文摘
客观的。调查的影响干扰素-α2 b在预防术后arthrofibrosis老鼠,其对成纤维细胞在体外抗作用,及其分子机制。方法。arthrofibrosis的老鼠模型建立了用不同浓度的药物和治疗。膝盖收集标本组织学和免疫组织化学染色观察干扰素——的影响α2 b在arthrofibrosis老鼠。生物信息是根据数据库数据进一步挖掘,以及可能的调节机制IFN -α2 b在成纤维细胞进行了分析。干扰素的抑制作用α2 b在成纤维细胞体外增殖和迁移是由细胞计数检测kit-8 (CCK-8),免疫荧光分析、细胞周期测试,EdU化验,伤口愈合测试,和Transwell方法,分析结果验证了免疫印迹的方法。结果。大鼠膝关节标本的检测结果表明,干扰素-α2 b显著抑制纤维化的程度后膝关节手术,成纤维细胞的数量的操作面积小于对照组,蛋白质和胶原蛋白的表达和扩散减少。体外实验结果表明,干扰素-α2 b可以抑制成纤维细胞的增殖和迁移。根据数据库的结果分析,建议P21 STAT1 /通路可能涉及到,它已经验证,证实了西方墨点法和其他相关方法。结论。干扰素-α2 b可以减少surgery-induced arthrofibrosis通过抑制成纤维细胞增殖和迁移,这可能与p21 STAT1 /信号通路的调控。
1。介绍
Arthrofibrosis是关节创伤和手术后常见的并发症,它的特点是过度生产的纤维疤痕组织在关节1- - - - - -3]。以前的研究已经表明arthrofibrosis相关成纤维细胞的过度增生手术区域。过度扩散成纤维细胞将迁移到该地区手术后,分泌细胞外基质(ECM)过度和胶原蛋白沉积,最终导致arthrofibrosis [4,5]。的overhyperplasia纤维化组织会引起疼痛和限制关节活动的正常范围,它可以严重影响病人的术后生活(6,7]。
近年来,许多策略被采用,如全面运动膝关节的麻醉后,关节镜清理关节腔,形成局部药物治疗,以减少术后arthrofibrosis [8- - - - - -10]。其他研究报告,arthrofibrosis最好的治疗是早期识别和干预11]。因此,早期应用药物以防止arthrofibrosis值得关注。但是,虽然取得了一些成绩在本地应用药物的研究,仍有相当大的局限性在临床试验之前由于上述药物的副作用或给药途径的影响。
干扰素-α2 b是一种细胞因子与许多生物活性如抗病毒、抗肿瘤、抗免疫调节。它具有良好的体内药物耐受性,甚至在大剂量应用程序(12]。之前的研究表明,干扰素-α2 b可以治疗一些fibroproliferative疾病(如肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩)13]。此外,它还起着积极的预防作用在青光眼滤过手术后疤痕形成和腭裂手术后疤痕形成14- - - - - -16]。它不仅可以抑制成纤维细胞的增殖,而且减少胶原蛋白的形成,从而防止肝纤维化的形成。然而,并没有研究干扰素-α2 b的arthrofibrosis现有文献。基于上述研究背景,我们选择干扰素-α2 b对老鼠的预防术后arthrofibrosis和成纤维细胞在体外的治疗以探索其预防膝盖arthrofibrosis效果和可能机制。
2。材料和方法
2.1。试剂
使用的试剂是重组人干扰素(干扰素-α2 bα2 b), ,起源于GenScript生物技术有限公司(南京,中国)。
2.2。动物
这个实验的动物研究是扬州大学的动物研究委员会批准。所有的老鼠接受严格的护理。36 SD雄性老鼠选择重约300克,随机分为3组每组(12)。
2.3。Arthrofibrosis模型的建立
老鼠麻醉成功后,膝关节通过内侧髌骨的方法被打开,内侧和外侧股骨髁部完全暴露。大约4的皮质骨4毫米切除直到松质骨暴露,和关节软骨是完整的;然后,伤口被盐水或干扰素,覆盖着α2 b网10分钟。止血后,纱布被缝合关节囊及皮肤。手术后,抗生素应用连续3天(肌内,50毫克/公斤),和生理盐水或相应浓度的干扰素-α2 b 50μl在操作膝关节注射局部每周3次(17]。
2.4。组织学分析
实验结束后4周后手术。从每组六个老鼠随机选择,膝关节标本进行组织学分析。膝关节标本和4%多聚甲醛固定的48小时内,完全脱钙在乙二胺四乙酸(EDTA)和嵌入在石蜡。4μm系列部分被deparaffinized水,hematoxylin-eosin(他)染色进行检测肝纤维化的程度和成纤维细胞的数量,和马森的三色的染色是用来观察胶原蛋白的生产。胶原蛋白是沾染了苦味酸的acid-Sirius红色,和I型胶原蛋白和III型胶原蛋白是偏振光显微镜下观察和区分;光密度值的彩色图像和细胞计数分析检测到ImageJ软件。
2.5。免疫组织化学染色
部分deparaffinized和水化。3%柠檬酸钠缓冲被用来激活抗原性,H2O2抑制过氧化物酶活动,部分与PBS溶液洗3次。然后,主抗体(anti-PCNA, anti-collagen我,反αsma)孵化一夜之间在4°C。部分是孵化与anti-mouse免疫球蛋白30分钟在室温下,民建联工具包是用于检测抗体绑定。最后,苏木精复染色,结果是一个光学显微镜下观察和拍照。
2.6。数据集选择和识别度
基因表达数据集GSE38652获得地理数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。包括(一)干扰素-筛选依据α2 b处理因素,(b)成纤维细胞作为干预对象,和(c)有机体智人。GSE38652基于GPL10558 (Illumina公司HumanHT-12 V4.0表达式beadchip)平台,所有数据可以在线免费获得。使用GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)在线软件分析原始数据和识别差异表达基因(度)。 和 被用作截止条件获得度。
2.7。浓缩度和PPI网络的分析
蛋白质的相互作用(PPI)网络建立了字符串数据库(http://string-db.org)[18]。在这个研究中,高的交互 在统计学上意义重大。为了探索更多相关生物信息度和获得更全面的基因和蛋白质功能,我们进行基因本体论(去)浓缩基因和基因组的分析和京都百科全书(KEGG)通路富集分析通过Metascape (http://metascape.org)[19]。浓缩分析包括生物过程(BP),电池组件(CC)和分子功能(MF)。此外,我们还执行TRRUST转录调控网络分析(20.]。
2.8。纤维母细胞文化和干扰素-α2 b治疗
提供的是人类成纤维细胞系Jenino生物技术有限公司有限公司(广州),然后在含15%胎牛血清的培养基培养(的边后卫;美国双子)和1%链霉素/青霉素(Beyotime、上海、中国),在37°C公司为5%2。选择3至5代成纤维细胞为后续实验。成纤维细胞与干扰素治疗α在四个浓度组2 b(0, 1000, 5000,和10000国际单位/毫升)(17]。机制研究小组,我们进行预处理成纤维细胞与50μM氟达拉滨(特定Stat1抑制剂)2小时然后改变介质含有不同浓度的干扰素-α2 b继续孵化(21]。
2.9。细胞生存能力分析
首先,100μl细胞悬液是种植在96孔培养板。当细胞密度达到60% - -70%时,不同浓度的干扰素-α添加了2 b对成纤维细胞。药物刺激后,10μl CCK-8 (Dojindo、东京、日本)的解决方案是添加,然后培养在37°C 2小时。最后,在450 nm测定吸光度。
2.10。细胞周期分析
成纤维细胞与干扰素治疗α2 b 5000 U /毫升48小时,然后根据指令操作的细胞周期测试套件(Beyotime、上海、中国)。收集细胞,离心机在2000 r / min 5分钟,用预冷PBS,与绝对70%乙醇固定,固定在一夜之间在4°C。再次离心后,细胞被resuspended 500μl propidium碘染色方案提前准备,在黑暗中在室温下孵化30分钟,然后,流式细胞术。最后,分布在不同时期的细胞被ModFit LT计算软件。
2.11。细胞免疫荧光成像分析
成纤维细胞在4%多聚甲醛固定20分钟,渗透与0.5% Triton x - 100 10分钟,和阻止5%山羊血清在室温下30分钟。然后,主抗体(I型胶原蛋白和混合物αsma)滴到细胞幻灯片和孵化一夜之间在4°C。PBST清洗后,二级抗体孵化在黑暗中在室温1小时。清洗后,DAPI染色在黑暗中10分钟。最后,荧光显微镜下的图像采集(德国蔡司)。
2.12。EdU公司分析
Cell-Light KFluor555 EdU工具包(南京凯基生物,中国)是用于检测成纤维细胞的增殖。根据指示操作。首先,植物纤维母细胞在细胞玻片6-well板的细胞密度 /好。细胞培养在37°C一夜之间,以及不同浓度的干扰素-α2 b被添加到培养基48小时。补充后10μM EdU和孵化2 h,细胞与4%多聚甲醛固定15分钟,然后用0.5%渗透Triton x - 100 20分钟。最后,污渍与赫斯特33342年,酝酿在黑暗中在室温下10分钟,一个正直的荧光显微镜下,观察阳性染色。
2.13。细胞迁移试验
伤口愈合试验和Transwell迁移测试是用来评估细胞迁移行为。简而言之,把消毒culture-inserts中心12的每个孔培养板,加入70毫升culture-inserts每个区间的细胞悬液,将其放入细胞培养箱直到底部的细胞完全融合,然后轻轻地把culture-inserts。与PBS洗3次,然后,无血清培养基和检测试剂添加;在不同的时间点观察和收集图像(0,12、24、48小时)。
聚碳酸酯膜Transwell过滤器被选为Transwell化验(美国纽约康宁公司)。首先,600μl完全培养基添加到每个24-well板块,然后,100μl无血清纤维母细胞悬架( 细胞)被转移到上层的Transwell室和对待不同的试剂。培养后细胞培养24小时,商会与PBS轻轻清洗,以4%的多聚甲醛固定,与结晶紫染色,轻轻擦上细胞室用棉签。最后,蔡司倒置显微镜下的图像采集。伤口愈合率和跨膜迁移细胞被ImageJ计算软件。
2.14。免疫印迹分析
根据指令里帕溶菌作用的解决方案(Beyotime、上海、中国),不同组的成纤维细胞的总蛋白提取。相同数量的总蛋白(60μg / lane)是在10%或12% sds - page电泳,然后转移到聚乙二烯二氟化物膜(微孔,贝德福德,MA)在低温度。块有5%脱脂奶或3%牛血清白蛋白(BSA)在室温下2小时,晚上孵化主要抗体在4°C,然后孵化二级抗体在室温下2小时。最后,增强化学发光检测设备(ECL +装备,Beyotime)是用于检测蛋白质的乐队。
增殖细胞核抗原(# 2586),鼠单克隆抗体兔单克隆抗体细胞周期蛋白(# 67955),辣根peroxidase-conjugated山羊anti-mouse(# 7056),和山羊anti-rabbit(# 7074)抗体购自细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。兔单克隆抗体STAT1 (ab109320)和phospho-STAT1 (ab109461)提供的Abcam(英国剑桥)。鼠标单克隆αsma (67735 - 1 - ig), P21兔多克隆抗体(10355 - 1 - ap),胶原蛋白I型(14695 - 1 - ap),β肌动蛋白(20536 - 1 - ap), GAPDH (10494 - 1 - ap)是由Proteintech提供集团(武汉,中国)。
2.15。统计分析
在这项研究中所有数据通过SPSS 19.0统计软件进行分析。数据被表示为 。数据分析了单向方差分析(方差分析),其次是图基的测试对比组。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。干扰素-α2 b改善术后Arthrofibrosis老鼠
根据他染色结果,瘢痕成纤维细胞的数量和致密纤维组织在干扰素-膝盖手术区域α2 b组减少,组织结构稀疏,纤维化程度的提高(数字1(一)和1(b));成纤维细胞的数量减少与增加干扰素-α(图2 b浓度1(c))。马森的染色是用来评估的程度在arthrofibrosis胶原合成干扰素-地方政府α2 b。arthrofibrosis的染色结果表明,胶原蛋白合成减少后的应用干扰素-α2 b,特别是大剂量应用程序组(图1(d));光密度分析的结果还表明,干扰素-α2 b可以有效地减少胶原蛋白的生产(图1(e))。
免疫组织化学染色显示,干扰素- I型胶原蛋白的表达α2 b治疗组低于生理盐水的应用程序组(数字2(一)和2(b))。也是如此的III型胶原蛋白的表达(数字2(c)和2(d))。小天狼星红染色表明,I型胶原纤维(红色或黄色)和III型胶原纤维(绿色)降低干扰素-α治疗组(图2 b2(e))。同样,免疫组织化学染色的增殖,增殖细胞核抗原(图移民相关的蛋白质2(f))αsma(图2(h))显示,干扰素的表达α2 b-treated组显著低于对照组(数字2(g)和2(我))。总之,上面的体内实验结果表明干扰素-α2 b有潜力改善arthrofibrosis老鼠。
3.2。度采集和PPI网络的关系,去,KEGG, TRRUST富集分析
火山的地图显示28553表达基因的分布(图3(一个))。其中,根据 和 截止条件,78度被提取,交互关系如图3 (b)。为了获得更多的生物信息,我们使用了在线数据库(Metascape)来执行和KEGG富集分析。度分为三个功能组:生物过程(BP),分子功能(MF)和细胞组件(CC)。去分析表明,生物学过程的变化是显著强化防御应对病毒,负调节病毒过程中,应对的I型干扰素,I型干扰素的积极调控生产和其他免疫反应和转录调控。至于蜂窝组件,度是丰富的细胞质细胞核周围的地区。分子功能的变化主要集中在2 - - - - - -5 - - - - - -oligoadenylate合成酶活性,RNA解旋酶活动,nuclearoside-triphosphatase活动,ubiquitin-protein转移酶活性,蛋白质homodimerization活动,ubiquitin-like蛋白连接酶绑定,核受体结合,蛋白质磷酸酶绑定方面(图3 (c))。KEGG路径分析表明,度在丙型肝炎/ B扮演关键角色,RIG-I-like受体信号通路,和肿瘤坏死因子信号通路(图3 (d))。TRRUST数据库可以提供关于如何监管这些交互的信息,和分析表明,度基因转录调控主要富集在如STAT1 IRF1, BRCA1, RELA(图3 (e))。蛋白质的相互作用(PPI)网络结果显示(图22中心基因和125联系3 (f)),包括STAT1的基因。通过以上分析,我们推测干扰素-所扮演的角色α2 b在成纤维细胞主要是由STAT1, P21,作为STAT1的下游分子,可以调节细胞增殖。因此,我们验证了STAT1 P21 /通路体外。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。干扰素-α2 b抑制成纤维细胞增殖
CCK-8试验表明,成纤维细胞的活性与干扰素的增加减少α2 b浓度和处理时间的延长。结果表明,干扰素-α2 b抑制成纤维细胞的活动时间和浓度的方式(图4(一))。流式细胞仪分析表明,干扰素的比例α2 b-treated细胞S期显著增加,表明细胞周期可能会阻塞在S期(图4 (b))。荧光显微镜分析表明,随着干扰素-α2 b浓度、I型胶原蛋白的荧光强度αsma逐渐减少,这表明干扰素-α2 b减少细胞外基质的形成(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
EdU的分析实验结果显示,干扰素-的浓度α2 b增加,EdU-positive成纤维细胞减少,统计结果显示显著差异,氟达拉滨集团部分逆转这一趋势(数据5(一个)和5 (b))。此外,免疫印迹结果表明,扩散的蛋白质PCNA的表达水平,细胞周期蛋白A, I型胶原的增加也减少了干扰素-α2 b浓度(数字5 (c)和5 (d)),而STAT1和P21和干扰素的应用程序被激活α2 b。这是因为p-STAT1 / STAT1和P21的表达水平逐渐增加(数据5 (e)和5 (f))。通过添加氟达拉滨,上述现象趋势在一定程度上扭转了阻塞表达式。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。干扰素-α2 b抑制成纤维细胞迁移
治疗后与干扰素-α2 b,抑制成纤维细胞的迁移。与对照组相比,干扰素的伤口愈合率α2 b组降低剂量依赖性的方式(数字6(一)和6 (b))。Transwell迁移实验的结果表明,干扰素-的浓度α2 b增加。干扰素-的浓度α2 b增加,细胞的数量的底膜迁移室逐渐减少(图6 (c)和6 (d))。免疫印迹显示的表达水平α干扰素- smaα2 b应用程序组显示一个向下的趋势,以及氟达拉滨应用程序组也看到部分逆转的抑制趋势(数据6 (e)和6 (f))。总之,上述实验结果表明,干扰素-α2 b可以抑制成纤维细胞的增殖和迁移,P21和STAT1 /信号通路可能参与监管。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.5。相声STAT1 / P21和TGF之间β/ Smad信号通路
我们的团队在发表了一篇文章干扰素-α2 b治疗硬膜外术后粘连,这表明,干扰素-α2 b可以通过抑制TGF扮演一个角色β/ Smad信号通路(17]。这个手稿相关信号通路参与实验验证了我们筛选后网络数据库。结果表明,干扰素-α2 b可以抑制增生和纤维化膝盖手术后通过STAT1 P21 /通路。这两个信号通路的关系的研究中,我们进行了实验验证。这里,我们添加Smad3-specific抑制剂(SIS3)和STAT1-specific抑制剂氟达拉滨prestimulation [21,22),结果表明,STAT1磷酸化激活干扰素-α2 b应用和Smad7表达增加(抑制Smad3磷酸化)。此外,Smad3磷酸化和I型胶原蛋白表达明显降低,这可能是由氟达拉滨预处理逆转。p-STAT1的激活和Samd7的表达减少,Smad3增加,磷酸化和I型胶原蛋白的表达增加。然而,Smad3的磷酸化水平在SIS3治疗组显著降低,虽然1型胶原蛋白的表达也显示出下降的趋势,但无统计学差异,Smad7激活表达水平和p-STAT1(数据没有明显变化7(一)和7 (b))。根据实验结果,我们推测,相声STAT1 / P21和TGF之间β/ Smad信号通路,这可能是由于STAT1的磷酸化和激活,刺激增加Smad7然后在抑制Smad3的激活过程中发挥作用。
(一)
(b)
4所示。讨论
如前所述,成纤维细胞的过度增殖和过度分泌细胞外基质(ECM)的手术区域会导致纤维化(10),而胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分之一,它可以促进细胞增殖和迁移23]。成纤维细胞转变成myofibroblasts在纤维化,导致过度的合成和沉积的细胞外基质蛋白(24,25]。的表达αsma myofibroblasts(被认为是一个特殊的标记26]。临床研究报道,的表达α在关节纤维化标本(sma显著增加27),和高表达αsma也密切相关成纤维细胞的增殖和迁移28,29日]。在这项研究中,马森的染色和小天狼星红染色显示减少胶原蛋白沉积在干扰素-α2 b治疗组。体外实验的结果也表明,胶原蛋白的表达我和αsma在干扰素-下降α2 b-treated组。
大量的研究报道,干扰素-α2 b可以激活STAT1,导致STAT1的磷酸化30.,31日]。STAT1 STAT蛋白家族中的一员。细胞因子和生长因子,统计家庭成员是由受体相关激酶磷酸化形式为或形成,这是转移到细胞核转录激活物。据报道,老鼠,STAT1基因,更可能有化学诱导肺和肝纤维化32]。在皮肤模型中,胶原蛋白的表达αsma在伤口周围的肉芽组织的小鼠成纤维细胞STAT1基因缺陷增加,血管周围纤维化明显增加。这些结果表明,STAT1在组织修复过程中发挥作用(33]。干扰素-作为一个关键的元素α2 b信号转导,STAT1的功能主要是由其磷酸化状态。作为STAT1的活性形式,p-STAT1已被证明能够抑制肿瘤的生长调节细胞周期(34]。p21调节器STAT1的下游,是第一个发现了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(长江基建)蛋白成员。P21可以绑定几个化合物的细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK),如细胞周期蛋白/ CDK2、细胞周期素E / CDK2、细胞周期蛋白D1 /到和细胞周期蛋白D2 /到[35,36]。p21表达的增加可以减少细胞周期蛋白的表达,从而诱导细胞周期停滞和抑制细胞增殖37),这与我们的实验结果是一致的。在这项研究中,干扰素的增加α2 b浓度,p-stat1和p21的表达增加,而抑制细胞增殖和迁移。预处理组与STAT1-specific抑制剂的结果(氟达拉滨)部分逆转这一趋势。这意味着STAT1 / p21signaling通路参与了抗和迁移抑制干扰素-α2 b。在这项研究中,我们探讨P21 STAT1 /和TGF之间的关系β/ Smad信号通路。毕竟,TGFβ/ Smad信号通路在肝纤维化的形成中扮演着关键角色。结果表明,两者之间的串扰信号通路;即Stat1的激活可以促进Smad7的表达的增加,从而防止Smad3的表达,这是类似于一些先前的研究38,39]。
在我们的实验中,没有延迟伤口愈合,表皮坏死,手术切口感染和死亡。然而,我们没有探索的应用大剂量和时间,我们也没有屏幕的最佳应用药物的浓度,这也是这个实验的不足。此外,肝纤维化的形成机制是非常复杂的。除了成纤维细胞的增殖和迁移,炎症反应也参与arthrofibrosis[的形成40]。有趣的是,STAT1作为转录因子在调节促炎和抗炎反应,使STAT1一个有吸引力的目标(抗炎41]。然而,这些并不以本研究。我们会进一步地精炼这些探索在未来的研究。我们期待着更全面、深入的研究和应用。
5。结论
总之,本研究首先证实干扰素-α2 b可以减少surgery-induced arthrofibrosis通过抑制成纤维细胞增殖和迁移,这可能与p21 STAT1 /信号通路的调控。我们的研究提供了一种新的治疗干预arthrofibrosis目标。
缩写
| STAT1: | 信号传感器和转录激活1 |
| αsma: | α光滑的肌肉肌动蛋白 |
| ECM: | 细胞外基质 |
| PCNA: | 增殖细胞核抗原 |
| 度: | 差异表达基因 |
| 干扰素-α2 b: | Interferon-alpha-2b |
| PPI: | 蛋白质相互作用 |
| 他: | Hematoxylin-eosin。 |
数据可用性
数据集支持本文的结论包括在本文中。
伦理批准
本实验研究伦理委员会批准的江苏省苏北人民医院和研究委员会。动物实验是扬州大学动物伦理委员会批准,所有的老鼠接受人道主义关怀。
的利益冲突
我们声明我们没有金融和个人关系与他人或组织不当会影响我们的工作;没有专业或其他任何性质的个人利益或在任何产品,服务,和/或公司可能被视为影响的位置,或审查,手稿。
作者的贡献
Zhendong刘和Zhehao风扇同样导致了纸。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(批准号81772332),江苏省医学创新团队(批准号CXTDB2017004),江苏省研究生研究和创新计划(扬州大学,KYCX21_3285)、山东省中医药科技项目(m - 2022113)。我们展示伟大的感谢我们所有的老师的慷慨的帮助。