倾向的新生儿母亲分离内脏过敏的差别,通过对这些Small-Conductance Calcium-Activated钾离子通道亚型2 (SK2)在老鼠身上

文摘

背景。内脏过敏是一种常见的胃肠疾病如肠易激综合症(IBS),在早年生活的压力(ELS)可能有很高的发展倾向内脏过敏在成年后,与特定的底层机制仍然难以捉摸。这里,我们评估的潜在影响small-conductance calcium-activated钾离子通道亚型2 (SK2)在脊髓背角(DH)内脏过敏症的发病机制引起孕产妇分离小鼠(MS)。方法。新生儿的老鼠受到女士范式,建立隧道模型。在成年后,内脏痛阈和腹部撤军反射(心田)测量了一个充气的气球。高架+迷宫,开放的现场试验,蔗糖偏好测试,和强迫游泳测试是用来评估焦虑和抑郁样行为。SK2表达水平的脊髓DH测定免疫荧光和免疫印迹。SK2和膜的mRNA palmitoylated蛋白2 (MPP2)是由定量实时聚合酶链反应(存在)。应用电生理学评价神经元活动率和SK2 channel-mediated afterhyperpolarization电流( )。MPP2之间的交互和SK2被coimmunoprecipitation验证。结果。天真的老鼠相比,女士小鼠行为学的研究结果显示内脏痛阈降低,更明显的焦虑和抑郁样行为,和表达下调表达的膜SK2蛋白质和MPP2蛋白质。此外,电生理结果显示增加神经元活动率和降低在脊髓DH神经元。尽管如此,鞘内注射SK2通道的激活1-ethyl-2-benzimidazolinone (1-EBIO)老鼠女士可以反向电生理改变和提升内脏痛阈。天真的老鼠,管理SK2通道阻滞剂apamin减弱和自发的脊髓神经元活动率升高DH神经元,减少内脏痛阈。MPP2表达式的最后,破坏小干扰RNA (siRNA)可以增强内脏过敏在天真的老鼠。结论。ELS-induced内脏痛和内脏过敏相关的脊髓DH underfunction SK2通道。

1。介绍

肠易激综合征(IBS)是一种普遍的功能性胃肠道疾病主要特点是内脏过敏,其中慢性内脏痛是最常见的症状之一1]。流行病学研究表明,肠易激综合症患病率达到了全球大约11%,和94%的IBS患者伴有内脏过敏症。然而,对内脏过敏的具体机制,免疫的复杂病因等因素的变化和神经内分泌系统,心理和生理压力,和遗传和早期生活的影响仍然等待进一步的说明(2- - - - - -4]。

我们之前的报告证实,早期的应力(ELS)如结直肠扩张(CRD)和母亲分离(MS)可引起内脏过敏在成年大鼠(5- - - - - -7]。此外,临床和临床数据表明,长期痛觉过敏(ELS)是一个重要的诱发因素8]。动物研究表明,早期生活是个体的正常发展的关键时期,在此期间生理和心理压力会导致神经内分泌变化和施加影响的信号通路参与了神经可塑性的规定,neurobehaviors伴随着相应的改变,包括学习和记忆和焦虑和抑郁行为(9,10]。此外,船可以据报道夸大应激内脏过敏通过行动-肾上腺轴(HPA),自主神经系统(ANS),表观遗传修饰(11,12]。临床证据表明,船可以在神经系统,引起严重的后果中起关键作用的病理生理学各种疾病,如肠易激综合症,重度抑郁症(MDD),和创伤后应激障碍(PTSD),所有的这些会严重阻碍人类的行为和认知健康(13- - - - - -15]。然而,许多研究表明,船(物理或心理或两者)可以导致不同的长期行为和生理变化在成年后通过激活不同的神经网络(16- - - - - -18]。值得注意的是,独特的物理压力,产生早但相对温和的影响,心理压力呈现后但更严重的后果19]。鉴于早期心理生活压力的重要作用在影响个体身心健康障碍的成年,我们采用了女士的计划引起内脏过敏(20.]。

内脏感觉信号被传输到各种corticolimbic结构通过副交感神经传入和交感传入通路中(DH)脊髓背角起着至关重要的作用通过接收从背根神经节和内脏的信息传送的neuromatrix痛苦(21- - - - - -23]。此外,内脏痛觉神经元的兴奋过度的脊髓DH参与内脏过敏(24- - - - - -26]。因此,这些疼痛的的兴奋性神经元的调制已邀请有趣的内脏过敏的治疗方法。Small-conductance calcium-activated (SK)钾通道在树突棘据说能够控制通过调节神经细胞的兴奋性突触传递的27]。

SK渠道构成不同的钾离子通道亚科,与无电压敏感细胞内钙离子依赖性(28]。SK通道是神经兴奋性的调节器,参与的中介afterhyperpolarization电流( )和调节神经元活动率(29日,30.]。免疫组织化学结果验证,SK通道在整个大脑广泛表达(31日)、脊髓背根神经节和脊髓神经元DH [32]。对他们的生理和药理特性,SK渠道分为三个亚型:SK1, SK2和SK3频道(33],SK2渠道几乎完全位于脊髓DH的表面层(32]。SK渠道在脊髓DH参与痛觉调制,作为开胃了SK通道1-EBIO thermal-induced缓解的痛觉行为通过减少排放和增加振幅(34]。此外,SK通道的激活脊髓中还可以改善机械敏感大鼠炎性疼痛模型(35]。相反,intraplantar注入特定的SK通道抑制剂诱导机械触诱发痛和热痛觉过敏在天真的老鼠36]。此外,SK2渠道的定位在细胞表面膜可以动态地由顺行和逆行贩卖37]。最近,一种新的突触脚手架MPP2报道负责定位在突触SK2通道,它允许SK2渠道为长期势差(LTP)和突触可塑性强化(38]。

在目前的研究中,我们调查了SK2蛋白表达和SK2渠道活动的变化与免疫印迹和电生理记录小鼠出现MS-induced内脏过敏症。之间的交互MPP2 coimmunoprecipitation SK2决心。

2。方法和材料

2.1。动物

C57BL / 6 j小鼠的实验动物中心提供的是徐州医科大学(徐州,中国),与一只公老鼠同居两个雌性老鼠促进繁殖,在控制的温度和湿度(22°C和50%)和随意获得食物和水。模型小鼠暴露于孕产妇分离协议,只有男性被用于实验。所有程序都按照美国国立卫生研究院进行指导的护理和使用实验动物(2011)和机构批准的动物保健和使用委员会徐州医科大学。

2.2。孕产妇分离协议

孕产妇分离的幼崽水坝是持续6小时每日(8:00-11:00点和下午2:00-5:00),从产后第二天(P1) 15天(好),相同的小狗窝孤立在一个笼子里( 厘米)保持在 °C (P1-P5)或 °C (P6-P14)。最后分离3 h,小狗会被送回自己的笼子里(图1(一)),而控制小鼠饲养标准设施(39,40]。

2.3。试剂

试剂如下:兔子anti-SK2 / K_Ca2.2多克隆抗体(apc - 028、Alomone实验室、以色列),Alexa萤石594驴anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (A21207热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国),鼠标anti-GAPDH马伯(AC001 ABclonal,沃尔瑟姆,妈,美国),鼠标反β肌动蛋白马伯(sc - 47778,圣克鲁斯生物技术,美国),HRP-labeled山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (Beyotime A0208,中国),HRP-labeled山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L) (A0216 Beyotime),碱性磷酸酶山羊anti-rabbit免疫球蛋白(zb - 2308, Beyotime), BCA蛋白质分析工具包(P0012 Beyotime)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -)(页面)示例加载缓冲区(P0015 Beyotime) BCIP /电视台碱性磷酸酶颜色开发工具包(C3206 Beyotime) BeyoECL月球工具包(P0018FFT Beyotime)和Syn-PER™突触蛋白提取试剂(# 87793,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。

2.4。评估腹部撤军反射(心田)和内脏痛阈

内脏敏感性评估心田和内脏痛阈7,41]。老鼠流离失所的透明塑料盒( )在高架有机玻璃平台,允许习惯15 - 20分钟。我们进行了分级快速通胀膨胀的气球( )结直肠内地区膨胀压力(20、40、60或80毫米汞柱),20多岁的间隔时间2 - 3分钟(图1 (c))。的心田是得分如下:0,缺乏行为反应;1、短暂的头部动作其次是静止的;2,腹部肌肉的收缩;3、高程的腹部;4、身体灭弧和海拔骨盆结构。定义的是内脏痛阈刺激强度,唤起一个可见腹壁的收缩。准确性,膨胀进行了一式三份来计算平均。在行为测试的过程中,技术人员对动物分组也不清楚。技师执行通货膨胀以稳定的速度,通过注射器与另一个技术人员观察腹部运动的变化,记录在血压计读数。

2.5。开放的现场试验

开放的现场试验进行评估焦虑性行为。组成的装置是一个方形外壳,黑色木地板( )四周墙壁(50厘米高)。鼠标在拐角处位移的测试开始免费开放的领域,允许勘探5分钟内,与线交叉的时候,时间在中心区域( ),和时间记录的进入中央地带ANY-maze视频跟踪软件。在每个老鼠实验,整个地区和70%的酒精清洗去除气味。

2.6。高+迷宫

高+迷宫也用来检测焦虑行为。装置由两种对立的封闭的胳膊,张开双臂( )与墙(10厘米高)相同的维度和竞技场( )十字路口的张开双臂和关闭武器。在5分钟的测试,鼠标是首先放在舞台上,面对紧闭的手臂。观察指标包括:所花费的时间在张开双臂和进入的数量。进入张开双臂被定义为所有四个爪子张开双臂区域内,与一个ANY-maze视频相机控制跟踪系统和数据记录,用同样的清洗过程的四个胳膊在所述。

2.7。蔗糖偏好测验

在测试之前,老鼠提供两瓶自来水第一天,紧随其后的是替代1%的蔗糖溶液为第二天。第三天,老鼠被剥夺了的水。第四天,老鼠提供两瓶满1%蔗糖溶液和自来水。最后,蔗糖偏好的消费卷计算蔗糖溶液超过总量的液体摄入。

2.8。强迫游泳测试

每个鼠标轻轻综合在水在25°C和30厘米深度(底部)的塑料缸1分钟适应与静止时间5分钟内记录。静止的定义是维护一个在一个地方不动的姿势,或最低爪运动必须保持它的鼻子和眼睛,和长时间不动时间视为“行为绝望。”

2.9。鞘内导管植入

小鼠麻醉下2%戊巴比妥钠(40毫克/公斤,i.p。),纵向背侧切口(约1厘米)是通过皮肤和肌肉,L5-L6椎骨完全暴露。PE导管( 毫米插入ID)含0.9%无菌生理盐水L5和社会之间的关系。无菌生理盐水(1μL)轻轻注入蛛网膜下腔,确保导管通畅。密封的外端导管,导管固定到邻近的组织。具有抗菌治疗,老鼠被允许5天恢复。1-EBIO (30μ0.5 g), apamin (ng)和小干扰RNA (siRNA)针对MPP2 (5μ卷5 g)管理μL通过微量调节注射器输液泵(美国KDS科学)装有10μL毫升汉密尔顿微量调节注射器。

2.10。电生理学

为在体外录音,45分钟后过去行为测试,老鼠接受transcardial深麻醉下灌注;低的横向部分腰椎和骶段上部(L4-S4)切片厚度的300μ徕卡m vibratome (VT1200S,德国)在一个冰冷的高蔗糖切削液(mM)由80氯化钠,4.5 MgSO₄0.5,3.5氯化钾,CaCl₂1.25不₂阿宝₄90蔗糖,25 NaHCO₃,10葡萄糖;人工脑脊髓液(ACSF)(毫米):126氯化钠,1.2不₂阿宝₄1.2,2.5氯化钾,MgSO₄26 NaHCO₃2.4、10葡萄糖和CaCl₂。所有的解决方案都是饱和O为95%₂和5%的公司₂。片被转移到ACSF在室温下(r / t) 1 h在孵化后高蔗糖切削液在34°C 15 - 20分钟。在DH膜片箝记录进行薄层i ii神经元与标准wall-borosilicate玻璃吸管(bf - 150 - 86 - 10、萨特、美国)满一个内部解决方案(mM)组成的10 phosphocreatine-Tris, 10玫瑰,2 ATP-Mg 10 EGTA 0.5 GTP-Na, 115 K葡萄糖酸,MgCl 20氯化钾,1.5₂;pH值调整到7.25与KOH (280 - 290 mOsm)。吸管抵抗被设定为5 - 10米Ω。全细胞记录,DH神经元被维护在一个电压钳位持有-60 mV和100 ms的潜力去极化脉冲60 mV,它可以唤起一个外电流测量SK电流。Cell-attached录音进行的电压钳位电流设定为0 b pA MultiClamp 700放大器(轴突仪器,结合城市、钙、美国)。数据获取和分析与Clampex Clampfit 10(轴突仪器,圣何塞、钙、美国)。

2.11。西方墨点法

45分钟后过去行为测试,老鼠牺牲,与脊髓下腰椎和骶段上部(L4-S4)孤立在冰和放置在一个埃普多夫(EP)管然后存储在冰冷的环境中。突触蛋白的溶解产物Syn-PER™提取试剂(1毫升/ 100毫克)和磷酸酶抑制剂phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)先后补充说,其次是均化和在8000转离心10分钟在4°C, 80μL上层清液(全细胞裂解)取样。然后,上层清液离心20分钟,每分钟12000转的裂解缓冲(20μL)添加到粒子(膜部分)。BCA法来检测和修剪裂解后的蛋白质浓度。等量的蛋白质分离通过sds - page凝胶和转移到PVDF膜。封锁后5%脱脂奶为2 h r / t,孵化了PVDF膜anti-SK2(1: 200)和anti-GAPDH(1: 1000)主要抗体在一夜之间在4°C。在Tris-buffered盐水灌洗后用渐变(TBST), PVDF膜与HRP-conjugated孵化二级抗体(1:1000)为2 h r / t。免疫印迹分析与ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。

2.12。免疫荧光

老鼠transcardially灌注0.9%生理盐水(10 mL / g),其次是4%的聚甲醛磷酸盐缓冲剂(10 mL / g)后深麻醉。脊髓(L4-S4)被孤立和固定在4% 30%蔗糖溶液中聚甲醛24 h和平衡前30片制备的厚度μ米和一个低温恒温器(CM1800、徕卡、德国)。选片与PBS三次冲洗10分钟和屏蔽10%驴在r / t 2 h血清孵化与anti-SK2(1: 150)在4°C 24 h。随后,三次片被灌洗和孵化Alexa萤石594(1:200)在r / t 2 h。图片是使用激光共焦显微镜获得(FV1000、奥林巴斯、日本)。

2.13。定量实时聚合酶链反应(存在)

45分钟后过去行为测试,在戊巴比妥钠小鼠牺牲。冰脊髓很快被删除,脊髓较低的腰椎和骶段上部(L4-S4)与旋转列动物解剖和总RNA提取总RNA净化设备按标准协议(Shenggong,中国)。RNA的准备工作是反向转录产生cDNA FastKing RT工具包(TIANGEN,中国)。互补产品作为模板进行实时PCR分析观察SK2-specific SK2表达引物(Shenggong,中国)。引物应用于放大SK2 5 - - - - - -CTGCTTGCTTACTGGAATCATG-3(向前)和5 - - - - - -CATCATGAAATTGTGCACATGC-3(反向)。感觉和反义引物是位于不同的外显子,避免假阳性结果由于基因组DNA污染。通过荧光pcr进行LightCycler 480系统SYBR绿色科技(美国应用生物系统公司)。反应协议在以下模式:1分钟95°C的酶激活紧随其后40周期10在95°C和30年代60°C和30年代在72°C,紧随其后的是95°C的5 s为60年代和60°C。融化曲线分析检查特异性扩增的产品。所有反应包含相同数量的互补脱氧核糖核酸。的相对表达比SK2 mRNA GAPDH基因表达使用规范化ΔCt方法(2^{- - - - - -ΔΔCt})。

2.14。Coimmunoprecipitation

溶菌产物是在13000转离心20分钟在4°C。上层清液是孵化的表示anti-SK2 30分钟,然后,20μL蛋白质A / G琼脂糖珠(美国热科学)添加孵化一夜之间在4°C旋转。一式三份的珠子是冲洗免疫沉淀反应溶解产物。蛋白质被筛选了20μL 2 x SDS样品缓冲在37°C。绑定和筛选了蛋白质随后通过sds - page和转移到PVDF膜分离。与5%的脱脂牛奶2 h封锁后,膜与anti-MPP2探测一夜之间在4°C。HRP-conjugated二级抗体申请45分钟。与ImageJ污点分析软件(美国国家卫生研究院)。

2.15。统计分析

数据表示为 。独立样本,学生的 - - - - - -测试和双向方差分析(方差分析)测试Bonferroni的紧随其后事后测试或S-N-K多个比较了。所有与SPSS统计分析进行了19.0(美国IBM)软件。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。ELS)诱导小鼠内脏过敏发生新生儿女士

女士的规范化模型作为临床前模型船。鼠崽分开他们的大坝6 h每日的产后第二天(P1) 15天(好)。在第八周(成年),心田和内脏痛阈测定(数字1(一)和1 (c))。有一个微不足道的差异在体重控制和小鼠断奶后5周内(女士 , ,图1 (b)),这表明老鼠没有遭受营养不良由于新生儿改变了内脏痛阈女士和女士的心田得分。老鼠经历新生儿女士提出了控制小鼠痛阈较低而( , ,图1 (d))。一致,老鼠女士提出了增强的心田分数来控制老鼠相比。我们进一步分析了统计每个膨胀压力差和女士发现,新生儿心田的分数在40毫米汞柱压力刺激增加( ),60毫米汞柱( ),和80毫米汞柱( ),分别为( ,图1 (e))。

3.2。小鼠与新生儿女士提出了焦虑和抑郁样行为

高架迷宫和开放现场测试服务调查女士对焦虑行为的影响。证明了代表痕迹在高架+迷宫图2(一个)女士,而控制老鼠,老鼠明显不活跃的张开双臂迷宫就是明证下降时间( , ,图2 (b))和时间的总入口开放武器( , ,图2 (c))。相同的总距离控制和老鼠女士之间的旅行经过身份验证的完整无缺,运动能力( , ,图2 (d))。小鼠与新生儿女士表现出显著减少持续时间在中央区域( , ,数据2 (e)和2 (f)),距离中央覆盖区( , ,数据2 (e)和2 (g))与对照组相比,无显著差异的总距离控制和老鼠女士之间的旅行 , ,数据2 (e)和2 (h))。升高的结果加上迷宫和开放的现场试验表明老鼠女士减毒探索尝试,仍接近墙壁而控制老鼠。来验证是否女士的老鼠表现出类似抑郁行为,奖励为蔗糖偏好测试和强迫游泳测试。女士的老鼠相比,控制小鼠明显表现出对蔗糖( , ,数据2(我)和2 (j)),的老鼠女士类似抑郁的症状。此外,我们测量了老鼠的毅力来识别一个抑郁表型,通过强迫游泳测试。结果显示,小鼠表现出女士增加静止时间的百分比的总时间与控制老鼠( , ,数据2 (k)和2(左))。因此,这些数据表明,老鼠经历新生儿女士提出了焦虑和抑郁样行为。

3.3。SK2蛋白膜的减少分数,SK2 mRNA,在小鼠脊髓DH经历新生儿女士

西方墨点法数据显示,脊髓SK2蛋白质在膜分数呈现明显降低小鼠相比控制老鼠(女士 , ,图3(一个))。然而,在整个脊柱SK2没有区别两组之间的蛋白质( , ,图3 (b))。一致,同样的也是真正的总脊髓SK2 mRNA ( , ,图3 (c))。SK2表明SK2通道的表达被广泛表达在脊髓背角控制老鼠或小鼠新生儿女士,和没有差别的数量SK2 +脊髓背角神经元之间的两组( , ,数据3 (d)和3 (e))。小鼠与新生儿女士提出了低相对于没有新生儿的小鼠的平均峰值振幅女士是 爸和 分别pA在控制和老鼠女士( 神经元/ 5老鼠, ,数据3 (g)和3 (h))。一致,老鼠与新生儿女士提出了自发的神经元活动的增加率和控制老鼠( vs。 , 神经元/ 5老鼠, ,数据3(我)和3 (j))。上述结果表明,老鼠女士SK2频道的功能降低是由于船的经验,导致脊髓神经元活动增加DH,最终内脏过敏。

3.4。SK2通道阻滞剂Apamin的影响 ,自发的神经元活动率和内脏痛阈

加入一定量SK2通道阻滞剂apamin ACSF达到所需的浓度下降(100海里)在老鼠身上没有新生儿女士与对照组( vs。 , 神经元/ 5老鼠, ,数据4(一)和4 (b)),增加了神经元发射率( vs。 , 神经元/ 5老鼠, ,数据4 (c)和4 (d))。西方墨点法数据显示,脊髓SK2蛋白质膜分数呈现显著降低小鼠接收apamin ( , ,图4 (e))。的心田,内脏痛阈测定2 h后鞘内apamin管理局(0.5 ng / 5μL),结果表明,apamin管理导致了内脏痛阈下降( , ,图4 (f))。随后apamin政府,天真的老鼠送给心田;分数增加60毫米汞柱压力刺激与ACSF对照组( , ,图4 (g))。

3.5。SK2通道阻滞剂Apamin对焦虑的影响,类似抑郁的症状

行为测试测量2 h后鞘内apamin管理局(0.5 ng / 5μL),结果表明,apamin政府并不影响小鼠的焦虑行为。时间花在开放武器( , ,数据5(一个)和5 (b)),进入开放臂的时间( , ,数据5(一个)和5 (c)),舞台上的持续时间( , ,数据5 (e)和5 (f)),课程的领域( , ,数据5 (e)和5 (g))显示微不足道的差异控制老鼠和老鼠apamin注入。同样,apamin政府并不影响类似抑郁的行为就是明证相同的偏爱蔗糖( , ,数据5(我)和5 (j))和静止时间( , ,数据5 (k)和5(左)两组之间的)。

3.6。影响SK2通道激活1-EBIO在小鼠内脏过敏由于新生儿女士

SK2通道激活剂加入一定量1-EBIO ACSF达到所需的浓度(100μ米)。1-EBIO升高( vs。 , 神经元/ 5老鼠, ,数据6(一)和6 (b)),减少神经元发射率( vs。 , 神经元/ 5老鼠, ,数据6 (c)和6 (d)脊髓神经元DH)。西方墨点法数据显示,脊髓SK2蛋白质膜分数呈现显著增加小鼠接受1-EBIO ( , ,图6 (e))。老鼠接受了鞘内1-EBIO管理局(30μg / 5μL) 2 h前行为测试。1-EBIO政府逆转小鼠内脏痛阈下降经历新生儿女士( , ;图6 (f))。一致,后续1-EBIO政府,老鼠女士提出了减少心田;分数和二甲亚砜(DMSO)对照组。女士的增量扩张压力的刺激,小鼠表现出减少的心田分数在40毫米汞柱( )和60毫米汞柱( )后1-EBIO管理局( ,图6 (g))。

3.7。SK2通道激活1-EBIO对焦虑的影响,类似抑郁的症状

老鼠接受了鞘内1-EBIO管理局(30μg / 5μL) 2 h前行为测试。类似于apamin注入,1-EBIO政府并不影响小鼠的焦虑行为。时间花在开放武器( , ,数据7(一)和7 (b)),进入开放臂的时间( , ,数据7(一)和7 (c)),中部地区的持续时间( , ,数据7 (e)和7 (f)在中心区域),课程( , ,数据7 (e)和7 (g))显示微不足道的差异控制老鼠和老鼠1-EBIO注入。同样,1-EBIO政府并不影响类似抑郁的行为就是明证相同的偏爱蔗糖( , ,数据7(我)和7 (j))和静止时间( , ,数据7 (k)和7(左)两组之间的)。

3.8。膜SK2差别的贡献表达下调MPP2到对这些蛋白质

在差别进一步探索SK2机制对这些老鼠女士,我们专注于MPP2,这是一个突触脚手架蛋白位于突触后密度(PSD),和SK2行为锚定在通过MPP2突触膜。如图8(一个)coimmunoprecipitation,我们认为与MPP2 SK2互动。免疫印迹的数据显示明显降低小鼠的脊髓MPP2蛋白膜分数经历新生儿女士( , ,图8 (b))。此外,存在,免疫印迹数据和行为测试进一步证实了我们的猜测,导致减少膜SK2差别MPP2对这些蛋白质。天真的老鼠注射siRNA MPP2或者消极的控制(数控)的核,和前面提到的测试进行了30 h。存在数据显示,脊髓MPP2-related mRNA呈现明显降低核后针对MPP2管理局( , ,图8 (c))。膜的,同样也是MPP2 ( , ,图8 (d))和SK2蛋白膜分数( , ,图8 (e))。内脏痛阈的天真的老鼠注射后明显降低了核针对MPP2 ( , ,图8 (f))。一致,注射后的siRNA针对MPP2天真的老鼠,心田;分数显著增加了压力刺激40毫米汞柱( , ,图8 (g))。综上所述,这些研究结果的差别表明,对这些MPP2可以解释表达下调膜SK2蛋白质在老鼠身上经历新生儿女士。

4所示。讨论

SK渠道在脊髓DH在痛觉调制中起到至关重要的作用34- - - - - -36]。在这项研究中,我们调查的角色SK2渠道在脊髓DH内脏过敏引起母亲的分离。目前研究结果提供的证据表明,老鼠经历新生儿容易内脏刺激在成年女士,连同脊髓膜SK2差别明显对这些蛋白质和SK2-mediated频道 ,和脊髓神经元活动增加利率DH。应用SK2通道阻滞剂apamin可能会加剧由减少内脏过敏和增加神经元活动率天真的老鼠。鞘内注射SK2通道激活1-EBIO缓解内脏过敏和逆转的改变老鼠经历MPP2女士和神经元活动率可能与SK2交互,膜的差别伴随着对这些MPP2蛋白表达小鼠暴露于女士此外,中断的MPP2 siRNA加重内脏疼痛天真的老鼠。这些发现符合之前的证据表明脊髓DH SK2渠道参与内脏过敏引起的船(42]。

早期的不良经历会影响神经回路的形成和神经功能产生长期的影响,这被视为一个潜在的危险因素增加的生理和心理发病率在成年期(43]。越来越多的证据认证,船会导致相应的学习和记忆以及异常焦虑,抑郁样行为(9,10]。这些报告是支持我们的发现老鼠暴露在女士表现出焦虑和抑郁样行为。焦虑行为测试在我们的研究包括开放的现场试验和高架迷宫测试与蔗糖偏好测试和强迫游泳试验来验证类似抑郁的症状。此外,压力模式可以分为两大类:物理(实际上扰乱生理状态)和心理(威胁当前或预期的状态)(18,19]。生理和心理生命早期压力可以导致不同的长期行为和自然改变的激活不同的神经网络(16- - - - - -18),导致神经内分泌的变化和信号通路参与调节神经可塑性。此外,行为异常包括躯体和内脏痛觉过敏(11,12,44,45]。我们的研究结果与这些研究老鼠经历女士发达内脏过敏。

也承认,内脏信息来自远端结肠和直肠可聚合的胸腰椎和骶段脊髓,而胸腰椎脊髓神经元的数量也可以接收输入的传入纤维表面的皮肤和深体域(46]。因此,脊髓是高度受调制的躯体和内脏感觉传入纤维。脊髓DH神经元的结构和功能异常参与炎性疼痛、神经性疼痛,和其他疼痛障碍(47,48]。此外,据报道内脏痛觉神经脊髓DH展览兴奋过度在动物主题与内脏过敏(24- - - - - -26),邀请机制的进一步探索脊髓DH参与内脏过敏。

在这项研究中,我们采用了孕产妇分离建立内脏过敏的动物模型。分离的幼崽大坝进行每日6 h产后第二天to15,以优异的成绩从女士的研究模型建立了分离小狗每天从大坝3 h。根据他们的发现,分离3 h每日可以开发躯体和内脏痛觉过敏(49- - - - - -52]。然而,我们认识到,每天接触3 h女士不能在成年期开发内脏过敏,而分离6 h每日可以成功诱导内脏过敏,这是与上述相反的结果(51,52和与我们先前的报道一致53]。我们认为这种差异在时间的分离和动物物种的区别。

我们的数据显示,小鼠暴露于母亲的分离提供了一个重要的差别表达对这些脊髓膜蛋白质和SK2-mediated SK2频道 。突触SK2-containing通道可以调节突触可塑性的感应和兴奋性突触后反应,由于synaptically诱发Ca的激活^{2 +}涌入(38]。膜的差别我们的研究表明,对这些SK2通道蛋白表达导致海拔神经元兴奋性验证的脊髓神经元活动率DH的增加。SK渠道协调的媒介电导神经元在中枢神经系统,参与神经元活动的规定,LTP的统治,以及调制的记忆活动(54]。此外,SK2通道功能的增强在脊髓可以减弱热应激通过减少排放飙升和增加疼痛的行为振幅(34]。相比之下,鞘内注射的SK通道抑制剂apamin SK2-mediateddownregulation内脏痛阈下降在老鼠经历结直肠扩张(42]。

符合之前的报道,我们的数据证实,SK2通道激活1-EBIO可以防止内脏过敏的发展和逆转的变化老鼠和神经元活动率受到女士;SK2通道阻滞剂apamin诱导减少内脏痛觉过敏和增加神经元活动率天真的老鼠。此外,免疫印迹结果表明,鞘内注射1-EBIO apamin可能导致增加或减少脊柱DH SK2膜通道蛋白表达,这进一步支持了这种观点,即膜SK2通道的功能是与神经元兴奋性密切相关,对内脏过敏,施加影响。类似于SK2渠道,高水平的脊髓DH SK3通道进行标识,特别是在薄层I和II (31日]。然而,我们之前研究脊髓SK3通道的DH否决了SK3通道参与内脏过敏(42]。在这地面,我们排除了SK3通道作为我们的研究目标。

此外,由于可以诱发焦虑——女士和类似抑郁行为,这将是利益是否调制脊髓膜SK2表达式的DH可能导致这些行为表型的改变。矛盾的是,我们的研究结果表明,脊髓DH SK2频道没有参与焦虑的调制,类似抑郁的症状。然而,据报道,SK2通道基底超表达在神经元amygdala-projecting防止应激焦虑行为(55]。此外,船可以诱发焦虑和抑郁样行为通过神经内分泌系统失调包括HPA轴和血清素激活的系统,随着脑源性神经营养因子表达的变化(56- - - - - -59]。Overactivation免疫系统的异常也会导致焦虑和抑郁样行为(60]。我们认为这种差异指定调制行为的区别的目标,邀请我们未来的探索。

鉴于没有显著差异SK2 mRNA的表达和总SK2通道蛋白在小鼠脊髓DH经历与对照组女士和显著差异的存在在细胞膜SK2通道蛋白表达在MS模型小鼠,我们进一步探讨了突触的本地化的分子机制在脊髓DH SK2通道。MPP2是一种新型的突触脚手架,局部在海马神经元突触后网站通过绑定到丰富的突触后支架蛋白质如psd - 95和鸟苷kinase-associated蛋白质(GKAP) [61年]。此外,MPP2最近演示了负责适当的突触本地化和SK2-containing渠道在海马CA1锥体神经元的功能38]。在我们的研究中,coimmunoprecipitation发现肯定MPP2可能与SK2脊髓DH,随着膜MPP2蛋白表达减少。此外,中断MPP2表达式的鞘内注射siRNA内脏过敏加重在MS模型小鼠,这进一步支持MPP2参与内脏过敏的作用。然而,有报道称突触膜相关鸟苷激酶(MAGUK)蛋白质可以影响受体n -甲基- d - (NMDAR)介导的突触功能和相关的持久性疼痛通过调节表面和突触NMDAR贩卖在脊髓水平(62年- - - - - -64年]。因此,MPP2之间的交互和脊髓SK2 DH调制的内脏过敏等待进一步的探索。

5。结论

总之,我们探索SK2渠道在脊髓DH的贡献在小鼠内脏过敏。我们的研究表明,新生儿的差别会导致内脏过敏通过对这些女士SK2频道。药理激活SK2渠道可以防止内脏过敏的沉淀,和封锁SK2频道会加重内脏过敏。MPP2可能构成差别此外,对这些基因的减少膜SK2频道。这项研究可能会推出一个潜在的IBS发病机制和可能提供一个小说的发展大道治疗IBS的代理人和内脏过敏与效率和有效性。

数据可用性

原始数据生成使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院),Clampex Clampfit 10(轴突仪器,圣何塞、钙、美国),等。导出数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

所有作者声明没有金融竞争的利益。

作者的贡献

吴客、京华高和荣花了同样的工作。

确认

本研究支持由中国国家自然科学基金(81771203和81771203号),关键的江苏省高校自然科学基金(19 kja110001),江苏省研究生创新研究与实践项目(没有。KYCX20_2476)和由清局域网项目。

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