱导显著增加7-AAD积极的死,基本上坏死细胞(细胞总数的5.87%;CTRL相比增长了4.89倍)。此外,它提高了膜联蛋白V / 7-AAD double-positive,晚期凋亡细胞数(细胞总数的31.9%;增长了6.86倍)。在我们的手中,H₂O₂对早期细胞凋亡无显著影响。Olaparib防止H₂O₂全身的细胞死亡。,我t reduced necrotic cell death (1.25% of total cells; 4.70-fold decrease) and late apoptosis (5.73%; 5.17-fold decrease) almost to the level of CTRL (Figure5 (d))。

3.5。PARP抑制了糖酵解活性受到H₂O₂治疗

在炎症,colonocytes开关氧化代谢(丁酸消费)有氧糖酵解,产生乳酸(13,17)(图6(一))。因此,我们调查了糖酵解活动通过测量细胞外酸化率(ECAR),即、乳酸生产(图6 (b)),两个小时后H₂O₂治疗早期阶段的氧化应激。H₂O₂造成一个戏剧性的崩溃基底ECAR (w / o寡霉素)和CTRL相比,由olaparib显著增强(图6 (b)(1 - 3分的测量)和图6 (c))。寡霉素治疗增加ECAR CTRL和H₂O₂+ olaparib-treated细胞比未经处理的(w / o寡霉素)组,但未能刺激酸化的H₂O₂受损的单层(图6 (b)测量(4 - 6分)和图6 (d))。FCCP、鱼藤酮、抗霉素A没有显著影响ECAR治疗组(图所示6 (b)测量)(7分)。

3.6。在H PARP抑制剂Olaparib保留线粒体呼吸₂O₂全身的压力

在生理条件下,丁酸盐是colonocytes [ATP的主要来源12],丁酸盐代谢涉及动态线粒体等活动和连续OXPHOS [42]。因此,我们调查的活动等OXPHOS通过测量我们的上皮屏障模型的耗氧率(图7(一))。首先,基础呼吸(OCR w / o寡霉素,绿地图7(一))确定。H₂O₂减少相比,上皮细胞基底呼吸CTRL,和olaparib没有调节这种效应(图7 (b)(1 - 3分的测量和数字7 (c))表明olaparib基础呼吸作用没有影响。寡霉素治疗后,ATP根据OCR(光学字符识别与寡霉素、黄场图7(一))可以测量反映OXPHOS和ATP生成的活性。寡霉素降低OCR和OXPHOS xoverall在实验三个组(图7 (b)测量(4 - 6分)和图7 (d)),但是H₂O₂治疗细胞消耗啊₂甚至比控制在较小程度上,它提出了一个减少ATP生产。Olaparib没有显著影响ATP-linked OCR H₂O₂治疗细胞(图7 (d))。此外,olaparib改善H₂O₂全身的耦合效率下降(图7 (e))。相比之下,FCCP,线粒体解偶联剂,诱发最大呼吸(OCR FCCP,米色的场图7(一)),提高OCR在所有三组不同的区段(图7 (b)测量(7 - 10分))。我们发现最高的OCR CTRL,最低的H₂O₂全身的细胞而olaparib中和H的效果₂O₂(图7 (b)测量(7 - 10分)和图7 (f))。FCCP应用程序还确定备用呼吸能力(蓝场图7(一))。多余的呼吸能力被H高度降低₂O₂CTRL相比,但olaparib减毒这减少(图7 (g))。H₂O₂降低了质子漏(橙色字段在图7(一))相比,CTRL,进一步减少了olaparib Caco-2细胞(图7 (h))。

4所示。讨论

PARP抑制的抗炎作用是完全建立;然而,PARP抑制剂引入抗炎疾病的临床治疗尚未启动,因为长期使用的药物的潜在风险(33]。在这项研究中,我们旨在提供实验支持定位PARP抑制剂(成功地应用在人类癌症治疗)的临床管理急性冲突时期的CD。为此,我们使用TNBS-induced实验小鼠结肠炎模型,这是被广泛接受为研究CD,因为他们有许多病理(临床、组织学和生化)特点35]。此外,增强PARP-1表达式被发现结肠的啮齿动物(43,44)在实验性结肠炎模型,以及在IBD患者45),这使得研究PARP抑制剂的模型更有价值。在这个报告中,我们明确地集中在上皮屏障功能,细胞生存,和生物能疗法;因此,我们使用一个Caco-2单层的在体外肠上皮屏障模型(46]。我们证明olaparib改善炎症在TNBS-colitic老鼠和保护Caco-2上皮屏障由拯救糖酵解活性和氧化应激的保护线粒体功能的某些方面。

在最近的一次审查关于再利用PARP抑制剂的治疗nononcological疾病(33),伯杰等人并不认为IBD那些慢性疾病,在假定的好处与再利用的风险为第一要务。然而,可用的临床前数据等炎症性肠病模型成功地利用过时的PARP抑制剂3-aminobenzamide [47]。我们的研究结果的在活的有机体内olaparib的抗炎作用,PARP抑制剂批准人类癌症治疗,可能证明临床试验启动更新这一治疗炎症性肠病的药物治疗。我们假设PARP抑制可能是有益的严重急性起病的CD,有害的溃疡和组织损伤是由粘膜细胞的活力的崩溃引起的。这可能是严重的药物nonresponders尤其如此,例如,那些三分之一的IBD患者主要不应对英夫利昔单抗(anti-TNF -α马伯;常用药物在IBD) (48)或其他药物治疗。

我们证明olaparib TNBS-induced结肠炎小鼠改善,减少结肠组织学损伤,减少的数量和长度溃疡、抑制促炎细胞因子(il - 1生产β,il - 6),但它增强了抗炎细胞因子il - 10的水平。炎性细胞因子参与结肠损伤的产生主要是由激活白细胞(49]。这一事实PARP抑制减少白细胞浸润在实验性结肠炎结肠远特征(50- - - - - -52]。因此,我们在TNBS-colitis调查从外周血血液参数模型。几种类型的血细胞比例最近强调尽可能在炎症性肠病诊断参数(36,53]。特别是在CD, NLR和PLR诊断因素被认为是有价值的36]。此外,NLR可能预测疾病严重程度(54];然而,这一概念是讨论(55]。详细NLR升高,PLR,减少LMR被发现在CD患者与对照组相比,核磁共振在不修改36]。在我们的实验中,改变NLR, PLR LMR, NMR TNBS-treated老鼠跟着CD患者观察到的变化。此外,olaparib有效逆转CD-specific改变PLR LMR,最重要的是,它减少NLR。NLR被发现的一个重要预测英夫利昔单抗药物反应在CD患者(56]。也就是说,英夫利昔单抗的抗炎功效与降低CD。NLR Olaparib相同的抗炎效应在我们TNBS-colitis模型突显了在CD治疗药物的潜力。

高架NLR也可以引用在CD患者氧化应激(57),这是一个重要的诱导物PARP激活(58]。在活跃的CD,过量的活性氧产生的免疫细胞。免疫细胞中活性氧的主要来源是H₂O₂生产(59),和H₂O₂导致colonocytes DNA损伤(60],触发PARP激活。高浓度的活性氧导致细胞凋亡的iec导致破坏结肠上皮屏障的完整性,这是一个明确的IBD的标志。因此,我们对待Caco-2单层与高浓度的H₂O₂(1毫米)来模仿一个强大的氧化stress-injured障碍,在体外。我们证明Caco-2单层细胞表达PARP-1 mRNA在很高程度上类似于结肠粘膜(45]。此外,我们发现PARP-2 PARP-3表情,然而,在渐渐的失去更低的程度。即Caco-2细胞表达olaparib的mRNA的目标酶(PARP-1, PARP-2, PARP-3);此外,单层,这些细胞模拟肠道屏障(46]。因此,Caco-2单层似乎是一个合适的模型来调查PARP-inhibition在屏障完整性的影响,在体外。我们的结果表明,olaparib保存Caco-2单层完整性在氧化应激和保护上皮细胞凋亡。这些发现表明结肠上皮细胞可能在TNBS-colitis olaparib的直接目标,和屏障保护可能是其抗炎作用的一个关键组成部分。

减少肠道通透性增加屏障完整性和典型的炎症性肠病的迹象。他们最近与上皮细胞死亡有关,线粒体功能障碍,在iec枯竭的能量代谢。在结肠炎iec产生ATP主要由有氧糖酵解。然而,overactivation PARP可能完全阻止糖酵解(25]。研究代谢olaparib上皮细胞死亡的影响,我们诱导的氧化应激(1毫米H₂O₂2小时)Caco-2单层和能量代谢的各种参数(图确定8)。H₂O₂压力显著降低基底ECAR(基底糖酵解)和诱导Caco-2细胞活力的崩溃。H质子漏率低₂O₂治疗细胞相比,控制也反映出这种代谢失败,因为ATP需求降低了质子动力和降低质子漏61年,62年]。相比之下,olaparib显著增强ECAR H₂O₂处理细胞。强烈支持我们的研究结果发现,聚(ADP-ribose) (PAR)结合PAR-binding主题在己糖激酶和抑制从而减少糖酵解(25]。这些数据表明,olaparib施加其影响通过抑制标准生产,从而防止PAR-mediated己糖激酶抑制和封锁的有氧糖酵解(图8)。

寡霉素是一种F_OF₁块OXPHOS atp酶抑制剂。正如所料,在H ECAR寡霉素没有影响₂O₂治疗组;然而,它强烈增加ECAR H₂O₂+ olaparib-treated细胞。解释了这一发现可能是寡霉素阻塞ATP合成和细胞无法弥补缺乏ATP通过促进糖酵解H₂O₂治疗组,因为强烈的己糖激酶PARP-mediated镇压。然而,Olaparib阻止H PARP激活和糖酵解崩溃₂O₂+ olaparib-treated细胞(图8即使在寡霉素的存在)。一个可以说氧化应激不仅本身可能会影响糖酵解酶和PARP激活调节糖酵解的活动。通过使用FCCP(线粒体解偶联剂)、鱼藤酮、抗霉素A(抑制剂等)线粒体能源生产是完全废除。在这种情况下,糖酵解仍然ATP(图的最终来源8)。这一事实ECAR可能达到的水平CTRL细胞H₂O₂+ FCCP olaparib集团后,鱼藤酮和抗霉素治疗明显表明,糖酵解酶没有显著受到氧化应激的影响在我们的系统中,和糖酵解能量生产控制的PARP激活。因此,olaparib免受PARP-induced精力充沛崩溃通过改善有氧糖酵解在氧化应激(图8)。

先前的研究表明,线粒体活性氧的主要来源是在iec炎症(63年)和PARP-1激活氧化应激导致线粒体功能障碍(25]。因此,我们想知道是否olaparib可以防止线粒体失败在我们的模型中。我们发现基底呼吸、线粒体ATP生产和nonmitochondrial耗氧量强烈阻碍在氧化应激,和olaparib不能扭转这些变化。然而,它增加最大呼吸,呼吸产能闲置,质子和耦合效率和减少泄漏。对理解这些结果,我们应该考虑的直接和间接影响H₂O₂CAC酶等复合物,F_OF₁atp酶和糖酵解PARP激活的影响等。

之前的研究使用DNA-alkylating代理N-methyl-N-nitroso-N-nitroguanidine (MNNG) PARP激活线粒体功能障碍[报道25]。MNNG治疗导致降低基底OCR,最大OCR, ATP合成、和ECAR, PARP抑制显著逆转这些变化。最重要的是,他们发现政府的丙酮酸完全阻止MNNG-induced线粒体失败(25]。也就是说,线粒体功能障碍是表达下调糖酵解的直接后果,即。,我t compromised fuel supply for the CAC and ETC. Our results led to the same conclusion, namely, PARP activation reduced glycolysis and caused mitochondrial dysfunction (Figure8)。

MNNG-induced PARP激活相比,我们发现抑制的酶并没有阻止H₂O₂全身的减少基础呼吸和线粒体ATP生产。另一方面,olaparib增强ECAR,即。,我t effectively prevented glycolytic collapse (Figure8)。此外,它增加了最大呼吸,呼吸产能闲置,耦合效率,并降低质子漏,即。,它增加OXPHOS的功效。我们的结果之间的差异和之前的25)可以被考虑到解决MNNG烷基化物DNA导致DNA断裂和PARP激活。H₂O₂然而,诱发氧化DNA damage-mediated PARP激活但CAC会导致直接的结构性障碍,等等,F_OF₁腺苷三磷酸酶组件附带损害。建立了H₂O₂恶化CAC活动和降低了质子动力,这是一个先决条件的线粒体丙酮酸运输(64年]。此外,F_OF₁腺苷三磷酸酶报道是容易受到氧化应激(65年,66年]。此外,活性氧特别是H₂O₂可以直接阻止呼吸链的许多组件,如NADH脱氢酶或细胞色素c氧化酶(65年]。我们发现最大的OCR H₂O₂+ olaparib治疗组不可能达到的最大OCR级别的控制细胞符合的观念等对氧化应激(图很敏感8)。两组观察到的差异最大的ocr CAC可以氧化损伤的结果,等,和F_OF₁腺苷三磷酸酶组件在H₂O₂+ olaparib组。因为糖酵解燃料供给通路畅通在两组中,由于olaparib PARP抑制影响的H₂O₂+ olaparib组。此外,观察到增加最大OCR的H₂O₂+ olaparib组与H₂O₂集团可能源于PARylation等的直接控制。研究发现过度PARylated线粒体蛋白质,包括组件等。此外,parp抑制剂如3-aminobenzamide和烟酰胺阻止了H₂O₂全身的线粒体电子传递封锁在孤立的文明(67年]。这些结果表明,PARP可能调节文明等活动,同时也提出了一个线粒体PARP抑制剂的目标。另一项研究中提出了一个关键的角色在线粒体能量体内平衡,并演示了CI PARP-1线粒体的目标PARP-1激活(68年]。然而,应该指出的是,PARP-1或其他PARP亚型的存在线粒体中讨论。但是否出现在线粒体,PARP明显影响线粒体功能(69年]。

5。结论

总之,olaparib, PARP抑制剂用于人类肿瘤治疗,恢复生物能学结肠上皮细胞的糖酵解复活,并减少细胞死亡。上皮细胞的保护屏障功能改善的可能是一个原因,最终导致减少CD-like症状的发生率和严重程度在实验老鼠IBD模型。然而这些发现提供实验证据,再利用olaparib IBD治疗和突出其潜在的治疗CD;在炎症性肠病药物的临床应用需要进一步调查。

数据可用性

本文数据基础是可用的。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的欧盟,欧洲社会基金共同投资(efop - 3.6.1 - 16 - 2016 - 00004),由财政部,匈牙利(ginop 2.3.3 2.3.2 - 15 - 2016 - 00025和ginop - - 15 - 2016 - 00049 - g)。这项工作也支持Janos Bolyai匈牙利科学院的研究奖学金(BO / 00855/18/5 BR)和新的国家卓越项目的创新和技术的来源国家研究,开发和创新基金(unkp - 19 - 4 - pte - 405和unkp - 20 - 5 - pte BR - 762)。在实验室工作的RS由奥地利科学基金资助(FWF格兰特P33325)。

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