复合杂合突变TMC1.和MYO15A两个汉族家庭的常染色体隐性非综合征性听力损失是否与之相关

摘要

遗传性听力损失是一种常见的感觉障碍，其原因具有高度异质性。在本研究中，通过对414个已知耳聋基因的靶向下一代测序，我们发现了复合杂合突变p.R34X/p。M413T在TMC1.和p.S3417DEL / P.R1407TMYO15A在中国汉族两个隐性聋人家庭中。通过Sanger测序证实了两个家系中与听力表型的突变的家系内共分离。受影响的个人的听觉特征与之前报道的隐性突变一致TMC1.和MYO15A．本研究中发现的两种新突变，p.m413tTMC1.和p.R1407TMYO15A根据ACMG的指导，分类为致病性。我们的研究扩展了突变谱TMC1.和MYO15A并说明基因型 - 表型与下一代测序组合的相关性可以提高耳聋遗传诊断的准确性。

1.介绍

先天性听力障碍是全球共同的出生缺陷，每1000名婴儿大约1-2。随着年龄的增加，患病率持续到每1000岁以前的2.7％，每1000以每1000到3.5 / 1000穿过青春期[1]．迄今为止，据报道，据报道了超过100个基因与非肌瘤性听力损失（NSHL）相关，包括76个常染色体隐性非合成瘤性听力损失（ARNSHL）基因，48个常染色体显性不健康的非合成瘤性听力丧失（ADNSHL）基因，以及5个X连接的非合奏组织听力损失基因（遗传性听力损失主页;https://heredaryhearingloss.org/(于2020年1月更新)。耳蜗内的毛细胞主要作用是将声波机械波转换成神经电信号[2-4.]这使得这对听力能力非常关键。许多先前的研究表明，由于遗传因素，耳毒性药物，噪声，炎症或老化，HCS可能被损坏，其中遗传占HC故障的50％的遗传占[5.-11]．

这TMC1.该基因位于染色体9q21上，包含24个外显子，编码760个氨基酸膜蛋白TMC1和6个跨膜结构域[12那13]．TMC1是机械转导复合物的一个形成孔的亚基，预计具有胞内N和C端跨膜结构域和一个保守的TMC结构域[14]．TMC1在小鼠内耳中表达，并提出涉及耳蜗HCS的功能成熟和存活[12]．据报道，突变TMC1.可能导致舌前深度常染色体隐性耳聋DFNB7/11和舌后进行性常染色体显性耳聋DFNA36 [13]．迄今为止，超过60个突变TMC1.在全球范围内报道[15]，隐性突变主要与语言前严重到严重的听力损失相关[15那16]．

HC的静纤毛对维持HC的功能至关重要[17那18]．这MYO15A基因位于17p11.2染色体，含有66个编码外显子，它们编码一个非传统的肌蛋白肌肌瘤XVA [19]．Myosin XVA是一种基于肌动蛋白的大型运动蛋白。在耳蜗毛细胞中，它对立体纤毛的伸长和分化至关重要[20.]．肌凝蛋白XVA在耳蜗毛细胞力学转导中起重要作用。Myosin XVA通过其羧基端PDZ配体与whirlin的第三个PDZ结构域相互作用，然后将whirlin传递到立体纤毛的顶端[21]．MYO15A突变导致人类先天性耳聋DFNB3和shaker 2小鼠耳蜗前庭功能障碍，显示异常短的立体纤毛束和楼梯减少[20.那21]．这是中东国家普遍的近亲婚姻导致ADNSHL最常见的原因之一[22那23]，其中大多数与语言前严重到严重的听力损失和外显子2突变导致较温和的听觉表型相关[23]．

在本研究中，我们提出了两个中国汉族患ARNSHL家系的临床特征和遗传分析。通过对414个已知耳聋基因的靶向下一代测序，我们发现了耳聋的复合杂合突变TMC1.和MYO15A作为那些家庭听力丧失的遗传原因。

2。材料和方法

2．1．受试者及临床评估

本研究包括两个核中国汉族隐性聋人家庭：家庭1（图1（a））和家庭2（图1（b））.所有受影响的家庭成员都在耳鼻喉科和颈部外科，上海焦通大学医学院上海市九人民医院，中国上海市上海市街道头部手术部进行临床评价。评估包括完整的医学历史访谈和全面的体检，包括耳镜检查，以排除由于感染，创伤或其他环境工厂引起的听力损失。通过鼓室测量评估中耳功能，通过抗变形产量耳声发射（DPOAE）评估耳蜗外毛细胞的功能。纯音听力测定（PTA）计算为500,1,000,2,000和4,000 Hz的患者的听力阈值的平均值。听力损失程度定义为温和（26-40dB HL），中度（41-55 dB HL），适度严重（56-70 dB HL），严重（71-90 dB HL）和深度（> 90 dB HL). Hearing thresholds reported in this study were averaged air-conducted pure-tone thresholds of each side. Tandem gait and the Romberg testing were performed for vestibular function examination. Computerized tomography (CT) scan of the temporal bone was carried out to assess the development of the anatomical structures of the middle and inner ear for the available subjects. This study was approved by the ethnic committee of Shanghai Ninth People’s Hospital. Written informed consents were obtained from each participant or from parents of the young subject.

2.2。突变鉴定

根据标准方案（QIAPAM DNA血液迷你试剂盒，Qiagen，Shanghai），使用血液DNA试剂盒从所有受试者中提取外周血的基因组DNA。如前所述进行靶向的下一代测序[24那25]．外显子，剪接部位和414个已知耳聋相关基因的侧翼内部内部区域（表S1）被定制的捕获试验（Mygenostics，北京，中国）捕获。候选致病性突变被定义为非ynonymous（包括废话，致命，剪接 - 站点和诱导）在1000个基因组数据库，DBSNP数据库，Exome聚合联盟数据库（EXAC）中具有0.01以下的等位基因频率和200中国汉族正常听力控制个人。候选突变的潜在致病作用在硅工具突变蛋白质，SIFT和POLYPHEN中评估。通过PCR扩增和Sanger测序在所有家庭成员中证实了疾病表型的COSEGROATIONG和致病性突变。突变的致病性遵循ACMG 2015的指导原则[26]．

结果

3．1．临床特征

3.1.1。家庭1

家庭1有两个受影响的兄弟姐妹出生于两个正常听证父母（图1（a））.概念II-1是一个26岁的女性，先天性感官听力损失。鼓室图表明了中耳的正常功能。双侧DPOAE不存在。II-1和她的弟弟II-2都遭受了双边，深刻的听力障碍，PTA阈值高于90 dB HL（图2（a））.串联步态和romberg测试显示没有前庭功能障碍的症状。颞骨CT扫描显示没有明显的异常。没有发现明显的额外综合征特征。

3.1.2。家庭2.

家族2的先证者II-1(图1（b））是一个10岁的女孩，他遭受了双边听证障碍。听觉检查和PTA表明感觉内听力损失严重（图2（b））.鼓室造影显示a型曲线，提示中耳功能正常。双侧DPOAE缺失，前庭功能未见异常。病史及体格检查未发现其他异常。

3.2。突变分析

对先证者Family1-II-1和Family2-II-1进行了414个已知耳聋基因的靶向下一代测序。共鉴定出9个和13个候选变异(表S2）.在家族1中，复合杂合突变C . 100c >T (p.R34X)和C . 1238t >C (p.M413T)TMC1.（NM_138691）被确定为与隐性继承一致的唯一候选突变。Sanger测序显示，随着未受影响的父母，在家庭1中与听力表型的突变是单一突变的杂合子载体p.r34x（母亲I-1）和p.m413t（父亲I-2），而受影响的影响兄弟姐妹都具有复合的杂合酶突变（图3（a））.在200中文汉族正常听力控制中未检测到这两个突变，并且不存在于1000个基因组和EXAC数据库中。以前在巴基斯坦，伊朗，土耳其和突尼斯的许多患者中检测到exac的次要等位基因频率（MAF）的p.R34x突变，但在中国的许多患者中，但在中国相对罕见[16那27-29]．另一方面，虽然p.M413T突变是新的。根据ACMG指南，p.R34X和p.M413T突变TMC1.分别被分类为致病（PVS1 + PS1 + PM2 + BS2）和可能的致病（PM2 + PM3 + PP3）。

在第2家系中，C . 10245_10247delctc (p.S3417del)和C . 4220g >C (p.R1407T)为复合杂合子MYO15A(NM_016239)被认为是唯一符合隐性遗传的候选致病变异。Sanger测序证实，突变与家族2的听力表型共分离，因为未受影响的亲本是单突变p.R1407T(母亲I-1)和p.S3417del(父亲I-2)的杂合携带者(图)4（a））.在200中文汉族正常听力控制中未检测到这两个突变，并且不存在于1000个基因组和EXAC数据库中。先前，exac中的MAF为0.000016的P.S3417DEL突变，以引起日语和韩国患者的常染色体隐性听力损失，但不在中国人口中[30.那31]．p.R1407T突变是新的。根据ACMG指南，p.S3417del和p.R1407T突变MYO15A分别分为致病（PS1 + PM2 + PM3 + PM4）和可能的致病（PM2 + PM3 + PP3）。

4.讨论

遗传性听力损失中，隐性听力损失占绝大多数(80%)[32]．在许多原因中，负责Arsnhl，突变GJB2.是最常见的原因[33那34]，其次是那个SLC26A4那TMC1.， 和MYO15A特别是在中东国家，近亲婚姻是常见的[15那22那35]．相反，在近亲结婚远不常见的中国，隐性突变在TMC1.和MYO15A在文献中并没有被广泛报道。

在家庭1中，我们鉴定了化合物杂合突变p.r34x和p.m413tTMC1.．p.r34x突变是最常见的TMC1.巴基斯坦突变[36]．使用多晶型标记，Ben说等。表明，这种无意义的突变是1075年和1900年之间出现的古老创始人突变以及第三个HATHRAMAUT人口运动[27]．预计这种无意义的突变产生过早截断的蛋白质，与先天性，严重的突厥相关[13那27]．本研究中发现的p.M413T突变此前未见报道。通过计算工具PolyPhen2和SIFT，预测该方法是有害的。p.M413T突变位于TMC1第三和第四跨膜结构域之间的第2个胞外环，蛋氨酸413残基在不同物种之间保存良好(图)3（b））.在第二细胞外环至少有7个突变，包括5个错义突变，已经与ARNSHL和ADNSHL相关(图)5（a）），表明该特定区域在TMC1的内耳功能中的重要作用。

在家庭2中，我们鉴定了化合物杂合突变P.S3417DEL和P.R1407TMYO15A．p.S3417del突变删除Myosin XVA第二FERM结构域的一个丝氨酸3417残基。FERM结构域是一个蛋白质结合结构域，在货物运输和细胞质蛋白与膜的连接中非常重要[37那38]．此突变以前在日语和韩国聋患者中报道，但不在中国人口中[30.那31]．本研究中鉴定的新型p.R1407T突变被计算工具多酚2和SIFT预测为有害。该突变位于肌球蛋白XVA的电机结构域，其在长n末端延伸旁边，在不同的物种之间高度保守（图4（b））.迄今为止，摩托领域的40多个畸形突变MYO15A都与ARSNHL有关(图5（b））.电机结构域对于ATP活性至关重要，并且具有肌动蛋白和ATP的两个结合位点，其可以产生移动肌动蛋白长丝的力。在鼠标模型中，MYO15A运动域的突变导致短的立体纤毛和异常的阶梯结构[39]．

由于遗传异质性的高度，下一代测序(NGS)技术近年来已被证明是一种有效的听力损失基因检测方法。然而，以往的研究表明，在聋人患者中，特别是散发性病例中，NGS可能检测到大量罕见的、功能意义未知的非同义变异，有时甚至导致假阳性诊断[25]．在本研究中，我们获得了所有患者的详细听力表型，这与之前报道的隐性ARSNHL患者的听力表型一致TMC1.和MYO15A突变。我们的数据表明，在这种情况下，基因型表型相关可以促进更准确的聋性遗传诊断。

5.结论

化合物杂合突变P.R34x / p.m413tTMC1.和p.S3417DEL / P.R1407TMYO15A2个汉族家庭的ARSNHL发病原因。我们的结果扩大了这两个基因的突变谱，表明NGS结合基因型-表型相关性可能对遗传性耳聋提供更准确的诊断。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

徐鹏程、徐军、胡鹏对这项工作贡献相同。

致谢

本研究由上海市教委-高峰临床医学资助项目(20152519 ~ TY)、上海市卫生和计划生育委员会科学项目(201540173 ~ HP)和国家自然科学基金项目(81702643 ~ HP)资助。

补充材料

表S1: 414个与耳聋相关的基因序列。表S2:通过靶向NGS在先证者F1-II-1和F2-II-1中识别的候选突变。（补充材料）

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