新alibernet红葡萄酒提取物对自发性高血压大鼠一氧化氮和反应性氧物种生产的影响

摘要

我们的目标是对alibernet红葡萄酒和无酒精alibernet红葡萄酒提取物（AWE）进行化学分析，并研究AWE对一氧化氮和反应性氧物种生产以及血压发育的血压发育在正常的Wistar Kyoto（WKY）和自发性高血压大鼠（SHRS）。在葡萄酒和敬畏中测量总抗氧化能力与总酚类和选定的矿物质含量。年轻的6周龄雄性Wky和Srr被敬畏（24,2 mg / kg /天）治疗3周。在组织中确定总NoS和SOD活性，eNOS和SOD1蛋白表达和超氧化物产生。与葡萄酒相比，抗氧化能力和酚醛含量明显高。AWE在SHR的左心室，主动脉和肾脏中增加了NOS活性，而它在WKY大鼠中没有改变NOS活性。类似地，仅在SCR中观察到血浆和左心室的增加的SOD活性。eNOS和SOD1表达没有变化。总之，敬畏中包含的酚类和矿物质可能直接促进SHR的NOS和SOD活性增加。然而，3周的AWE治疗未能影响SHR的血压。

1.介绍

最近的研究结果支持了一种观点，即天然生物活性化合物可能有助于预防和治疗心血管疾病，尽管对个人的益处可能取决于他们的基因特征[1.–7.]．在人类饮食中广泛分布的食品中，红葡萄酒吸引了相当大的兴趣，作为生物活性化合物如多酚和矿物质的潜在来源[8.–10]．

到目前为止，一些研究已经提出了红酒对心血管疾病，特别是高血压发挥有益作用的机制。这些机制主要涉及通过增强一氧化氮合酶（NOS）活性和一氧化氮生成来增加血管舒张和降低血压[11–15]此外，红酒可以调节内源性抗氧化酶的活性，从而增强机体抵御氧化应激的功能[16,17]．

多酚和矿物质是在红葡萄酒中存在的主要生物活性化合物之一。虽然红葡萄酒多酚化合物是众所周知的，但其直接自由基清除，抗氧化剂，抗炎，抗血小板聚集和脂质代谢改善活动[18,19[红色葡萄酒中存在的矿物质的影响很少。红葡萄酒含有许多微量元素，如镁，锌，钾和锰对内源性抗氧化系统的适当功能[8.,20.]．越来越多的证据表明，矿物质能够抵消心血管、代谢和其他疾病的发展[21,22]．矿物质在人体中的积极作用与其通过催化抗氧化酶来增强身体抗氧化防御系统的活性的能力有关。例如，在食品中发现的几种矿物质，如铜，锌和锰，对于超氧化物歧化酶（SOD）的活性至关重要，是一种关键的抗氧化酶[23,24]．

一氧化氮合酶活性的调节似乎是不同多酚化合物调节血压最有希望的工具。已经证明,口服的红酒多酚化合物可以减少心肌纤维化,防止主动脉瓣增厚,减弱主动脉反应对去甲肾上腺素的增加,防止减少acetylcholine-induced endothelium-dependent放松,而且,在没有缺陷在老鼠,降低血压。这些变化与NOS活性的增加、内皮NOS表达的适度增加和氧化应激的减少有关，这些因素可能是红酒多酚化合物的有益作用的原因[25,26]．此外，Bernátová等人的研究表明，红酒多酚(Provinols)甚至能加速血压下降，改善发达形式的心血管结构和功能变化-NITRO-L-精氨酸 - 甲基酯（L-名称） - 诱导的高血压[27]．

尽管对心血管障碍有望的关注，但仍然缺乏实验研究。本研究提供红葡萄酒和红酒提取物的综合化学分析，以评估红葡萄酒化合物对NoS和SOD活性，eNOS和SOD1表达的影响，以及正常肌肤和自发性高血压大鼠的血压发育。

2。材料和方法

2.1.化学品

没食子酸、Folin-Ciocalteau试剂、过硫酸钾、超氧化物钾、Trolox和SOD检测试剂盒取自Sigma-Aldrich。ABTS分析使用的商业试剂盒Randox TAS购自英国Antrim的Randox实验室。Lucigenin购自Fluka。其他试剂均为分析级。

审查的葡萄酒是从斯洛伐克州文化研究所（Modra，Slovakia）获得的葡萄酒。alibernet红葡萄酒样品受到脱醇，浓度的过程，产生无酒精的十次浓缩alibernet红葡萄酒萃取物（AWE）。

２.２.艾力伯内特红葡萄酒和AWE特性

2.2.1。总抗氧化能力的测定

在Alibernet葡萄酒和AWE样品中，TAC使用Thermo Spectronic Genesys 20紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)进行分光光度测定。TAC采用商业试剂盒Randox TAS(自由基ABTS;Randox实验室，安特里姆，英国)根据制造说明。抗氧化能力以Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基铬-2-羧酸)等价物(mmol/L)表示。

2.2.2.总酚含量的测量

使用folin-ciocalteau反应确定总酚醛含量[28通过分光光度法测定在热光谱基因20 uV可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Ma，USA）上。使用Gallic acid作为标准在760nm下测量吸光度。TPC以小酸等同物（GAES）表示。

2.2.3。矿物质的测定

红酒和敬畏石墨炉原子吸收光度法测定元素组成方法使用乙炔/氩火焰原子吸收光谱仪(瓦里安谱AA 220 FS,澳大利亚)铜、锌、硒、铅、伊势(钾离子选择性电极)的决心,和测光(瑞士罗氏公司设备、模块化E 170)钙,镁，磷和铁的测定。

２.３.动物研究

2.3.1.动物和治疗

所有程序和实验协议都是由斯洛伐克科学院正常和病理生理学研究所的伦理委员会批准，并符合欧洲动物保护和研究动物用途的指导方针。

男性6周龄旧的vistar京都（WKY）和自发性高血压大鼠（SHR）分为对照组，持续治疗的组（24,2毫克/千克/天）3周（各组）。提取物在自来水中给药。为确保每只动物获得完整量的AWE，计算出的液体提取物量在适当体积的水中给每个笼子，并根据动物的耗水量进行调整。在实验前1周，分别估计每只动物的日耗水量实验期间，控制耗水量。将所有动物饲养在22–24°C的温度下，并随意喂食常规颗粒饲料。每周采用无创尾袖容积描记法测量收缩压（SBP）。

治疗3周后处死动物，测定体重(BW)和心脏重(HW)。取左心室、主动脉和肾脏标本，检测NOS、SOD活性及eNOS、SOD1蛋白表达。测量左心室和主动脉的超氧化物水平。测定血浆总抗氧化能力和SOD活性。

2.3.2。总NOS活性和eNOS蛋白表达

通过测量形成[的形成，在LV，主动脉和肾脏的粗祖制度中确定总NOS活性。^3.H] -来自[^3.H] -L-精氨酸如前面由Bredt和Snyder描述，Pecháęová等人的微调修改。[29,30.]．[^3.H]- l瓜氨酸用Quanta Smart TriCarb Liquid闪烁分析仪(Packard Instrument company, Meriden, CT)测定。NOS总活性以pkat/g蛋白表达。

对于eNOS蛋白表达，根据Pecháðová等人制备样品。[31]．电泳后，将蛋白转移到硝化纤维素膜上，用兔抗enos抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.， USA)进行检测。结合抗体采用二次过氧化物酶偶联抗兔抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.， USA)检测。使用增强型化学发光系统（ECL，Amersham，UK）来可视化频段，并使用光上置的V.99软件进行密度测量分析。

2.3.3.总SOD活性和SOD1蛋白表达

使用SOD测定试剂盒（Fluka）分析SOD活性。使用微孔板读取器（Thermo Scientific Multican Fc，Finland），在450nm处读取吸光度。使用SOD标准的活性计算SOD活性，结果在组织中的血浆或U / mg蛋白质中的U / mL表达。

对于SOD1蛋白表达，在电泳之后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用多克隆兔抗SOD1抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，USA）探测。结合抗体采用二次过氧化物酶偶联抗兔抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.， USA)检测。使用增强型化学发光系统（ECL，Amersham，UK）来可视化频段，并使用光上置的V.99软件进行密度测量分析。

2.3.4。血浆的总抗氧化能力

使用脱色测定法测定血浆中的TAC，并表示为Trolox当量抗氧化能力（TeaC）。样品的抗氧化能力会影响ABTS自由基（3分钟，37℃）的脱滤液的变化，在720nm处测量分光光度测量[32]．以Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基铬-2-羧酸)为标准品，以mmol/L表达。

2.3.5。超氧化物水平的测量

超氧化物(）使用Lucigenin-Enhuced Chemilencence进行评估[33]．主动脉和左心室被切成15毫克湿重的小块。在平衡和适应黑暗条件后，将样品加入荧光素溶液中，每30秒在Turner Designs TD-20/20光度计中测量5分钟。结果以相对发光单位/mg组织(RLU/mg组织)提供。

2.4。统计数据

对于alibernet红葡萄酒和敬畏表征，数据显示为平均值±标准偏差（SD;）.Pearson的测试评估了统计显着性，这适用于使用GraphPad Prism 4软件（GraphPad Software，San Diego，CA）的少量样品。

对于动物研究，使用单向分析和DUNCN试验用于统计分析。如果概率值小于0.05（).结果以平均值±标准差表示。

3.结果

3.1.阿利伯内特红葡萄酒和AWE特性

3.1.1。总抗氧化能力和酚醛含量

红酒的抗氧化能力略高于35 mmol/L，而红酒提取物的抗氧化能力达到376 mmol/L。这意味着AWE中TAC的含量大约是艾利贝内特红酒的10倍。结果显示在表中1.这也证明了提取过程并未影响红酒提取物的抗氧化性能。

由Folin-Ciocalteau比色法测定的alibernet葡萄酒样品的总酚含量在葡萄酒中的葡萄酒和葡萄酒中的24172mg / L高于24172mg / L的Galicid酸等同物中。

我们的研究在这里建立了淡醇的alibernet红葡萄酒萃取物，与alibernet红葡萄酒相比，总抗氧化能力和总酚类含量的总抗氧化能力和总酚类含量较高。这证实敬畏保留了葡萄酒的所有基本属性。这也揭示了总抗氧化能力和总酚类含量之间的显着阳性关系。

3.1.2.矿物质含量

在阿利伯内特红酒和AWE中检测到的最主要元素是钾（K）、锌（Zn）、镁（Mg）和钙（Ca）。与TAC和TPC一样，葡萄酒提取物中这些矿物质的含量高出10倍。结果如表所示2..

3.2。动物研究

3.2.1。动物特征

与正常血压的WKY相比，SHR的体重显著降低，血压显著升高。阿利伯内葡萄酒提取物治疗未能改变WKY和SHR的体重和血压。各组之间的心脏重量没有差异。结果如表所示3..

3.2.2。总NOS活性和eNOS蛋白表达

alibernet葡萄酒提取物在WKY大鼠组织中没有改变总NOS活性。然而，它能够在左心室增加显着的NOS活动（图1（a）），主动脉（图2（a））和肾（图3（a）)与未经治疗的对照组大鼠相比，SHR的内皮NOS蛋白表达在AWE治疗后WKY和SHR均未发生显著变化（图1（b）,2（b）， 和3（b））.

3.2.3。SOD活性和SOD1蛋白表达

alibernet酒提取物治疗未能影响SOD活性以及WKY大鼠组织中的SOD1蛋白表达。另一方面，AWE治疗显着增加了SHR的LV中的SOD活性（达54％;图4（a））.但对左心室SOD1蛋白表达无影响(图)4（b））.同样，AWE治疗未能影响SHR，肾脏和SHR的血浆中的SOD活性和SOD1蛋白表达（数据未显示）。

3.2.4。血浆的总抗氧化能力

与血浆SOD活性不变一致的是，AWE处理后WKY和SHR组的血浆总抗氧化能力没有变化(数据未显示)。

3.2.5。超氧化物水平的测量

尽管左心室和Arch的主动脉患者的超氧化物水平增加，但菌株之间没有显着的变化。同样，AWE治疗没有透露Wistar京都和自发性高血压大鼠的LV和主动脉的任何显着变化（表4.）.

4。讨论

新兴的证据表明，矿物质以及多酚化合物可以在内源性抗氧化系统以及一氧化氮合酶活性中发挥重要作用。

在这里，首次采用同时分析总酚含量、矿物质和抗氧化能力的方法，为实验动物模型中使用的红酒提取物提供综合评估。经确认，阿里伯纳葡萄酒提取物的多酚和矿物质含量是阿里伯纳红酒的10倍以上。这些结果使我们可以得出这样的结论:加工葡萄酒以获得提取物不会对目前研究感兴趣的矿物质和酚类物质的含量产生负面影响。此外，我们还证实了葡萄酒和葡萄酒提取物中总抗氧化能力与总酚和矿物质含量之间存在很强的正相关关系。这些结果与其他研究者发表的关于红酒的研究结果一致[34,35]．这些作者在经过实验验证了多酚含量与总抗氧化活性之间的相关性。除了分析多酚含量外，还研究了矿物质含量，在一定程度上可能影响红葡萄酒提取物中的总抗氧化能力，因为它在表中显示1..

食品中含有的矿物质在身体稳态中发挥着重要作用。越来越多的临床证据表明某些疾病的矿物质水平与进展之间的关系。最近的研究记录了所选矿物质以抵消心血管，代谢和其他疾病的发展的能力[36–40]．人类矿物的积极作用与其通过催化抗氧化酶提高抗氧化防御系统活性的能力有关。在食品中发现的几种矿物质，如铜，锌和锰，对超氧化物歧化酶的适当活性是必不可少的，这是一种关键的抗氧化酶[41.,42.].补充锌的实验研究表明，在给大鼠补充锌4个月后，过氧化氢酶、谷胱甘肽-s-转移酶和SOD活性增加[43.]．

由于葡萄酒提取物的化学分析结果显示出相对高浓度的矿物质，因此这可能有助于不同抗氧化酶和/或一氧化氮合酶的活性的变化。因此，在Alibernet葡萄酒萃取物处理后，在实验动物中一起分析SOD活性和SOD1蛋白表达，NOS蛋白表达。Western印迹分析未显示在调查组织中的敬畏后SOD1和eNOS蛋白表达的任何显着变化。另一方面，AWE治疗在自发性高血压大鼠的LV，主动脉和肾脏中的左心室和NOS活性增加了显着的SOD活性。

在人类和所有其他哺乳动物中存在三种形式的SOD:细胞质SOD、线粒体SOD和细胞外SOD [44.]．SOD1是一种铜锌依赖的亚型，在内皮细胞中高度上调[45.]．因此，分析了SOD1蛋白表达。由于AWE治疗不影响SOD1蛋白表达的水平，我们假设AWE中的Zn升高可能直接增加SOD活性。我们假设葡萄酒提取物处理后SOD2或SOD3蛋白表达没有增加。当然，参与提取物的多酚化合物也可能有助于增加SOD活性。这些结果与Fernández-pachón等人最近的研究一致。[17在红葡萄酒消耗七天后观察到人红细胞中的SOD活性增加。

锌是人体内最重要、最普遍的微量元素之一，具有显著的抗氧化活性。锌是一种重要的矿物质，可以防止自由基的形成，保护生物结构免受损害，增强免疫反应[42.,46.]．而且，周等人。[47.证实了锌在一氧化氮合酶正常功能中的关键作用。事实上，NOS仅作为由两个亚基组成的二聚体具有催化活性，其结合是通过Zn与硫醇配体在二聚体界面上的四面体配位稳定的。因此，我们也认为AWE处理后NOS活性的增加可能与锌有关。除锌外，AWE治疗还可提高钙水平，钙是内皮NOS激活的另一重要元素[48.]．Western Blot结果显示，AWE处理SHR后内皮NOS蛋白表达未见明显变化，证实了我们的建议。因此，AWE中的Zn、Ca和多酚类化合物最有可能直接提高NOS活性。我们假设在研究的组织中，神经元或诱导性NOS蛋白的表达没有增加。López-Sepúlveda等[49.]还没有看到红葡萄酒多酚处理后Aorta中的eNOS表达。然而，在红葡萄酒多酚给药后，使用不同型号的其他几篇文件增加了eNOS表达[15,25]．我们假设，不同的多酚消耗、不同的模型以及不同的处理时间可能是eNOS蛋白表达差异的原因。

我们的研究结果显示，在所有调查的样本中NOS活性增加，这与Auger等人最近发表的论文一致[13]和madeira等。[15在使用不同的红葡萄酒萃取物后，作者发现了NOS活性升高。最近对Khoo等人的研究。[50.]结合生化和血管活性标准对多酚化合物槲皮素的血管反应进行了研究，也证实了槲皮素浓度与内皮细胞NO生物利用度增加之间存在正相关关系。本研究证实了多酚化合物改善内皮细胞的能力通过刺激内皮一氧化氮合酶在一氧化氮生成中发挥作用。

只有自发性高血压大鼠体内NOS和SOD活性升高，存在上述有害作用。这意味着多酚和矿物质可能只影响病理机制，而在正常情况下没有作用。红酒多酚在l - name诱发的高血压中也有类似的作用[25]．然而，在我们的研究中，AWE治疗3周后SOD和NOS活性的升高并没有影响SHR的血压。

这方面的几篇论文的作者表明，在给SHR服用红酒多酚后，血压有所降低。然而，治疗的持续时间一般超过三周。López-Sepúlveda等[49.研究发现，红酒多酚(40 mg/kg灌胃)治疗5周后，SHR患者的高血压和血管功能障碍均有所缓解。Chan等人[51.还发现，在10周口服给予红葡萄酒多酚（100mg / kg /天）到SHR后，改善了内皮依赖性扩张。另一方面，Botden等人。[52.]在对人类的一项研究中，在红葡萄酒多酚摄入后的两种不同剂量后，在具有高正常血压或1级高血压的受试者中没有看到外周血或中枢血压。关于我们的研究，3周后敬畏治疗后的SOD和NOS活动增加未能影响SHR的血压。我们假设敬畏治疗的延长可能导致血压的降低。然而，这需要进一步调查。

总之，我们的研究证明，酚素葡萄酒提取物和锌尤其可能在自发性高血压大鼠组织中直接促进含有葡萄酒提取物和锌的酚类和矿物质。这一发现使我们能够建议水果和蔬菜的积极影响与内源性抗氧化酶的活性增加以及抗氧化作用的增强。这与血管舒张和血液流动改善一样，这种情况发生在一起。这在高血压的情况下尤其重要，其中升高的自由基和细胞因子产生，慢性炎症和抑制没有生产。

缩写

敬畏:	alibernet红葡萄酒提取物
nos：	一氧化氮合成酶
SOD:	超氧化物歧化酶
WKY：	Wistar Kyoto.
月:	自发性高血压大鼠
TAC：	总抗氧化能力
GAE:	没食子酸当量
TPC:	总酚含量
涡轮发动机分析检测：	Trolox当量抗氧化容量。

承认

本研究在由ERDF研发计划和APVV-0742-10基金资助的“ITMS 26240120006- cekomat II复合材料结构、工程和医学应用研究中心的建立”项目中进行阐述。

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