文摘
Adult-generated神经元在海马齿状回(DG)扮演一个角色在各种形式的学习和记忆。然而,成人神经元生于总干事,虽然仍处于不成熟的阶段,表现出独特的电生理特性和功能上也与学习和记忆相关的流程。我们调查的影响,灭绝的毒瘾未成熟神经元的形成在DG的量化评估doublecortin(克莱斯勒)免疫反应性。老鼠被允许服用海洛因(0.03毫克/公斤/注入)12天,然后受到灭绝的十天培训或被迫禁欲。我们还研究了灭绝回应模式后海洛因在胶质原纤维酸性蛋白实行胸苷激酶(GFAP-tk)转基因小鼠,之前已被证明显示减少的形成不成熟和成熟的神经元在治疗后的DG更昔洛韦(GCV)。灭绝我们发现培训增加克莱斯勒背DG的免疫反应性与动物相比接受被迫禁欲,这GCV-treated GFAP-tk老鼠显示受损灭绝学习相比saline-treated老鼠。毒瘾的灭绝我们的研究结果表明,增加未成熟神经元的DG的形成,这些神经元可能在灭绝的学习发挥功能作用。
1。介绍
Adult-born神经元的齿状回(DG)的成人海马神经祖细胞生成(npc)位于subgranular层的大脑区域,增殖和分化成成熟神经元和随后迁移到颗粒细胞层作为成熟他们融入现有的海马神经元电路(1]。有许多证据支持这一概念,成熟adult-born神经元导致一些形式的hippocampus-dependent学习和记忆过程,如空间导航、上下文学习,和模式分离(综述[2- - - - - -7])。各种神经精神疾病,如抑郁症、精神分裂症、药物成瘾的特点是改变神经发生在总干事1,8- - - - - -10]。药物成瘾的文献中,人们普遍认为,大多数药物的滥用,包括鸦片、乙醇,和精神兴奋药,抑制了神经发生在总干事11- - - - - -16],有人建议,减少DG神经发生可能起决定性作用在某些认知缺陷经常观察到吸毒者,如不适应的语境和情景记忆的形成,改变了空间能力,认知缺乏灵活性,和容易复发17- - - - - -19]。
虽然大多数研究神经发生在成年人的DG一直专注于影响扩散的因素,分化,和生存的npc,以及成熟的角色adult-born神经元在不同认知功能,相对很少有人知道adult-born神经元的功能尚未完全发展成成熟的颗粒细胞。有已知种特异的时期(大约3 - 6星期啮齿动物)之间人大增殖和成熟的齿状颗粒细胞的形成当adult-born神经元被认为是不成熟的。在这个时期,成熟adult-born神经元接受大量的形态和生理成熟和展览增强诱导的突触可塑性和更低的阈值(LTP)[长期电位化20.,21]。在这个阶段,暂时未成熟神经元表达microtubule-associated蛋白doublecortin(克莱斯勒)22,23免疫组织化学检测和量化的),它允许未成熟神经元的DG的数量。最近的研究使用新的转基因方法有选择地切除未成熟神经元的DG显示,事实上这些神经元调节空间记忆以及条件性恐惧的灭绝(24]。然而,未成熟神经元DG的角色在灭绝集行为尚未探索。
鉴于灭绝是一个建立的新形式和主动学习25- - - - - -28),本研究的目的旨在探索的可能性不成熟DG神经元参与毒瘾的灭绝。在实验1中,我们试图确定灭绝后海洛因毒瘾自治会改变克莱斯勒DG的免疫反应性与动物发生被迫禁欲。在实验2中,我们试图确定抑制DG的未成熟神经元的生成海洛因服药后灭绝会影响响应。
2。材料和方法
2.1。主题
动物被维护在一个12小时的光暗周期(灯在hr 07:00)在一个温度和湿度的房间里。动物有随意获取食物和水在所有阶段的实验行为测试期间除外。所有试验程序进行批准机构的动物保健和使用委员会的南卡罗来纳医科大学的,按照实验动物保健原则和哺乳动物保健和使用指南的神经系统科学和行为研究(国家研究委员会,2003)。实验1,男性Sprague-Dawley老鼠(哈伦实验室、利弗莫尔、钙、美国)体重大约250 - 275 g被单独安置在到达。实验2,男性GFAP-tk老鼠(B6.Cg-Tg (GFAP-tk) 7.1 Mvs / J,股票# 005698;美国杰克逊实验室、巴尔港、我)重约20 - 25 g被单独安置在到达。这只老鼠应变生成所述其他地方(29日,30.表达一个单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)只在GFAP-positive细胞,增殖细胞表达的转基因抗病毒剂的存在更昔洛韦(GCV)产生有毒的核苷酸类似物,促进细胞死亡。因此,GFAP-tk老鼠被用作工具调查adult-generated神经元前体细胞的作用[31日]。这种应变backcrossed从创始人行到C57BL / 6背景应变超过12代。在装运之前,所有的动物都被哈伦植入颈静脉导管或杰克逊实验室的外科服务。导管满心Hep-Lock解决方案,隧道退出肩胛骨之间的背部皮下注射,插入片段1厘米的不锈钢管和保护皮肤伤口剪辑的背。
2.2。药物
海洛因(盐酸二乙酰吗啡)5-bromodeoxyuridine (BrDU)和戊巴比妥钠从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。海洛因是溶解在无菌生理盐水静脉(注射)自治。BrDU是溶解在无菌生理盐水的浓度50毫克/毫升腹腔内(i.p)管理和管理在一个卷1毫升/公斤产量最终每注射剂量50毫克/公斤。戊巴比妥钠溶解在无菌生理盐水含有10%乙醇和40% v / v / v v丙二醇的浓度为150毫克/毫升的ip管理。更昔洛韦(GCV)从水石书店获得技术(美国在圣卡梅尔)和溶解的浓度10毫克/毫升无菌生理盐水对皮下政府通过渗透微型泵。
2.3。装置
药物服药和灭绝训练进行了操作性自治钱伯斯(env - 008老鼠,老鼠env - 307;地中海Associates圣奥尔本斯,美国VT)。每个自治室位于sound-attenuating隔间内配备了房子光和一个面具外部设计的排气扇噪音和气味和PC计算机界面的。定位上面每个杆直径2.5厘米的白色刺激光。注射器泵被以外自治钱伯斯和电脑的连接。药物方案都通过通过单通道注射泵的液体旋转安装在室,这是连接到一个血管接入端口。
2.4。外科手术
货到后,动物被允许手术之前一天的适应。实验1、老鼠和异氟烷麻醉(2% v / v)蒸发在医用氧气流量的2 L / min。主食周边导管油管被移除和小不点纵向切口植入螺纹的血管访问端口(塑料;美国弗吉尼亚州)。访问端口被连接到一个网格衣领缝合切口内的周围组织,下面密封用聚乙烯管一端封闭和保护帽。手术后,老鼠被给予5天的术后护理期间他们收到日常肝素静脉输液70 U /毫升(0.2毫升卷)维持术后导管和100毫克/毫升头孢唑林(0.1毫升量)来防止感染。老鼠还收到了每日皮下注射2.5毫克/毫升的meloxicam体积(0.15毫升)14日不适。手术网站也采用局部利多卡因和三重抗生素软膏,促进伤口的愈合。
2实验,小鼠麻醉如上所述,导管出口伤口扩大到1厘米长,和小鼠植入无菌渗透微型真空泵(型号1004,泵率0.11μL /人力资源;Alzet;库比蒂诺、钙、美国)包含无菌生理盐水或GCV(10毫克/毫升)到背部。导管是削减从出口处的伤口延长1厘米。微型泵植入术后,老鼠肝素治疗10 U /毫升(0.05毫升卷)维持术后导管和10毫克/毫升头孢唑林(0.05毫升量)来防止感染。手术地点接受局部利多卡因和三重抗生素软膏,促进伤口的愈合,和老鼠被允许1天恢复药物实行程序启动之前。
2.5。海洛因自治
所有自治制度,程序在黑暗的阶段进行了光暗周期。图中提供了两个实验的时间表1。在实验1中,启动操作回应,老鼠被放置在实行室一个16一夜之间人力资源培训,每个按指定的活动杆了45毫克食物颗粒(美国Test-diet,里士满)成一个小球上的插座固定比率1 (FR1)钢筋明细表。每个杆新闻是伴随着一个并发的照明光的刺激活动杆上方的2秒。每一种食物颗粒交付之后,20秒超时时间,在此期间额外的活动杆按记录但没有生产程序的后果。按指定的活动杆上记录但没有产生后果在任何时间在实验。大约24小时后,最初的夜间训练,3人力资源日常海洛因自治会议发起,活动杆上的按导致交付的海洛因(0.03毫克/公斤/灌注,在体积为0.06毫升在2秒内)钢筋FR1时间表。每种药物输液之后,20秒超时时间,在此期间额外的活动杆按记录但没有生产程序的后果。每种药物灌注是伴随着并发照明光刺激的活动杆上方的2秒。自治制度,会议进行了连续6天每周总共12天。身体重量评估每隔5 - 7天,以评估潜在的减肥结果自主自办的海洛因调整浓度注入注射器的海洛因。
在实验2中,海洛因在GFAP-tk老鼠在第二天开始实行微型泵植入。过程类似于实验1,以下例外:(1)食物颗粒没有进行训练,因为老鼠自治室没有配备颗粒分配器或插座;(2)海洛因的体积是0.02毫升在1秒内;(3)自治会议进行了总共10天。组身体重量评估当天微型泵植入术后又在灭绝的每一个5天,以评估潜在减肥由于海洛因自治和/或GCV治疗和调整浓度注入注射器的海洛因。BrDU注射的剂量50毫克/公斤的1分钟内每个5灭绝的会话结束。
2.6。灭绝的过程
灭绝会话3人力资源的杆长在回应之前交付海洛因不再产生任何编程的后果。此外,光信号,以前陪强化物交付期间没有灭绝。动物受到灭绝的训练来达到目标水平的灭绝回应相当于25%的活动杆的数量按平均发出的最后2天活跃的海洛因自治制度。大部分灭绝以来,活动杆上的响应在实验1中观察第一次5灭绝训练期间,只有5灭绝会话进行了实验2。每个5灭绝训练之后,老鼠注射BrDU(50毫克/公斤i.p。)提供的一项指标的形成不成熟神经元的抑制。
在实验1中,动物正在被迫禁欲而灭绝的训练被运送到一个中立的房间大约在同一时间灭绝会议进行时,处理简单,安静的留在家里笼3小时(相当于灭绝会话的长度)。然后老鼠返回给殖民地的房间。这个过程被重复每天总共10天灭绝并行的天数进行培训。
2.7。DCX免疫反应性的评估
在实验1中,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(150毫克/公斤i.p。)最终灭绝训练后7天内(或当天对动物进行强迫abstinence-see图1)和灌注transcardially 100毫升的磷酸盐(PBS, pH = 7.4)包含0.1% w / v肝素其次是200毫升的4% w / v多聚甲醛在0.1 PBS (pH = 7.4)。大脑被移除,后缀在24小时的固定剂解决方案在4°C, cryoprotected 30% w / v蔗糖在4°C PBS 48小时,切成30μm日冕部分沿着海马神经轴),自由浮动的DCX免疫组织化学和加工。部分是preblocked包含0.1%渐变20在PBS为1小时,1米甘氨酸,和5% w / v驴血清,紧随其后的是隔夜孵化与兔子anti-DCX主抗血清(1:500;Abcam;美国Cambridge, MA)在4°C。第二天,部分被洗,孵化与DyLight 594 -共轭驴anti-rabbit中等抗血清(1:500;杰克逊ImmunoResearch;西树林,宾夕法尼亚州,美国),水洗,安装到显微镜载玻片和盖玻片和延长不变色安装介质(表达载体;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。幻灯片是存储在黑暗中,直到量化,这是执行在400 x放大显微数字化(徕卡微系统;美国班诺克本,IL)的调查员对实验条件视而不见。 Manual rotation of the fine focus in thez的地方进行验证DCX-positive细胞体的存在。DCX免疫反应性的神经元的数目在subgranular层DG的量化的一个半球−1.8−6.4毫米后根据[前囱到最近的0.2毫米32]。克莱斯勒总数量在整个海马神经轴被求和计算截面的数量在每个冠级别为每个单独的动物。DG DCX免疫反应性的图像呈现在图2得到蔡司LSM 410共焦显微镜。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
免疫组织化学染色的组织从克莱斯勒GFAP-tk小鼠免疫反应性产生了不足和不满意的染色模式,缺乏证明了染色颗粒细胞的树突过程层。从不同的供应商使用的主要抗血清也产生了令人满意的结果。因此我们试图验证减少神经元生产这些小鼠诱导的DG GCV利用以前出版程序BrDU免疫组织化学(33在小鼠海马神经轴。
2.8。统计分析
活跃的和不活跃的杠杆式压力机进行分析的数据单向方差分析其次是Holm-Sidak事后测试。克莱斯勒免疫反应性量化分析了沿海马神经轴双向方差分析(以治疗组为主体间变量和截面平面intrasubject变量)其次是Holm-Sidak事后测试。总克莱斯勒计数动物正在灭绝与禁欲,以及身体重量的老鼠用生理盐水或GCV治疗,由单向方差分析进行了分析。统计显著性水平的设置所有的测试。
3所示。结果
行为过程的时间实验1和2呈现在图1。海洛因自治数据和灭绝的影响与禁欲DCX免疫反应性是描绘在图2。没有差异数量的活跃或者不活跃的杆压在活跃的海洛因自治之间的观察动物,随后进行了灭绝或禁欲()。此外,海洛因的数量获得注资在每个会话组(没有差异数据未显示),这表明海洛因摄入之前就相当于灭绝。动物受到灭绝训练显著变化显示活动杆压跨灭绝会话行为(,;图2(一个))。按活动杆上的显著增加在灭绝的第一天相比平均活跃海洛因自治的最后2天,预计“灭绝破裂”的特点后删除海洛因作为强化物。灭绝的第二天后,杆压下降,显著低于3日期间通过10灭绝会话比自主自办的最后两天的平均值。不活跃的杆的数量按没有差别在实验小组和也没有改变跨灭绝会话(;图2 (b))。缺乏减少活动杆按由灭绝以来培训可能是因为地板效应意味着每个会话的活动杆按数量在最后两天的海洛因自治是小于5的两组。
DCX免疫反应性的分析以及动物的海马神经轴进行了灭绝培训或禁欲海洛因服药后显示extinction-trained动物表现出更高水平的克莱斯勒免疫反应性(,;数据2 (c)- - - - - -2 (e)DG)背地区从3.0到4.0毫米前囱后面。未发现组差异在腹侧/ DG的后部区域。此外,克莱斯勒总数量在所有章节分析了高(,在经历了灭绝的动物(),意味着±SEM)比那些接受禁欲(,意味着±SEM)。
实验2的结果是描绘在图3。没有差异杆按10天期间活跃海洛因自治制度,指出在GFAP-tk老鼠接收盐水或GCV (;图3(一个))或数量的海洛因注入获得(数据未显示)表明摄入同等水平的海洛因在两组之间。摄入水平的海洛因在这些GFAP-tk老鼠类似报道之前在Balb / c小鼠34]。灭绝的前3天,GCV-treated老鼠显示增加的压杆的数量之前交付的海洛因(,;图3(一个)),这表明灭绝学习的障碍。治疗组之间没有差异指出了活动杆压在任何阶段的实验(;图3 (b))。同样,海洛因服药前后体重数据的分析显示体重和体重增加(),这表明海洛因自治和/或GCV治疗没有产生非特异性影响GFAP-tk老鼠的食物摄入量。
(一)
(b)
正如前面提到的,使用的主要抗血清对克莱斯勒从两个不同的商业供应商生产不足和不满意的染色模式。因此,为了验证新增殖细胞的减少GCV-induced GFAP-tk DG的老鼠,BrDU进行免疫组织化学。每节BrDU-positive细胞的数量显著降低小鼠GCV处理(,意味着±SEM)比那些用生理盐水治疗(,意味着±SEM) (,)。
4所示。讨论
在实验1中,我们证明了灭绝培训程序后海洛因自治制度,生产水平的提高克莱斯勒DG的免疫反应性,主要是在更多的吻侧/背地区,与动物相比,接受禁欲。灭绝的毒瘾成瘾的啮齿动物模型通常是由扣缴药物强化物和相关提示当动物之前执行相同的操作任务,导致药物注入和线索。虽然我们没有评估灭绝的影响成熟神经元的DG的生产,我们的发现符合Rapanelli和同事(35),他们发现,对老鼠一个操作性条件反射的任务导致背DG成熟神经元的数量增加。
在实验2中,我们发现损伤的细胞增殖DG的政府GCV GFAP-tk老鼠灭绝导致增加反应在第一次3会议后停止海洛因的可用性。同样,努南和他的同事们(36)曾表明,消融的成熟和未成熟神经元DG的海马辐照导致增加反应在第一次3灭绝可卡因服药后会议。然而,不幸的是,目前的研究没有评估GCV的影响治疗的形成不成熟和成熟的神经元,只有数量的非特异性量化BrDU-positive细胞作为细胞增殖的指标。然而GCV政府的短时间内(10天之后开始灭绝培训第二天)和所需的已知的时间形成成熟的成年小鼠神经元DG(> 4周,请参见[37,38]),我们的研究表明未成熟神经元的DG可能发挥作用在灭绝的过程中学习。额外的研究使用转基因的老鼠,更精确地允许函数的考试DG未成熟神经元,如nestin-tk老鼠(24),显然是必要的证实了这一点。
我们指出,灭绝培训后海洛因自治制度,增加克莱斯勒DG的免疫反应性主要是背地区虽然没有这样的效果观察腹DG。大量的证据表明,背的海马区域调解毒瘾(39- - - - - -41),尽管adult-born神经元的精确作用特别是在总干事,不成熟和成熟,尚未完全定义(17- - - - - -19]。与我们的研究结果相比,其他研究者报道,可卡因自治制度,其次是持续药物摄入量或撤出导致优惠增加克莱斯勒免疫反应性在DG的后/腹区域(42]。extinction-induced增加的原因根本我们的观察克莱斯勒免疫反应性背DG地区目前不清楚,但可能与功能性二分法的背侧和腹侧海马的领域,与更多的背地区中介空间信息处理和后/腹区域调解边缘情绪性等功能(43]。未来的研究采用的方法操作不成熟DG和精确的解剖特异性神经元需要解决这个问题。
有几本研究的局限性。首先,DCX-positive神经元的数量每日冕部分在实验1中低于那些由他人已报告(36,42,44]。有许多可能导致这些差异的因素,如opiate-induced抑制人大扩散或生存12,45- - - - - -47),不同的抗原,克莱斯勒主要提出了抗血清,和不同的量化(体视学和手工计算)的方法。第二,由于技术问题,利用克莱斯勒抗血清在小鼠组织,我们无法量化的程度GCV抑制DCX-immunoreactive未成熟神经元的DG的形成,而且只有一个非特异性增殖细胞的数量的评估BrDU免疫组织化学。显然,未来的研究应该进行评估一系列的标记变化人大增殖、分化、成熟和细胞死亡结果发生的DG灭绝的培训。第三,两个限制条件下小鼠和大鼠自行海洛因(3小时/天),不可能依赖鸦片,通常条件下实现扩展每日访问(6 +人力资源/天)。灭绝的影响培训克莱斯勒DG heroin-dependent动物的免疫反应性是一个值得进一步探索的大道。
总之,我们提供证据,灭绝训练后海洛因自治制度,增加的数量DCX-positive未成熟神经元选择性DG的背地区。我们还提供证据,抑制细胞增殖的DG增加反应在灭绝,这是表明受损灭绝学习。这些发现进一步支持借给DG的观念不成熟的神经元可能发挥功能作用在某些学习和记忆过程,包括毒瘾的灭绝。
承认
这项工作是支持的公共卫生服务格兰特DA024355国家药物滥用研究所。