SM22α.损失通过巨噬细胞来源的circRasGEF1B促进血管平滑肌细胞凋亡

抽象的

血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡是腹主动脉瘤(AAA)的主要特征，主要由炎症细胞浸润引起。平滑肌α.通过抑制NF-来阻止AAA的形成κ..B激活。但是，SM22的角色α.在VSMC细胞凋亡方面存在争议。在这里，我们识别了SM22α.损失通过激活巨噬细胞促进VSMC的凋亡。首先，SM22的缺乏α.增强VSMCs与巨噬细胞的相互作用。巨噬细胞被保留和激活SM22α^-/-vsmc通过上调VCAM-1表达。经活化RAW264.7细胞条件培养基(CM)处理的VSMCs的凋亡率比对照CM ( )，和细胞凋亡SM22α^-/-VSMCs高于WT VSMCs ( )．接下来，将来自活化巨噬细胞的circRasGEF1B注入vsmc，通过稳定ZFP36 mRNA促进ZFP36的表达。重要的是，circRasGEF1B作为支架，引导ZFP36优先结合并以序列特异性的方式衰变Bcl-2 mRNA，触发VSMCs的凋亡，尤其是在VSMCs中SM22α^-/-VSMCs。这些发现揭示了circRasGEF1B-ZFP36轴通过Bcl-2 mRNA的衰减介导巨噬细胞诱导的VSMC凋亡的新机制SM22α^-/-血管平滑肌细胞对凋亡具有较高的敏感性。

1.介绍

血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)是血管的主要结构细胞，其损伤或死亡导致多种血管病变。损伤后的VSMC表型转换广泛，被认为与损伤刺激有关;在许多情况下，VSMC表型转换伴随着细胞增殖、细胞迁移、炎症和凋亡的改变。在动脉粥样硬化中，VSMCs的凋亡与斑块破裂和动脉瘤形成有关，这被认为是慢性炎症的结果[1]．此外，VSMC凋亡与包括马凡氏综合征在内的多种人类遗传疾病的内侧变性有关。炎症细胞浸润和促炎细胞因子刺激均可诱导VSMC凋亡[2，3.]提示在炎症微环境中，血管平滑肌细胞更容易发生凋亡。

VSMC标记基因的减少，包括平滑肌(SM) 22α.和SMα.-肌动蛋白是VSMC表型转换的主要特征，已在高级人类腹主动脉瘤(AAA)和小鼠模型中得到证实[4，5]．我们之前的研究表明SM22α^-/-小鼠的炎症反应和ROS产生增强，这通过不同的信号机制参与了内膜增生[6- - - - - -9),这表明SM22α^-/-VSMCs已转变为炎症表型;然而，尚不清楚调控的VSMCs信号是否诱导凋亡。最近的一项研究使用携带SM22的AAVα.siRNA或SM22α.过表达质粒在Ang ii灌注ApoE^−−/小鼠证实了SM22的致病作用α.AAA形成的缺乏部分是通过增强血管炎症而不是增加细胞凋亡发生的[10]．然而，这些发现基于ApoE^−−/小鼠SM22的AAV介导的敲低或过度表达体内α是否足以排除SM22紊乱之间的潜在致病联系α.表达和VSMC凋亡。

在本研究中，我们证实了VSMCsSM22α^-/-小鼠向巨噬细胞发出信号，对巨噬细胞诱导的细胞凋亡表现出较高的敏感性。巨噬细胞来源的circRasGEF1B通过引导ZFP36选择性结合并衰变Bcl-2 mRNA，重组vsmc使其凋亡体外和在活的有机体内．我们的研究结果表明，炎性血管平滑肌赞成与巨噬细胞的相互作用，将所得的circRasGEF1B-ZFP36轴的活化是一种新的机制基础的巨噬细胞诱导血管平滑肌细胞的细胞凋亡。

2.材料和方法

2.1。实验动物

这SM22α^-/-鼠标线(B6.129S6 -Tagln^{tm2 (cre)公司}/J)携带cre重组酶基因插入内源性SM22α.轨迹是从杰克逊实验室购买的。所有动物程序均符合指导实验动物的护理和使用由美国国立卫生研究院出版，并由河北医科大学机构动物护理和使用委员会批准。

2．2．检查参与组成分泌腺完成分析

从WT获得的总无血清培养基和SM22α^-/-在4°C下收集VSMCs，在总条件培养基中加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(罗氏公司)以防止蛋白质降解。使用Bradford assay (Bio-Rad)测定每个样品的蛋白浓度。200年μ.G蛋白样品进行质谱分析。样品制备采用过滤器辅助样品制备(FASP)蛋白消化方案[11[和反应在10kDa MWCO过滤器（UFC500396，AMICON ULTRA）上进行。如前所述进行蛋白质烷基化，消化，ITRAQ标记，离线2D LC-MS / MS分析，蛋白质组学数据和生物信息学分析[12]．筛选WT和VSMC中粘附相关的差异蛋白SM22α^-/-，通过基因本体论(GO)分析鉴定出明显富集的蛋白。

２．３．RNA-seq数据分析

原始测序读取可从GEO登录号GSE99811的基因表达综合数据库获得，数据分析如前所述[13]．为了筛选与凋亡相关的差异基因，我们在circrasgef1b基因敲低的细胞中，确定了相对于控制的上调和下调的基因组中显著富集的氧化石墨烯功能类别。

２.４.Ang ii诱导的腹主动脉瘤(AAA)模型

10到12周大的雄性SM22α^-/-采用WT小鼠进行实验。渗透微型泵(ALZET，模型2004)以1000 ng/kg/min的剂量注入生理盐水或血管紧张素(Ang) II (A9525, Sigma-Aldrich)。泵入皮下4周。小鼠处死后，将主动脉与周围结缔组织分离。用数码相机拍照，测量肾上主动脉外径，如前所述[14]．腹主动脉的肾上区位于最后一对肋间动脉和右肾分支之间。根据主动脉图片上的标尺调整刻度后，使用Image-Pro Plus软件分析腹主动脉的最大宽度。使用了三个测量值的平均值。小鼠的AAA被定义为与对照组主动脉相比，肾上主动脉的外部宽度增加了50%或更多[15]．

2.5.组织学分析

对于免疫组化染色，冷冻切片用3%过氧化氢孵育，然后用3%正常封闭血清封闭。切片用抗CD14（1）的一级抗体孵育 : 500稀释，ab182032，Abcam）或SMα.-肌动蛋白（1 : 500稀释，ab124964，Abcam），在4°C下过夜，然后在用DAB试剂盒（ZSGB-BIO，北京，中国）染色之前使用二级抗体。细胞核用苏木精复染。单独使用与物种匹配的IgG孵育的切片作为阴性对照。

对于免疫荧光染色，冰冻主动脉切片与抗CD68（1）的抗体孵育 : 500稀释，ab955，Abcam），然后是TRITC结合二级抗体。荧光信号通过共焦激光扫描显微镜（瑞士徕卡SP5）监测。

2.6。细胞培养和治疗

WT或主动脉的原发性VSMCsSM22α^-/-采用胶原酶消化法分离小鼠(8 ~ 12周龄，雄性)。分离细胞在低糖Dulbecco改良Eagle’s培养基(DMEM;Invitrogen)，含10%胎牛血清(FBS;青霉素100 U/mL，青霉素100μ.g/mL链霉素[16，17]．通过SM的免疫荧光染色验证VSMCs的纯度α.肌动蛋白。第3至第5代的细胞只用于进一步的实验。小鼠VSMC系MOVAS购自ATCC (CRL-2797)，在含10%胎牛血清和0.2 mg/mL G-418的高糖DMEM中培养。在用不同刺激处理之前，所有的VSMCs在无血清培养基中孵育24 h。RAW264.7细胞购自ATCC (TIB-71™)，培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μ.克/毫升链霉素。

2.7。腺病毒包装与感染

SM22的全长cDNAα.被克隆到PCMV-Flag®-mat-Tag™-1表达载体（C5864; Sigma-Aldrich）中。padeno-mcmv-ha-p2a-egfp用于包装绿色荧光蛋白 - （gfp-）标记的腺病毒（Padeno-mcmv-flag-sm22α.-Mat-P2A-EGFP, Ad-SM22α.短)。用10¹⁰pfu/mL腺病毒孵育24 h，洗涤，在无血清培养液中维持24 h，然后给予相应刺激。

2.8。小干扰RNA（siRNA）的转染

设计并从中国广州RiboBio公司获得靶向小鼠circRasGEF1B (si-circRasGEF1B)、ZFP36 (si-ZFP36)和重组siRNA (si-Con)双链;根据制造商的协议，使用Lipofectamine®RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)将sirna瞬间转染到VSMCs中。

2.9。质粒转染

circRasGEF1B序列经PCR扩增，构建成pLCDH-ciR载体(中国广州，genenseed Biotech)。合成不同序列的circRasGEF1B缺失突变体，插入plcdh - cirr载体中过表达突变体circRasGEF1B。将pLCDH空载体和pLCDH- circrasgef1b或pLCDH- circrasgef1b突变体用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(06366236001，罗氏)转染至VSMCs中24小时，然后用指定的刺激处理。

2.10。迁移分析

使用24孔transwell平板和5 μ.m孔滤过器（Corning）。血管平滑肌细胞在下腔预先接种。在达到融合后，血清饥饿的血管平滑肌细胞被Ang II（10）刺激^-5M) 24小时。随后，将RAW264.7细胞置于上腔室。孵育6 h后，去除上膜表面的非迁移细胞，用4%多聚甲醛固定下膜表面的细胞，用龙胆紫染色。利用带有40倍物镜的显微镜，枚举每个膜的迁移细胞数量。每个过滤器中至少有三个随机场被检查。每个实验重复三次，迁移表示为 每个字段计数的总单元格。

2.11。附着力试验

96孔培养板上的VSMCs用Ang II (10^-5 M） 或指示治疗，然后，将RAW264.7细胞（用钙黄绿素AM标记，生命技术）添加到每个孔中。30天后 孵育分钟后，用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗非粘附细胞，通过490和535的激发和发射测定荧光强度 对于腺病毒感染的血管平滑肌细胞，将RAW264.7细胞添加到每个孔中，并计数粘附细胞。

2.12。细胞凋亡分析

用ApopTag过氧化物酶检测冰冻主动脉切片的凋亡情况原位凋亡检测试剂盒（S7100，Chemicon）符合制造商的说明。

根据说明书使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(556547,BD Pharmingen)检测VSMCs凋亡，使用BD LSRFortessa™流式细胞仪(BD Biosciences)分析凋亡指数。或者，使用ApopTag Red原位凋亡检测试剂盒(Millipore)，质粒转染后的VSMC细胞凋亡采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)染色检测，荧光信号采用共聚焦激光扫描显微镜(Leica SP5，瑞士)监测。

2.13。RNA分离与实时荧光定量PCR (qRT-PCR)

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Life Technologies)提取总rna。为了量化mRNA或环状rna的数量，使用M-MLV First Strand Kit (Life Technologies)合成cdna，并使用SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Life Technologies)进行定量PCR。对于microRNA，用QIAzol Lysis Reagent提取总RNA。采用生工生物技术(中国上海)的miRNA检测试剂盒进行逆转录和定量逆转录PCR。相对circRNA、mRNA或miRNA的表达归一化为β-actin/GAPDH或U6 snRNA水平方法,分别。各引物的序列见补充表1在补充材料中，每个基因的平均阈值周期由至少三个独立实验确定。

2.14。免疫印迹分析

用RIPA裂解制备细胞或组织的裂解液。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的蛋白质，然后电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。膜被封锁与5%脱脂牛奶和孵化主要抗体anti-VCAM-1(1: 1000稀释,ab134047 Abcam), anti-ZFP36(1: 500稀释,sc - 374305, Santa Cruz), anti-Bcl-2(1: 1000稀释,sc - 7382, Santa Cruz), anti-Bax(1: 1000稀释,sc - 7480, Santa Cruz), anti-cleaved caspase-3(1: 1000稀释,ab49822, Abcam)， anti-pro-caspase-3(1: 1000稀释，ab32499, Abcam)， anti-SM22α.（1 : 1000 dilution, ab14106, Abcam), anti-ICAM-1 (1 : 1000 dilution, ab222736, Abcam), anti-IGFBP7 (1 : 500 dilution, DF7131, Affinity Biosciences), and anti-TNC (1 : 500 dilution, DF8051, Affinity Biosciences) at 4°C overnight. GAPDH (1 : 1000 dilution, ab181602, Abcam) was used as an internal control. This was followed by incubation with an IRDye800®-conjugated secondary antibody (1 : 20000 dilution, Rockland) for 1 h at room temperature and subsequent scanning with the Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). The integrated intensity for each detected band was determined using Odyssey Imager software. Data are presented as 至少有三个独立的实验

2.15。RNA免疫沉淀反应(RIP)

将VSMCs用冰水PBS洗涤，用裂解缓冲液(20 mM/L Tris-HCl, pH 7.0, 150 mM/L NaCl, 0.5% NP-40, 5 mM/L EDTA，新鲜添加1 mM/L DTT, 1 mM/L PMSF, 0.4 U/)裂解μ.L . RNase抑制剂)，再与5μ.g ZPF36一级抗体（ABE285，默克）在4°C温度下持续2小时 h、 五十 μ.在每个样品中加入L Protein A/G plus - agrose (Santa Cruz)， 4℃孵育4 h。用PBS洗涤微丸，用1ml TRizol Reagent (Invitrogen)重悬。对水溶液中沉淀的rna进行qRT-PCR分析，利用各自的引物证明结合产物的存在。这个实验至少重复了三次。

2.16。RNA拉试验

Eight to ten dishes of 15 cm in diameter of VSMCs were used per RNA pull-down experiment. RNA pull-down assays were performed as described [18]．简单地说，用0.4 U/的冰水PBS冲洗VSMCsμ.L - RNase抑制剂，500μ.L裂解缓冲液（20 毫米/升三氯化氢，pH值 7.0, 150 mM/L NaCl，0.5%NP-40，5 mM/L EDTA，新添加1 毫米/升DTT，1 毫米/升PMSF和0.4 U/μ.大号RNA酶抑制剂），然后用3温育 μ.g生物素化DNA寡聚探针(设计和获得的RiboBio，广州，中国)在4°C 2小时。总共50个μ.将L Dynabeads™MyOne™Streptavidin C1磁珠(Invitrogen)加入到每个结合反应中，并在4°C进一步孵育4小时。用裂解缓冲液对微珠进行短暂洗涤3次;免疫印迹法鉴定富集蛋白，qRT-PCR鉴定富集rna。这个实验至少重复了三次。

2.17。荧光原位杂交(FISH)

血管平滑肌细胞在PBS中洗涤，在4%多聚甲醛中固定30分钟 最小，并渗透15分钟 对于鱼类，根据荧光显微镜的用户手册，使用circRasGEF1B的特定探针培养细胞原位杂交试剂盒（RiboBio，中国广州）。在37°C下培养过夜，在杂交缓冲液中使用荧光标记探针进行杂交。在使用SSC缓冲液进行严格清洗后，用DAPI（Invitrogen）对细胞核进行复染。使用共聚焦激光扫描显微镜获取图像（徕卡SP5，瑞士）。

2.18。信使rna稳定性试验

在用质粒转染24小时后，VSMCS过表达循环措施F1B。然后，De Novo RNA合成用10次封闭 μ.g/mL ActD (C7698, Sigma-Aldrich)。在指定时间点收获总RNA，采用qRT-PCR检测mRNA表达。通过与加入ActD前的mRNA水平比较，测定ZFP36 mRNA的半衰期。

2.19。统计分析

使用SPSS 16.0版或的GraphPad Prism 6软件进行数据分析。数据表示为 来自至少三次独立实验，且每个独立实验重复3次，得到的平均值。正态分布的数据集是由非配对分析 -试验2个独立组或成对 -对2个依赖组进行单因素方差分析(ANOVA)，然后对≥3个组进行bonferroni后多重比较检验。对于所有的统计比较，值为 < 0.05, 0.01, 0.001时，以1,2,3号星号表示。

3.结果

３．１．Sm22主动脉介质中巨噬细胞浸润和VSMC凋亡增加α.^-/-血管紧张素Ⅱ输注小鼠

我们首先证实了动脉粥样硬化的发生率较高，主动脉巨噬细胞浸润加重SM22α^-/-与WT小鼠相比，注入Ang II的小鼠(图1(一)和图1（b）)，与先前的研究结果一致[10]．接着我们进行了TUNEL实验，发现TUNEL阳性细胞在主动脉介质中明显增加SM22α^-/-与WT对照组相比，与SM组相比，与SM组间壁VSMCs数量减少一致α.-actin-positive染色(图1（c）)．因此，我们推测SM22α.丢失可能导致巨噬细胞浸润，与VSMC凋亡相关。

3.2。SM22α.VCAM-1的表达促进血管平滑肌细胞与巨噬细胞的相互作用

为了评估SM22之间潜在的因果关系α.从中观察到的损失和巨噬细胞渗透在活的有机体内在研究中，我们使用Boyden室进行了transwell迁移分析。SM22α^-/-经或不经Ang II处理的VSMC显著诱导RAW264.7细胞的跨孔迁移（图2（a）)，增强与RAW264.7细胞的相互作用(图2（b）)．此外，促炎分子TNF-的表达α.，MCP-1，IL-6，和IL-1β经Ang ii诱导的条件培养基(CM)处理的RAW264.7细胞明显增加SM22α^-/-VSMCs(图2（c）)．拯救SM22α.表达减少了相互作用SM22α^-/-VSMCs伴巨噬细胞(图2（d）），显示减少Transwell迁移（图2 (e))和在相同条件下RAW264.7细胞中促炎分子的表达(图2 (f))，表示SM22α^-/-VSMCs能够以SM22的形式招募和激活巨噬细胞α.未在WT小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞中表达(数据未显示)。

探索如何SM22α^-/-VSMCs招募并激活巨噬细胞，我们分析了野生型(WT)和VSMCs条件培养基(CM)的完整分泌组SM22α^-/-老鼠。鉴定出iTRAQ产生的推定差异表达蛋白(1.5倍变化)。根据这些标准，共得到267个差异蛋白SM22α^-/-和WT老鼠。GO生物学过程(BP)显示，与细胞粘附、TN-C、VCAM-1和nid2相关的分子在GO中显著上调20倍以上SM22α^-/-VSMCs(补充表2)．这些粘附分子的表达被Western blot证实，并在SM22α^-/-VSMCs与WT细胞的比较(图2 (g)),这表明SM22α^-/-VSMCs具有促炎分泌表型。既往研究表明，在人类动脉粥样硬化斑块中，vsmc与巨噬细胞通过VCAM-1的表达直接接触[19]．为了进一步验证该VCAM-1通过分泌SM22α^-/-VSMCs介导巨噬细胞浸润，特异性sirna被用来敲低粘附分子的表达。我们发现，敲低VCAM-1显著降低了VSMCs与RAW264.7细胞之间的相互作用(图)2（h）)．同样，VCAM-1中和抗体消除了这种相互作用(图)2（i）)．这些发现表明SM22α.缺失通过VCAM-1的表达促进血管平滑肌细胞与巨噬细胞的相互作用。

３．３．巨噬细胞来源的circRasGEF1B诱导VSMC凋亡

人巨噬细胞通过Fas/Fas- l介导的细胞-细胞直接相互作用有效诱导VSMC凋亡[20.]．我们发现，与对照组相比，由脂多糖- (LPS-)激活的RAW264.7细胞的CM处理的VSMCs的凋亡活性增加了1.62倍(图)3（a）)，同时Bax表达增加，caspase-3切割，Bcl-2蛋白表达减少(图)3 (b)).消除TNF的影响-α.从凋亡的LPS激活巨噬细胞，VSMC被TNF处理的Raw264.7厘米诱导α.中和抗体。我们发现去除TNF-α.未消除RAW264.7 cm诱导的VSMCs凋亡(图3 (c))．此外，细胞凋亡SM22α^-/-vsmcs高于wt细胞（图3 (d))．

已知外源转录物可重新编程受体细胞基因的表达和功能[21- - - - - -25]为了检测巨噬细胞诱导VSMC凋亡的潜在介质，我们筛选并鉴定了一组在活化巨噬细胞中高度表达的非编码RNA（ncRNAs），包括lincRNA-Cox2、miR-146a、miR-155、circRasGEF1B、circRNA-010231、circRNA-010056和circRNA-003780[21，26- - - - - -30.]．其中，在活化的Raw264.7细胞及其厘米中，五种非编码RNA的表达增加;特别是，Circrasgef1b的增加更大（数字3（e）和3（f）)．尽管所有这些非编码RNA进行检测，circRasGEF1B的水平最高在与活化RAW264.7细胞的CM处理的VSMC（图3（g）)．此外，circRasGEF1B的表达对巨噬细胞是特异性的，因为在LPS处理后，它在VSMCs中表达低且不变(图)3（h）)．荧光进一步证实了这一结果原位杂交（FISH）分析。仅在经激活RAW264.7细胞CM处理的VSMC的细胞质中观察到荧光染色的圆环F1B（图3(我))这表明CircraseF1b是从巨噬细胞传递到血管平滑肌细胞的。

为了进一步确定巨噬细胞来源的circRasGEF1B引发VSMC凋亡，我们将pLCDH-circRasGEF1B质粒转染VSMC。过表达circRasGEF1B的VSMCs中tunel染色的细胞百分比和Bax/Bcl-2的比例增加(图)3 (j)和3 (k))．circrasgef1b介导的细胞凋亡更为严重SM22α^-/-VSMCs比WT细胞(图3(左))．这些数据表明CircrasgeF1B是一种新的巨噬细胞诱导VSMC细胞凋亡的介质。

3．4．ZFP36介导circrasgef1b诱导的vsmc凋亡程序

在对照组和circrasgef1b缺陷的巨噬细胞中，转录组范围的数据已通过RNA测序(RNA-seq)报告[13]．基于这些数据，我们通过高通量转录组分析确定了推定的差异表达基因(2倍变化截止)。在差异表达基因中，筛选出10个潜在的凋亡相关基因，包括Ada、Tnfrsf-26、Relt、Mif、Cd74、Nradd、Ticam1、Cd5、Zfp36、Zfp36l1 (Supplementary Table)3.)，而在circrasgef1b缺陷组中均下调。为了确定circRasGEF1B调控这些基因的表达，我们使用qRT-PCR检测了这10个基因在plcdh -circRasGEF1B转染的vsmc中的表达。我们发现，circRasGEF1B过表达后，ZFP36的mRNA水平明显上调(图)4(一)），伴随着增加ZFP36蛋白（图4（b）)．为了确定CircrasgeF1B如何上调ZFP36表达，在阻断DE Novo RNA合成中，在VSMC中的致癌术后，我们测量了ZFP36 mRNA半衰期。与对照组相比，ZFP36 mRNA的半衰期增加了CircrasgeF1B过表达VSMC（图4（c）)，表明ZFP36 mRNA的稳定性增强。为了确认ZFP36是否与circrasgef1b诱导的VSMC凋亡相关，我们在circrasgef1b过表达的VSMC中使用特异性sirna沉默ZFP36的表达(图)4（d））并显示ZFP36的敲除废除CircrasgeF1B诱导的细胞凋亡（图4（e）)，并伴有Bax/Bcl-2比值降低和caspase-3表达断裂(图)4 (f))，提示ZFP36介导circrasgef1b诱导的VSMCs凋亡。

3．5．circRasGEF1B引导ZFP36优先结合并衰减Bcl-2 mRNA在vsmc中

据报道，ZFP36家族通过与3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3-甲基-3 -它们的靶mrna与AU-rich element (ARE)的utr，以维持适当的靶转录本和蛋白水平，包括Bcl-2和ZFP36本身[31]．如上所述，过表达circRasGEF1B降低了Bcl-2的表达(图)3(左))．为了验证ZFP36升高与Bcl-2水平降低之间的因果关系，我们敲除ZFP36，在circrasgef1b过表达的VSMCs中显示Bcl-2 mRNA水平升高(图)5（a）)．为了检测ZFP36是否与Bcl-2 mRNA相互作用，我们分别使用抗ZFP36抗体和Bcl-2 mRNA探针进行RNA下拉。我们发现在circrasgef1b转染的VSMCs中，ZFP36蛋白和Bcl-2 mRNA的相互作用增加(图)5（b）和5 (c))．然而，circRasGEF1B的表达并没有增加其基因ZFP36蛋白含有富含AU元素（图互动5 (d)和5 (e))．

为了确定ZFP36优先结合的机制，ZFP36在CircrasgeF1B过表达的VSMC中粘附和衰减BCL-2 mRNA，首先使用RegRNA 2.0预测CircrasgeF1b的潜在RNA区域与两个mRNA和ZFP36蛋白质进行结合[32]和catRAPID计划[33]，并评估杂交效果用于通过RNAup服务器RNA-RNA对值[34]．在circRasGEF1B序列中观察到ZFP36蛋白的潜在结合区，且明显较低与ZFP36 mRNA结合相比，circRasGEF1B和Bcl-2 mRNA之间的值（补充表4和5）;也就是说，circRasGEF1B可能同时结合ZFP36和Bcl-2 mrna。这让我们进一步探索在ZFP36 mRNA存在的情况下，circRasGEF1B引导ZFP36优先结合Bcl-2 mRNA的机制。RIP和RNA下拉实验表明，在pLCDH-circRasGEF1B质粒转染的VSMCs中，circRasGEF1B抗体和circRasGEF1B探针均可获得ZFP36蛋白(图)5 (f)和5 (g))．与ZFP36 mRNA探针相比，Bcl-2 mRNA探针获得了更多的circRasGEF1B(图)5 (h))因此，在ZFP36 mRNA存在的情况下，circRasGEF1B使ZFP36优先与Bcl-2 mRNA结合。

3.6。circRasGEF1B可与ZFP36和Bcl-2 mrna以序列特异性方式直接相互作用

为了确定ZFP36在circRasGEF1B序列的结合位点，一系列circRasGEF1B缺失突变体被用来确定circRasGEF1B地区结合ZFP36。我们发现，突变体保留NT 161-310序列circRasGEF1B的必然ZFP36，而其他突变体完全丧失结合能力（图6(一))．此外，catRAPID预测circRasGEF1B的nt 244-302基元是ZFP36的结合位点。为了验证这一预测，我们将circRasGEF1B序列中ZFP36结合位点互补的阻断寡核苷酸转染到vsmc中。我们在RNA下拉实验中发现，阻断寡聚物抑制了circRasGEF1B与ZFP36的相互作用(图)6 (b))．此外，在RNA下拉和RIP实验中，circRasGEF1B与ZFP36的相互作用在转染circRasGEF1B的VSMCs中增强，而在circRasGEF1B缺失突变体中没有增强(图)6 (c)和6 (d))．

如上所述，杂化率较低与ZFP36 mRNA结合相比，circRasGEF1B和Bcl-2 mRNA之间的值（补充表4和5)为了进一步确认circRasGEF1B中Bcl-2 mRNA的结合序列，合成了一系列生物素化DNA探针，并分别与转染不同circRasGEF1B缺失突变体的VSMC孵育。随后用链霉亲和素珠将混合物拉下，然后进行实时PCR。我们发现保留nt 311-444的CircraseF1B突变体与Bcl-2 mRNA结合（图6 (e))．相比之下，circRasGEF1B缺失nt 244-302或311-444的突变体无法招募ZFP36来衰变Bcl-2 mRNA(图)6 (f))，导致VSMC凋亡减少（图6 (g)和6 (h))．这些数据表明，作为平台，CircrasgeF1b recrecation recom36选择性地衰减bcl-2 mRNA，并且可以是Zfp36-mRNA靶特异性的关键决定因素。

4。讨论

在目前的研究中，我们证明了这一点SM22α^-/-VSMCs易于与巨噬细胞相互作用，对细胞凋亡表现出更高的敏感性(图)7)．我们的研究结果强调(1)缺失SM22的VSMCsα.能够以vcam -1依赖的方式招募和激活巨噬细胞，创造炎症微环境;(2)巨噬细胞来源的circRasGEF1B通过招募ZFP36选择性地结合并衰变Bcl-2 mRNA来重组VSMC凋亡;(3) circRasGEF1B-ZFP36轴是巨噬细胞与VSMC通讯的新途径，是巨噬细胞决定VSMC命运的新机制。因此，可能通过靶向SM22调节VSMC表型到分化或修复状态α.或circRasGEF1B可减少巨噬细胞和VSMCs之间的有害通信，可能有利于主动脉瘤及其临床并发症的治疗。

SM22α.已被认为是SMC表型转换的标志之一[35，36].我们最近的研究证明SM22α.对于维持VSMC收缩表型和血管内环境稳定至关重要[37]，并因内皮损伤或肾素-血管紧张素系统激活而下调，促进VSMCs增殖和肥大[6，38]．血管平滑肌细胞缺失SM22α.可提供易受炎症影响的血管环境，使主动脉易于动脉瘤形成[10]．但是，SM22的角色α.在VSMC中，细胞凋亡仍然没有得到充分的研究α.显着提高了VCAM-1的表达和分泌，并导致巨噬细胞招募在活的有机体内和体外在Ang II处理下，SM22的表达被挽救而消失α.或通过VCAM-1中和抗体。SM22减少α.在各种vsmc驱动的血管疾病中，表达已被很好地定义。我们和其他研究为SM22的关键作用提供了进一步的证据α.在维持血管结构完整性和多种血管疾病的病理生理学方面，而不仅仅是作为收缩性SMC的生物标志物。尽管最近的研究认为SM22的影响α.AAA形成的缺乏不是通过增加细胞凋亡介导的[10]，这个结论是仅基于通过Western印迹在主动脉裂解的caspase-3的表达ApoE^−−/鼠标在活的有机体内研究和忽视的影响ApoE血管平滑肌细胞凋亡缺乏。Ang II-infusedApoE^-/-小鼠作为一种流行的动脉瘤研究小鼠模型，显示血管基质降解和炎症的变化可能远远超过观察到的变化SM22α^-/-AAV-SM22的作用体内α可能不足以改善这些病变ApoE^-/-老鼠。

巨噬细胞参与不稳定斑块和主动脉瘤的发病机制在过去十年中已经被明确。人巨噬细胞通过Fas/Fas- l介导的细胞-细胞直接相互作用有效诱导VSMC凋亡，促进斑块破裂[20.]．我们现在的研究提供了证据表明巨噬细胞通过Circrna介导的机制诱导VSMC凋亡。我们鉴定了一组高度表达在LPS激活的RAW264.7细胞中的非显着性RNA，并验证了CircrasgeF1B的表达在其中最高，并转移到VSMC中，与增加的细胞凋亡相关。虽然TNF的表达α.这是一种促凋亡细胞因子在活化的巨噬细胞中被诱导，我们发现，用TNF-处理的巨噬细胞CM处理后，VSMCs的凋亡仍然更高α.中和抗体。相反，si- circrasgef1b处理的细胞凋亡活性降低，Bcl-2表达增加。因此，circRasGEF1B是巨噬细胞诱导VSMC凋亡的新媒介。

在哺乳动物细胞中，细胞质mRNA的衰减是一个重要的转录后机制。细胞质mRNA半衰期的调节是由mRNA结合蛋白和非编码rna (ncrna)介导的，如microrna和长非编码rna [39]．富au元素(AREs)是控制mRNA衰减的最大的顺式作用元件组。ZFP36，也被称为三乙酰丙酶(TTP)，是一种古老的rna结合蛋白属于CCCH串联锌指蛋白家族和发挥了至关重要的作用在各种各样的生理过程维持合适的目标转录和蛋白质水平的正常细胞和组织内稳态调节ARE-containing mrna的表达包括自己的(40，41]．有报道称ZFP36可抑制Bcl-2表达，提高HNSCC细胞顺铂敏感性[42]．我们发现，circRasGEF1B过表达显著增加了ZFP36在mRNA和蛋白水平上的表达，并增加了ZFP36 mRNA在VSMCs中的稳定性。此外，ZFP36的表达降低了circRasGEF1B诱导的VSMCs的凋亡，提示ZFP36是circRasGEF1B影响VSMCs凋亡的一个靶点。我们进一步以序列特异性的方式验证了circRasGEF1B、ZFP36和Bcl-2 mRNA之间的相互作用。circRasGEF1B作为支架，招募ZFP36与Bcl-2 mRNA结合并衰减，促进VSMC凋亡。我们认为circRasGEF1B可能在确定ZFP36-mRNA靶点特异性方面发挥关键作用。

这项研究有几个局限性。已知活化的巨噬细胞通过膜受体途径释放炎症因子诱导VSMC凋亡。目前，尚不清楚巨噬细胞来源的circRasGEF1B和促凋亡因子激活通路如何相互作用和汇聚，以调控vsmc中Bcl-2 mRNA的稳定性。巨噬细胞也一样吗?有必要进一步研究该凋亡通路与circRasGEF1B其他功能之间的交叉。

总之，我们提供的证据表明SM22α^-/-VSMC有利于与巨噬细胞相互作用，由此产生的circRasGEF1B-ZFP36轴的激活是巨噬细胞诱导VSMC凋亡的一种新机制。

缩写

AAA级:	腹主动脉瘤
血管紧张素Ⅱ：	血管紧张素Ⅱ
是：	AU-rich元素
circRNA:	环状RNA
他:	苏木精和伊红
ICAM-1:	细胞间粘附分子-1
有限合伙人:	脂多糖
MCP-1：	单核细胞趋化蛋白1
撕裂:	RNA免疫沉淀反应
RNA-seq:	RNA序列
活性氧：	活性氧
siRNA的：	小干扰RNA
SM22α.：	平滑肌22α.
TNF：	肿瘤坏死因子
TUNEL:	末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记
UTR:	翻译区
vcam-1：	血管细胞粘附分子-1
VSMC：	血管平滑肌细胞
WT:	野生型。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 91849102, no . 91739301);河北省重点科研项目(no . 20375502D);河北省自然科学基金项目(no . H2019206212);河北省教育厅自然科学青年基金项目(QN2020167)。

补充材料

补充表1：PCR引物序列。补充表2：富集( ）SM22鉴定的与细胞粘附相关的差异表达蛋白α.VSMC条件培养基中的敲除。补充表3：强化培养基列表( ）通过circRasGEF1B敲低检测到RAW264.7细胞中与凋亡相关的差异表达基因。补充表4:预测ZFP36 mRNA的ncRNA杂交区域circRasGEF1B-ZFP36 mRNA双链的值。补充表5:预测Bcl-2 mRNA的ncRNA杂交区域circRasGEF1B-Bcl-2 mRNA双链的值。（补充材料）

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