文摘

贫血的慢性疾病(ACD)是第二个最常见贫血,经常发生在患者急性或慢性免疫激活。在目前的研究中,我们评估的治疗效果当归多糖(ASP)在ACD老鼠和潜在的机制。结果表明,ASP抑制炎症hepcidin HepG2细胞和ACD老鼠通过阻断il - 6 / STAT3和BMP / SMAD通路。在ACD老鼠,ASP表达式运铁素的增加,政府动员从肝脾铁,血清铁含量增加,导致海拔血清EPO(促红细胞生成素)和有效地缓解贫血。此外,ASP抑制NF -κ通过我B p65激活κB激酶- (IKKs)我κBα途径,从而减少的分泌白细胞介素- 6 (il - 6)和肿瘤坏死因子-α,这是众所周知的,抑制红细胞生成。我们的研究结果表明,ASP是一个潜在的治疗方案对患有澳洲牧牛犬。

1。介绍

贫血的慢性疾病(ACD或贫血的炎症)是一种获得疾病同时发生急性或慢性免疫激活,如感染、自身免疫性疾病和癌症(1]。铁体内平衡的失调,与铁封存相关细胞内的网状内皮系统(RES)和有限的可用性红细胞生成的铁,是一个主要的病理生理机制ACD (2]。这铁封存主要是肝脏抗菌多肽介导的3),铁稳态的中央监管机构,由炎症刺激宿主防御入侵的病原体。除了刺激hepcidin增加,增强炎症和细胞因子直接抑制红细胞生成和缩短红细胞生存活动,进一步为ACD的发展作出贡献。多种细胞因子,包括干扰素-α干扰素-β干扰素-γ肿瘤坏死因子-αil - 1,据报道,诱导细胞凋亡抑制红细胞生成的红细胞burst-forming单位(BFU-e)和克隆形成单位(CFU-e) [4]。此外,cytokine-inducible自由基,如一氧化氮、超氧化物阴离子(5),可以直接抑制红细胞祖细胞的增殖。促红细胞生成素(EPO)的形成,以及红色的祖细胞的响应性EPO(促红细胞生成素)的负面影响和调节炎症细胞因子(6]。缩短红细胞生存是归因于erythrophagocytosis巨噬细胞激活炎性细胞因子(7]。

贫血会损害病人的性能的发展,生活质量,或其他潜在慢性疾病的预后,因此,贫血的直接治疗被认为是治疗潜在疾病时是不可行的。输血,erythropoiesis-stimulating代理(esa)和静脉注射铁已经引入了ACD治疗在临床实践中。虽然,这种疗法成功的病人或有限造成不利影响,如死亡率增加,感染的风险,铁过载,或复发的癌症1,8]。因此,有必要对有限的高效药物的副作用ACD的治疗。

的根源当归(摘要)。一昼夜的(答:中国),也称为“当归”在中国,一直在历史上使用处方或功能食品补充血液,治疗妇科疾病,防止炎症(9]。几个负责这些生物活性物质中,多糖的研究。当归水溶性酸性多糖多糖(ASP),分离和纯化的根源答:中国。我们以前的研究表明,ASP降低血清hepcidin水平和调节体内铁稳态缺铁性贫血大鼠(10,11]。此外,ASP发挥抗炎作用通过抑制T淋巴细胞增殖伴刀豆球蛋白A-induced小鼠肝损伤(12]。然而,ASP的影响及其在治疗贫血的慢性疾病潜在机制尚未研究。

在目前的研究中,从根中提取的ASP答:、和ASP对ACD的影响评估的ACD诱导的大鼠模型注射完全弗氏佐剂(CFA)。ASP的antihepcidin机制相关的炎性细胞因子进行调查,和ASP的潜在目标BMP / SMAD信号是探索在体外和在活的有机体内。这些研究将提高我们理解ASP如何提高了ACD和将支持ASP的商业应用。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

标准糖是从Sigma-Aldrich化学公司获得的。人类肝细胞癌(HepG2)细胞从同济医科大学获得。胎牛血清(的边后卫)、DMEM培养基,胰蛋白酶EDTA,青霉素,链霉素获得Gibco(美国纽约大岛)。Anti-mouseβ肌动蛋白抗体,辣根过氧化物酶,(合)共轭anti-mouse和anti-rabbit二级抗体购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。主要抗体STAT3 SMAD4、p-STAT3 p-SMAD1/5/8, Hepcidin, p-JAK2, SOCS3, BMP6, Id1、运铁素,研制铁蛋白、IKKαNF -κB,》κBα、Histone3.1 GAPDH是获得细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验设备购买从Beyotime生物科技(中国)。所有其他试剂和化学试剂均为分析纯。

2.2。植物的收集和制备ASP

的干燥根答:中国(伞形科)从欧盟得到医院和收集从Minxian(甘肃省,中国)2013年10月。植物鉴别是由教授Jinlan阮(学院制药科学,同济医学院的华中科技大学,武汉,中国)按照药典的识别标准的中华人民共和国。ASP分离和纯化如前所述13]。短暂,切根(200克)与1 L煮两次每次100分钟的蒸馏水。水中的酸性和碱性蛋白质提取物被调节pH值删除使用Ca(哦)₂和3 M H₂所以₄。粗多糖是通过添加一个相同体积的乙醇。经过反复冻结解散和透析(3500 Da),纯化ASP(收益率2.76%;phenol-sulfuric酸糖含量的方法,95.1%)最终准备通过与交联葡聚糖凝胶过滤色谱G-50和冻干。ASP的测定相关的化学结构是由各种光谱分析如前所述[13]。

2.3。动物

动物保健和实验程序依法进行机构的指导方针的动物保健和使用委员会同济医学院和美国国立卫生研究院的指导实验室动物保健和使用的(许可证号码:SYXK(湖北)2010 - 0057)。男性Sprague-Dawley老鼠(同济医学院动物中心,武汉,中国)都保存在一个标准的啮齿动物的饮食,直到他们达到一个6周的时代,他们重160 - 180克。动物可以免费获得食物和水,按照制度和政府指导方针被安置在动物设施的华中科技大学12小时光暗周期和平均温度20°C±1°C。

老鼠在0天接种的皮下注射0.15毫升的CFA (Chondrex数7027年,华盛顿,美国),含有10毫克/毫升的分枝杆菌的爪子每个大鼠左后肢。对照组大鼠皮下注射0.85%无菌生理盐水。ASP的实验中,控制老鼠和一群CFA-injected老鼠收到一封intragastrical 1毫升的水管理(ACD)每天4周。一群CFA-injected老鼠治疗腹腔内(IP)与erythropoiesis-stimulating代理(ESA);重组人促红细胞生成素,阳光药业有限公司,沈阳、中国)剂量的2000 U /公斤体重(BW)三次连续三天,从CFA注射后25天。另一个群CFA-injected老鼠intragastrical对待政府的ASP在两个剂量(0.5 (ASP1)或1.0 (ASP2)克/公斤体重),一个intragastrical管理双氯芬酸钠(5毫克/公斤BW,先声药业、江苏、中国)单独(DF)或双氯芬酸钠和ESA (DF / ESA)为28天,从天0 CFA注射后。

治疗4周后,大鼠麻醉注射3%戊巴比妥钠(150毫克/公斤),从尾静脉和收集的血液,然后,老鼠被安乐死。肝脏和脾脏收获铁含量,蛋白质提取,或免疫组织学。

2.4。血液和铁的分析

确定血红蛋白(Hb)浓度,红细胞(RBC)数和白细胞(WBC)计数、血液、乙二胺tetra-acetic酸-包含真空管(EDTA),分析了自动血液计数器(mek - 6318 k,日本Kohden,东京,日本)。血清铁和脾脏铁含量测定用火焰原子吸收光谱仪(aa - 240 FS模型,瓦里安有限公司位于加州帕罗奥图的CA,美国)。il - 6和TNF -的决心α浓度进行了使用商用ELISA试剂盒获得研发系统(明尼阿波利斯,美国)。血清hepcidin、铁蛋白和红细胞生成素水平测定的酶联免疫吸附试验(ELISA)根据制造商的指示(USCN生命有限,休斯顿,德克萨斯州,美国)。

2.5。Perl的普鲁士蓝染色

脾组织在4%多聚甲醛溶液固定2周后脱钙作用过程。脱钙作用后,样本处理,嵌入在石蜡切片。脾脏组织的幻灯片是沾染了Perl的普鲁士蓝的解决方案(HT20-1KT,西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟在室温和与中性红复染色根据总体评价的标准程序。幻灯片是由一个光学显微镜检查(Eclipse Ci尼康,尼康公司(日本东京)。

2.6。细胞培养和治疗

人类肝细胞癌(HepG2)细胞在DMEM培养基培养补充10%的边后卫和1%青霉素和链霉素溶液在37°C公司5%₂。HepG2细胞被播种到six-well板1×10⁶细胞每口井。有限合伙人的待遇,HepG2细胞刺激了1μg / mL有限合伙人(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)存在与否的ASP 24小时,然后收获信使rna和蛋白质分析。测定细胞培养上清液中il - 6的浓度进行了使用人类il - 6得到的酶联免疫试剂盒研发系统(明尼阿波利斯,美国)。HepG2细胞il - 6的治疗,使用ASP 16小时,随后被孵化50 ng / mL重组人il - 6(美国康涅狄格州PeproTech,落基山)另一个8小时。BMP6治疗,与50 ng / mL BMP6 HepG2细胞刺激(美国康涅狄格州PeproTech,落基山)存在与否的ASP (200μg / mL)为24小时。AZD1480 (5μ米,Selleckchem S2162)和ldn - 193189 (1μM, Selleckchem S2618)准备在DMSO溶液的解决方案和应用于HepG2细胞暴露在刺激前30分钟。此外,同样体积的DMSO作为并行添加车辆控制。

2.7。定量实时聚合酶链反应

HepG2细胞总RNA提取使用试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。使用一体化™互补DNA合成第一链cDNA合成装备(美国GeneCopoeia)。定量逆转录聚合酶链反应(存在)是7900年ABI实时PCR系统(美国Illumina公司,圣地亚哥,CA) 40周期使用一体化qPCR SYBR绿色混合(美国GeneCopoeia)。引物是购买商业(Tsingke生物技术,北京)。使用的引物序列如下:Hamp贷款,5-CAACAGACGGGACAACTTGCA-3 ,和反向,5-AGTGGGTGTCTCGCCTCCTT-3 ;β肌动蛋白,5——AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3 ,和反向,5-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 。循环阈值差异(ΔCt)值减去Hamp贷款的Ct值β肌动蛋白Ct(ΔCt = Ct_Hamp贷款−Ct_{β肌动蛋白})。结果表示为手段的褶皱Hamp贷款相对基因表达的变化β肌动蛋白(2^−ΔΔCt)±SEM, 。

2.8。西方墨点法

核提取物是从LPS-induced准备HepG2细胞使用商用核/胞质提取工具包(Beyotime,上海,中国),用于免疫印迹分析NF -κB的表达。总蛋白提取准备从里帕nitrogen-frozen鼠肝脏或HepG2细胞裂解缓冲(50毫米Tris-HCI pH值在7.4150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,和0.1% SDS)包含PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(Beyotime、上海、中国)和被用于其他的蛋白质免疫印迹分析表达式。蛋白质含量是由bicinchoninic酸测定(BCA化验,Beyotime,上海,中国),和80年μg总蛋白质的10% sds - page分离,转移到硝酸纤维素(数控,Amersham淀粉微球的生物技术,英国)。2 h的膜被封锁在室温下以5%脱脂奶或5% BSA在TBST然后探测STAT3抗体,phospho-STAT3——(Tyr705)抗体,SMAD4抗体,phospho-JAK2抗体,phospho-SMAD1/5/8抗体,NF -κB p65抗体,phospho-IκBα抗体,IKKαSOCS3抗体,抗体Id1抗体,BMP6抗体,抗体,运铁素铁蛋白抗体,hepcidin抗体。GAPDH或β肌动蛋白被用作加载控制。膜被清洗和孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭anti-mouse或anti-rabbit二级抗体在室温下2小时。膜是如上所述,再次清洗,然后,开发增强化学发光(ECL,热科学,沃尔瑟姆,妈,美国)和可视化基因Gnome XRQ(英国Syngene)。蛋白质水平量化使用ImageJ微程序(美国国立卫生研究院的版本1.48 v)。

2.9。免疫荧光染色

HepG2细胞被固定为4%甲醛和冰冷的甲醇处理10分钟−20°C。在PBS阻塞后5% BSA和0.3% Triton x - 100 1小时在室温下,这些细胞被孵化phospho-STAT3 - (Tyr705)抗体在PBS稀释1% BSA和0.3% Triton x - 100一夜之间在4°C。一个Alexa萤石488 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)作为第二抗体,在PBS稀释0.1%渐变20和1小时在黑暗中孵化,其次是与DAPI染色10分钟。幻灯片使用荧光显微镜观察(尼康竞走,尼康公司,东京,日本)。

2.10。统计分析

并给出了数据意味着±标准错误的意思(SEM)。对比多个组在这项研究是由单向方差分析(方差分析)与LSD(假设等于方差)或Dunnett T3(不是假设等于方差)的事后分析。一个纠正值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有数据用SPSS 19.0版软件进行了分析(美国SPSS,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。ASP的化学结构

一种水溶性酸性多糖提取的根源答:中国。总碳水化合物的比例确定为95.5%。如图1(一),它表现出一个和对称峰HPGPC分析,揭示,ASP是一个齐次多糖、和分子量测定80 kDa,根据保留时间。ASP的主链是由(1→3)联系galactopyranose(加p),(1→6)加有关p,2-OMe -(1→6)加有关p,有三个侧链连接到O-3 2-OMe -(1→6)加有关p和终止(1→)glucopyranuronic酸(相关有关p)和阿拉伯呋喃糖(Araf)(图1 (b))。

3.2。ASP改善贫血和增加促红细胞生成素在老鼠遭受ACD生产

如图2CFA免疫后28天,平均Hb浓度和红细胞计数的ACD大鼠下降了36.38 g / L和1.43×10¹²分别/ L ( 和 ),这表明在ACD鼠群严重贫血。平均Hb浓度ASP-treated老鼠的ACD大鼠相比显著增加。此外,当使用ASP的剂量1.0 g / kg, Hb浓度统计相似( )控制老鼠,类似于ESA的效果。此外,这种效果是伴随着提高ASP治疗后红细胞计数与未经处理的ACD大鼠( 和 )(图2 (b))。在平行,双氯芬酸和ASP治疗导致的白细胞计数显著降低相比ACD老鼠(图2 (c))。根据这些结果显示,用ASP治疗有效地逆转了小鼠炎症性贫血。血清EPO水平没有显著不同的ACD老鼠和控制之间的老鼠(图2 (d))。相比之下,ASP治疗剂量的0.5和1.0克/公斤)促红细胞生成素刺激生产22.85±2.0,19.7±2.1 U / L,分别比ESA和双氯芬酸。

3.3。ASP治疗减少炎性细胞因子抑制NF -生产κB信号

炎症参与ACD的机制,因此,我们研究了ASP在ACD大鼠对炎性细胞因子的影响。数据3(一个)和3 (b)显示ASP治疗显著降低血清TNF -α和il - 6水平。免疫印迹显示ASP降低NF -κB p65表达式。进一步探索ASP-reduced NF -的机制κB p65激活,我们分析了IKK的表达式α和磷酸化κBα。有趣的是,我的表情κBα磷酸化和IKKαASP治疗后显著降低。

确定的参与NF -κB抑制hepcidin ASP的表达式,我们与LPS对HepG2细胞,激活NF -κ通过toll样受体4 - B (TLR4)相关的信号通路在肝细胞(14]。如图3 (d),有限合伙人hepcidin mRNA水平增加3.5倍,由ASP剂量依赖性抑制。同时,hepcidin LPS诱导蛋白表达明显减少了ASP治疗(图3 (g))。此外,免疫印迹分析表明,ASP显著抑制》κBα表达和NF -核易位κB p65。接下来我们分析了细胞培养上清液中il - 6含量ELISA。提出了图3 (e)由有限合伙人引发,ASP的摄入量有关改善il - 6分泌。同意减少il - 6水平,STAT3磷酸化显著抑制了ASP。

3.3.1。ASP政府抑制Hepcidin表达式通过阻断JAK2 / STAT3和BMP / SMAD信号

我们下一个评估了ASP的抑制作用inflammation-induced hepcidin表达式在ACD老鼠。如数据所示4(一)和(c),用ASP治疗大大降低血清hepcidin水平和抑制hepcidin表达式在ACD大鼠肝脏相比,平行的唯一ESA治疗,仅双氯芬酸治疗,和ESA /双氯芬酸治疗相结合。

澄清上游信号通路调节hepcidin表达式,然后,我们调查了inflammation-inducible JAK2 / STAT3通路鼠肝脏。如图4 (c)p-JAK2的表达式和ACD p-STAT3在很大程度上增加了老鼠,但被ASP治疗(减毒 )。类似的结果是证明SOCS3的表达,一个中央监管机构的il - 6 / STAT3信号。BMP6和SMAD4蛋白表达后,极大地降低了ASP治疗。此外,p-SMAD1/5/8水平在ACD大鼠明显增加但被ASP减毒。Id1、BMP / SMAD信号激活的指示器,由ASP强烈抑制。总的来说,这些结果表明,ASP抑制hepcidin表达式通过减少JAK2 / STAT3和BMP / SMAD激活在一只老鼠的ACD模型。

BMP / SMAD hepcidin表达的信号是主要的调节途径,我们研究了ASP的影响BMP6-mediated SMAD1/5/8磷酸化和hepcidin感应HepG2细胞。如图4 (b)后,p-SMAD1/5/8 hepcidin mRNA水平显著增加BMP6挑战但减毒的ASP。探讨ASP如何阻止BMP6-mediated SMAD1/5/8磷酸化和hepcidin感应,我们对HepG2细胞ldn - 193189, BMP I型受体的抑制剂。结果表明,ldn - 193189有效地阻止SMAD1/5/8磷酸化和hepcidin感应,而且没有观察到显著变化与ASP治疗。综上所述,这些研究结果表明,ASP抑制SMAD1/5/8磷酸化和BMP6 hepcidin激活诱导,并且可能会出现这种效果通过抑制绑定BMP6 BMP I型受体。

3.3.2。ASP变弱IL-6-Mediated STAT3磷酸化和Hepcidin感应

il - 6是一个主要的司机inflammation-inducible hepcidin表达式在ACD (15),我们下一个调查ASP是否修改IL-6-induced hepcidin表达式。il - 6刺激hepcidin mRNA和hepcidin蛋白表达显著增加。提出了图5 (d)ASP剂量依赖性降低hepcidin mRNA水平。它还减少hepcidin蛋白质表达和抑制il - 6 p-STAT3感应。ASP的存在降低了SMAD4表达式,有趣的是,尽管SMAD信号被il - 6不刺激。免疫荧光染色的p-STAT3显示ASP显著降低p-STAT3核易位引起il - 6(图5(一个))。

进一步探索ASP的机制抑制IL-6-induced STAT3激活和hepcidin表达式,我们检查了ASP在JAK2的激活的影响。提出了图5 (c)ASP显著降低JAK2磷酸化。1480年AZD JAK2抑制剂,有效地阻止了JAK2磷酸化和hepcidin激活诱导il - 6。AZD1480-treated细胞,ASP没有显著调节JAK2磷酸化和hepcidin表达与IL-6-treated组。这些结果表明,ASP施加的抑制作用IL-6-induced STAT3磷酸化和hepcidin激活,可能通过抑制JAK2激活。

3.4。治疗以ASP动员铁和改善Hypoferremia老鼠遭受澳洲牧牛犬

铁的失调ACD的体内平衡是一个重要的病理生理机制,因此,我们接下来研究了ASP对铁代谢的影响。普鲁士蓝染色显示明显的铁积累在ACD大鼠的脾脏,这铁保留也改善了ASP治疗(图6(一))。血清铁含量显著增加了ASP ( , )和双氯芬酸钠( )治疗ACD大鼠相比,脾脏铁含量减少(数字6 (b),6 (c)和6 (d))。运铁蛋白质免疫印迹分析表明脾脏的表达,这是防止铁减少射流等离子体在ACD老鼠,恢复了ASP治疗(图6 (e))。此外,铁储存蛋白质在脾脏铁蛋白水平明显升高在ACD老鼠,ASP治疗后下降。这些变化在脾脏平行增加运铁素在肝脏和肝铁蛋白表达减少了ASP治疗。同意在脾脏和肝脏铁蛋白水平的降低,血清铁蛋白水平与ASP政府明显下降。综上所述,这些研究结果表明,ASP治疗中和铁保留在RES hypoferremia改进。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们提供了新的有效治疗的证据ACD的水溶性酸性多糖答:中国,不仅抑制炎症hepcidin也减少炎性细胞因子分泌通过抑制NF -κB激活。

目前研究的很透彻,炎症诱导hepcidin表达式主要由il - 6、il - 6受体结合和gp130然后新兵Janus激酶2 (JAK2)使磷酸化STAT3在酪氨酸残基70516,17]。此外,磷酸化STAT3把原子核和结合STAT3-responsive hepcidin子元素,导致hepcidin基因的转录。肝脏特异性STAT3基因敲除或il - 6基因敲除小鼠表现出衰减hepcidin感应或贫血对炎症刺激反应(18,19]。一致,ASP抑制STAT3磷酸化和核易位以及hepcidin诱导il - 6的刺激下,那就是,至少部分归因于JAK2激活的抑制。同时,用ASP治疗ACD大鼠显著抑制JAK2 / STAT3激活。另外,我们观察到ASP在ACD大鼠il - 6分泌减少和LPS-induced HepG2细胞,导致减少JAK2 / STAT3信号,进一步导致hepcidin抑制。

BMP / SMAD信号也会导致hepcidin感应在炎症条件下,可能通过激活素B和SMAD-STAT3交互hepcidin启动子(20.,21]。每个绑定到BMP 2型受体和BMP coreceptor hemojuvelin (HJV),与HFE交互/转铁蛋白受体2 (TfR2) [22]。相互作用导致BMP-type我受体磷酸化,磷酸化I型受体启动转录因子的磷酸化SMAD1/5/8,随后形成一个复杂的和SMAD4把原子核诱导hepcidin基因的转录22,23]。最近的一份报告表明,BMP6直接激活SMAD1/5/8信号和诱发hepcidin表达独立的交互HJV / HFE TfR2 [24]。值得注意的是,BMP / SMAD通道的堵塞变弱IL-6-induced hepcidin表达式HepG2细胞和小鼠SMAD4-KO [25,26]。在这项工作中,我们发现,ASP阻塞BMP6-mediated SMAD1/5/8磷酸化和Hamp贷款感应显示没有响应BMP-type我受体被抑制ldn - 193189。符合在体外结果,ASP减少SMAD1/5/8磷酸化在一只老鼠的ACD模型。同时,BMP6 ASP治疗后表达降低,这可能会减少与细胞内铁含量的减少有关。因此,抑制BMP6绑定BMP-type我受体通过ASP可能是一个潜在的机制参与的封锁BMP / SMAD信号。

Transferrin-bound铁红细胞生成等离子体是一个独家源码,和大部分的铁来自衰老红细胞的循环巨噬细胞(27]。铁出口国是唯一知道运铁素负责铁从巨噬细胞脾脏和肝脏和回收衰老红细胞的等离子体。Hepcidin控制等离子体的浓度铁绑定然后运铁素引发内化运铁素和退化。肝脏抗菌多肽运铁蛋白质降解的限制的释放铁在脾、肝巨噬细胞和浆铁浓度降低,从而导致iron-restricted红细胞生成和贫血。在ACD的鼠模型中,我们观察到铁蛋白表达增加,在脾脏和肝脏,和铁积累在脾脏和血清铁降低,表明铁转移,从流通到研究然而,我们发现高度显著升高血清铁和ASP治疗4周后血清铁蛋白减少。此外,hepcidin表达的抑制ASP大幅调制从脾脏和肝脏铁运输所反映的表达式在脾脏和肝脏运铁素的增加,减少一起脾脏铁和铁蛋白表达在ACD大鼠的脾脏和肝脏。这些结果表明,ASP抑制炎症hepcidin表达增加铁动员和还原血红蛋白合成的铁供应。

炎性细胞因子在红细胞生成的抑制效果收益与hepcidin-mediated铁保留在ACD的发展。糖蛋白激素促红细胞生成素是一个重要的生长因子对于红色的祖细胞,结合其受体(EPOR)造血祖细胞激活下游JAK2 / STAT5 PI3K / AKT,和MAPK通路,因此,促进红细胞前体细胞分化、存活、增殖(28]。等离子患有ACD的EPO水平往往与Hb水平低,和增强的炎性细胞因子,主要是il - 1、TNF -α,负责EPO形成的缺陷29日]。在这项研究中,研究结果表明,ASP治疗显著降低生产的促炎细胞因子il - 6和TNF -α在有ACD的老鼠。此外,用ASP治疗明显增加血清EPO水平。因此,它是可能的,ASP增加促红细胞生成素生产,不仅通过减少炎性细胞因子的生产,还通过刺激内源性促红细胞生成素分泌。

最重要的是,我们发现,增加铁动员,以及减少炎性细胞因子,显著增加血红蛋白和红细胞水平ASP治疗4周后。在炎症的存在直接影响红细胞生成,红细胞生成的铁消费下降,以避免铁过剩的红细胞受损机械(30.]。拯救抗炎抑制红细胞生成的干预会增强antihepcidin干预的治疗效果,旨在提高铁的可用性。完全,我们表明,一种天然多糖在ACD有效地扭转贫血,不仅通过抑制hepcidin表达式也通过降低炎症细胞因子的生产,后续增加铁可用性和抑制红细胞生成的救援。

然后,我们探索ASP抗炎作用的分子机制。NF -κB在调节炎性基因表达中发挥着关键作用,它诱发转录的促炎细胞因子,包括TNF -α,il - 1β,il - 6 (31日]。NF -κB激活抑制剂调控的κ(我κB),我κB激酶(IKKs),激活IKK启动κBα磷酸化(32]。磷酸化我κBα然后ubiquitinated,随后被蛋白酶体降解,从而使NF -κB蛋白可能促使细胞核和诱导促炎基因的转录32]。在目前的研究中,ASP治疗导致IKK的显著减少α和磷酸化κBα表情,随后,抑制NF -κB在老鼠遭受ACD p65激活。同样的,我们观察到ASP压制我的磷酸化κBα然后阻止核易位NF -κB在LPS-induced HepG2细胞。因此,抑制NF -κB p65激活通过ASP是一个潜在的机制参与炎性细胞因子减少,进而促进antihepcidin ASP的影响。

总之,我们证明了ASP的有效抑制剂时肝脏抗菌多肽表达HepG2细胞和老鼠的ACD模型通过阻断BMP / SMAD和il - 6 / STAT3通路。ASP管理提高了铁的可用性,废除了的红细胞生成抑制炎性细胞因子,有效逆转通过抑制炎症hepcidin和NF -贫血κB激活在ACD老鼠(图7)。我们的工作提供了有价值的结果自然ASP作为一个潜在的治疗选择或补充药物患者从澳洲牧牛犬。

的利益冲突

作者声明在本研究没有利益冲突。

确认

本研究得到了国家自然科学基金(批准号81274151也没有。81403205),作者想表达我们的感谢华中科技大学分析测试中心的科学和技术。