文摘gydF4y2Ba

气道和肺部的炎症可以触发upregulation环氧酶2 (COX)和前列腺素EgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)各种促炎的因素引起的。cox - 2诱导由凝血酶已被证明在各种炎症发挥至关重要的作用。然而,在人类气管平滑肌细胞(HTSMCs),凝血酶是如何增强cox - 2 /铂族元素的水平gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba不完全的特征。因此,在这项研究中,cox - 2表达和铂族元素的水平gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba凝血酶引起的合成是由免疫印迹,promoter-reporter试验,实时聚合酶链反应和酶联免疫试剂盒。中涉及的各种信号组件thrombin-mediated反应被转染分化siRNAs和选择性药理抑制剂。NF -的作用gydF4y2BaκgydF4y2BaB是由染色质免疫沉淀反应评估(芯片)测定,immunofluorescent染色以及免疫印迹。我们的结果证实,凝血酶明显引发了铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过cox - 2分泌upregulation由凝血酶的抑制剂减少(PPACK) PAR1 (SCH79797), GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}蛋白质(GPA2), GgydF4y2Ba_问gydF4y2BaPKC蛋白(GPA2A)gydF4y2BaαgydF4y2Ba(Go6976), p38 MAPK (SB202190) JNK1/2 (SP600125) MEK1/2 (U0126),或NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB (helenalin)和转染核PAR1, GgydF4y2Ba_问gydF4y2BaαgydF4y2BaGgydF4y2Ba_我gydF4y2BaαgydF4y2Ba,PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba,p38 JNK2第42页或p65。此外,凝血酶诱导PAR1-dependent PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba在HTSMCs磷酸化。我们也观察到,凝血酶诱导p38 MAPK, JNK1/2,第42页/ p44 MAPK通过PAR1 / PKC激活gydF4y2BaαgydF4y2Ba途径。凝血酶促进了NF -的磷酸化gydF4y2BaκgydF4y2BaB p65,导致核易位和绑定到cox - 2启动子元素来增强启动子活动,减少Go6976, SP600125, SB202190或U0126。这些发现支持,cox - 2 /铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba表达式由凝血酶参与PAR1 / GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba或GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}/ PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba/ MAPK-dependent NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB在HTSMCs激活。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

气管平滑肌收缩调节通风作为end-response效应的差异对炎性介质、外源性物质释放,和各种神经递质在病理或稳态条件下(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。在哮喘患者的气道,oversecretion lysophosphatidic代谢物的酸和花生四烯酸(AA)被发现(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。AA进一步代谢环氧合酶(COX),如诱导COX - 2和本构COX-1,前列腺素(后卫)(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。在基础条件下,cox - 2是被严格限制,但,作为一个中介的炎症反应,迅速引起的各种刺激(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。此外,cox - 2活动的增加可以提高铂族元素的合成gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在不同类型的细胞(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。这些研究表明,cox - 2 /铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba对气道炎症至关重要。gydF4y2Ba

凝血酶主要负责凝固在最广泛的研究。凝血酶是维持体内平衡和调节凝血级联。此外,它已显示只有在具有多效性的影响gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究:它显示了一个内皮细胞和平滑肌细胞促有丝分裂的活动,在炎症过程中发挥作用gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。种行动由凝血酶细胞通过一种protease-activated受体介导(PARs)耦合到各种g (gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。有四个家庭成员恢复,PAR-1 4。凝血酶可以调节呼吸系统疾病(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。除此之外,几项研究也显示,cox - 2可能产生的凝血酶在人类肺成纤维细胞(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)或主要人类心房纤维母细胞(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。然而,在人类气管平滑肌细胞(HTSMCs) thrombin-mediated cox - 2的表达的详细机制并不完全认可。因此,澄清cox - 2是如何由凝血酶的机制可能有助于肺部疾病的治疗方法。gydF4y2Ba

在慢性阻塞性肺病、哮喘等慢性呼吸道疾病的一个重要中间体是PKC信号。PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba与粘液生产、支气管的痉挛、气道炎症(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。MAPKs也基本由生长因子信号组件,机械和化学刺激,神经递质,以及细胞因子(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在航空公司,导致两个急性和慢性反应这几个信号调节收缩反应和结构重建,分别为(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。凝血酶也已被证明能够激活JNK1/2 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),第42页/ p44 MAPK [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba],和p38 MAPK [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba在各种类型的细胞。然而,这些信号可以由凝血酶激活,是否参与cox - 2的表达导致铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba释放在HTSMCs仍然不明。cox - 2启动子具有多种转录因子绑定元素,包括NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB和AP-1 [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB显示主监管机构在进化的阶段和炎症的决议gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba];因此,它被认为是一个天才调节器的炎症反应。NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB激活可以增强通过多种信号通路,比如PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]或MAPKs [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。因此,在这项研究中,我们还与凝血酶分析挑战HTSMCs NF -的功能gydF4y2BaκgydF4y2BaB cox - 2的表达。gydF4y2Ba

这项研究是进行研究的影响凝血酶对cox - 2的表达导致铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在HTSMCs发布。这些数据表明,cox - 2表达的upregulation与铂族元素有关gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在thrombin-stimulated HTSMCs通过PAR1 / G介导gydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}或GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba/ PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba/ MAPK-dependent NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba激活途径。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。材料gydF4y2Ba

Anti-phospho-JNK1/2, anti-phospho-p38 MAPK anti-phospho-p42 / p44 MAPK,和anti-phospho-p65抗体被命令从细胞信号(丹弗斯,MA)。Anti-lamin A anti-COX-2 anti-PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba、anti-GAPDH anti-GsgydF4y2BaαgydF4y2Ba,anti-GigydF4y2BaαgydF4y2Ba,反gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白、anti-p42 anti-p38、anti-JNK2 anti-p65抗体被命令从圣克鲁斯(圣克鲁斯,CA)。SP600125 Tanshinone活动花絮,GP antagonist-2A (GPA2A) PPACK, SCH79797, ns - 398 GP antagonist-2 (GPA2) Go6976, SB202190, U0126, helenalin,塞来昔布从Biomol购买(普利茅斯会议上,PA)。sds - page供应从MDBio Inc .(台北,台湾)。其他化学物质、酶、凝血酶(BRENDA: EC3.4.21.5,从牛血浆,目录号码T4648)是获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。gydF4y2Ba

2.2。细胞培养gydF4y2Ba

HTSMCs从ScienCell购买研究实验室隔绝人类气管(CA)圣地亚哥和生长,如前所述[gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。使用细胞系的协议符合批准,长庚大学制度动物保健和使用委员会(批准文件。问16 - 046)。细胞通道4到8在本研究被用于实验。XTT分析工具是用来确定的细胞毒性效应DMSO浓度的抑制剂用于研究这些细胞。gydF4y2Ba

2.3。免疫印迹分析gydF4y2Ba

HTSMCs培养到6-well板块转移到血清DMEM / F-12中过夜,然后用凝血酶刺激为指定的时间点37°C。全细胞溶解产物是由离心法在45000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 10分钟,如前所述,一些修改(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。变性样本被sds - page分离运行凝胶(10%)。电泳后,被转移到蛋白质硝化纤维膜。确定水平的蛋白表达,各自主要抗体与ttb稀释缓冲1:1000年,在4°C膜和孵化24 h,然后,辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:1000)1 h。ECL试剂采用检查免疫反应性的乐队。免疫印迹的图像检测使用UVP BioSpectrum 500成像系统(高地,CA)。免疫印迹的密度被UN-SCAN-IT凝胶扫描和分析软件(奥瑞姆,UT)。gydF4y2Ba

2.4。测量荧光素酶启动子cox - 2的活性gydF4y2Ba

区域横跨-459 + 9 bp的人类cox - 2启动子克隆成pGL3-basic向量构造COX-2-luc质粒。HTSMCs用凝血酶治疗的细胞溶解产物准备并确定启动子活动的水平使用荧光素酶检测系统(Promega,麦迪逊,WI),如前所述,一些修改(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。gydF4y2BaβgydF4y2Ba加活动被用作确定标准化萤火虫荧光素酶的活动。COX-2-luc质粒是由一个不匹配的突变突变引物。mt-NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB底漆,5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaGGTAGGCTTACTGGGCCCCCAC-3gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba用于生成NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB mt-luci应用调查NF -的作用gydF4y2BaκgydF4y2BaB在cox - 2的表达。gydF4y2Ba

2.5。总RNA提取和实时PCR分析gydF4y2Ba

HTSMCs被转向growth-arrested血清DMEM / F-12介质和孵化与凝血酶时间点表示。使用试剂盒RNA是收获。cox - 2基因表达的水平测量使用TaqMan (GeneDireX®,圣地亚哥,CA)基因表达分析系统与一些修改(如前所述gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。所有实验都使用探针和引物混合操作gydF4y2Bacox - 2gydF4y2Ba和内生gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba控制基因由7500实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。模型2gydF4y2Ba^{(Cttestgene-CtGAPDH)gydF4y2Ba}(Ct =阈值周期)被用来计算目标基因的相对量。放大反应,以下引物被使用:gydF4y2Ba

cox - 2:gydF4y2Ba

正向引物:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaCAAACTGAAATTTGACCCAGAACTAC-3gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba

反向引物:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaACTGTTGATAGTTGTATTTCTGGTCATGA-3gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba

调查:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaAACACCCTCTATCACTGGCATCCCCTTC-3gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba

GAPDH:gydF4y2Ba

正向引物:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaGCCAGCCGAGCCACAT-3gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba

反向引物:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaCTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCC-3gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba

调查:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaCCAAATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba

2.6。测量铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba一代gydF4y2Ba

而达到融合,HTSMCs培养到6-well文化板块是挑战与凝血酶37°C表示时间点。铂族元素的含量gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba释放HTSMCs使用铂族元素进行了分析gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba酶联免疫试剂盒(开曼)。gydF4y2Ba

2.7。rt - pcrgydF4y2Ba

从HTSMCs RNA提取使用试剂盒。各种目标组件是由rt - pcr的表达,如前所述,一些修改(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。互补编码PAR1、PAR2 PAR3,标准杆4杆,和gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白从3到5被放大gydF4y2BaμgydF4y2Bal的cDNA与反应混合物混合使用特定基因的引物。以下引物被申请放大:gydF4y2Ba

βgydF4y2Ba肌动蛋白:gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3gydF4y2Ba(意义)gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3gydF4y2Ba(反义)gydF4y2Ba

PAR1:gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaCAGTTTGGTCTGAATTGTGTCG-3gydF4y2Ba(意义)gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaTGCACGAGCTTATGCTGCTGAC-3gydF4y2Ba(反义)gydF4y2Ba

PAR2:gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaTGGATGAGTTTTCTGCATCTGTCC-3gydF4y2Ba(意义)gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaCGTGATGTTCAGGGCAGGAATG-3gydF4y2Ba(反义)gydF4y2Ba

PAR3:gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaTCCCCTTTTCTGCCTTGGAAG-3gydF4y2Ba(意义)gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaAAACTGTTGCCCACACCAGTCCAC-3gydF4y2Ba(反义)gydF4y2Ba

标准杆4杆:gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaAACCTCTATGGTGCCTACGTGC-3gydF4y2Ba(意义)gydF4y2Ba

5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaCCAAGCCCAGCTAATTTTTG-3gydF4y2Ba(反义)gydF4y2Ba

2.8。瞬时转染与siRNAsgydF4y2Ba

人类siRNAs PAR1 (SASI_Hs01_00240436), GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba(SASI_Hs01_00148142), GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(SASI_Hs01_00187237), PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba(SASI_Hs01_00018815), p38 (SASI_Hs01_00027001) JNK2 (SASI_Hs01_00143828),第42页(SASI_Hs01_00124656) p65 (SASI_Hs01_00171090)和争夺从σ购买(圣路易斯,密苏里州)。根据制造商的指示,Lipofectamine™RNAiMAX试剂与100 nM siRNAs暂时性的转染的细胞,如前所述,一些修改(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。总之,核(100海里)制定了Lipofectamine 2000转染试剂。转染混合物被稀释到900年gydF4y2BaμgydF4y2Bal DMEM / F12培养基和直接添加到细胞培养到6-well盘子。PBS的细胞被洗了,取而代之的是血清DMEM / F-12介质的24 h,然后,用凝血酶治疗。gydF4y2Ba

2.9。染色质免疫沉淀反应试验gydF4y2Ba

检测转录因子NF的绑定gydF4y2BaκgydF4y2BaB与人类cox - 2启动子,染色质免疫沉淀反应(芯片)进行了分析,如前所述[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。溶性染色质免疫沉淀反应使用anti-p65抗体或正常山羊免疫球蛋白G(免疫球蛋白)。免疫沉淀反应洗,筛选了,然后恢复加热一夜之间在65°C DNA。纯化DNA片段分析在1 x TAE 2%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭。gydF4y2Ba

2.10。分离亚细胞分数gydF4y2Ba

“细胞收获,用超声发生器(纽约法明岱尔Misonix Inc .)在输出1.5,5 s和离心机15分钟8000转4°C。颗粒收集作为核分数。上层清液离心机60分钟在14000 rpm在4°C产生浮层(胞质分数)和颗粒(膜部分),如前所述,一些修改(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。”

2.11。统计分析的数据gydF4y2Ba

数据统计分析使用GraphPad棱镜程序6.0软件(GraphPad,圣地亚哥,CA),如前所述[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。“我们用单向方差分析Dunnett紧随其后的事后考验当比较两组以上的数据或非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验,其次是邓恩的事后考验,事后测试只有在没有方差的同质性和重要性gydF4y2Ba实现gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba 0.05被认为是具有统计学意义的价值观。所有的数据都表示为gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba至少三个不同的实验(gydF4y2Ba=数量的独立的细胞培养的准备)。”gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。凝血酶诱导cox - 2表达和铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过PAR1释放gydF4y2Ba

首先,在HTSMCs,我们检查了cox - 2由凝血酶的水平。图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba表明凝血酶调节蛋白水平的cox - 2依赖于其浓度和培养时间。此外,的数量gydF4y2Bacox - 2gydF4y2BamRNA表达是由凝血酶时间增强(3 U /毫升)的时间间隔。数据在图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba表明,凝血酶时间的表达增加gydF4y2Bacox - 2gydF4y2Ba信使rna达到最大水平4 h HTSMCs孵化期间。此外,3 U /毫升凝血酶时间增强启动子cox - 2的活性最高的活动4 h(图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba由cox - 2转换从AA可以应用作为一个指示器的cox - 2的活性。此外,在这项研究中,我们的研究结果表明,凝血酶时间产生了铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在8 h分泌达到最大数量,减少的cox - 2抑制剂(ns - 398和塞来昔布(图)gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba)。凝血酶激活PARs导致细胞功能的变化对各种类型的细胞。凝血酶可以直接触发PAR1 PAR3,标准杆4杆,但不是PAR2由胰蛋白酶激活(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。事实上,我们的研究结果表明,PAR1-3表示在HTSMCs(图gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba)。因此,我们推测,凝血酶可以调节通过PAR-1或3加强cox - 2 upregulation伴随着铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在HTSMCs发布。在这里,我们发现,预处理PPACK(不可逆转的凝血酶抑制剂)或SCH79797(选择性PAR1拮抗剂)显著降低thrombin-induced推广活动和cox - 2(图的mRNA水平gydF4y2Ba1 (f)gydF4y2Ba)。我们另外PAR1 siRNA适用于验证的功能PAR1 cox - 2蛋白的水平由凝血酶刺激。PAR1蛋白质水平和cox - 2的表达由凝血酶刺激减少HTSMCs转染PAR1 siRNA(图gydF4y2Ba1 (g)gydF4y2Ba)。总之,这些发现在HTSMCs建议PAR1参与thrombin-provoked cox - 2 /铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Baupregulation。gydF4y2Ba

3.2。凝血酶提高通过G cox - 2的表达gydF4y2Ba_问gydF4y2Ba和GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}Protein-Coupled受体gydF4y2Ba

帕尔斯是GPCRs的亚科。我们更多的检查是否GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}或GgydF4y2Ba_问gydF4y2Baprotein-coupled受体参与凝血酶引起的cox - 2表达。图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba表明,预处理HTSMCs GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}蛋白拮抗剂(GPA2)或GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba蛋白拮抗剂(GPA2A)抑制cox - 2的表达由凝血酶生成的。此外,GPA2或GPA2A预处理也减少了cox - 2 mRNA水平和推广活动刺激凝血酶(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。G的影响gydF4y2Ba_问gydF4y2Ba和GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}在thrombin-stimulated cox - 2 upregulation进一步确定了GgydF4y2Ba_我gydF4y2BaαgydF4y2Ba或GgydF4y2Ba_问gydF4y2BaαgydF4y2Ba核。在这个实验中,转染与GgydF4y2Ba_我gydF4y2BaαgydF4y2Ba或GgydF4y2Ba_问gydF4y2BaαgydF4y2BasiRNA撞倒了GgydF4y2Ba_我gydF4y2BaαgydF4y2Ba或GgydF4y2Ba_问gydF4y2BaαgydF4y2Ba蛋白表达,然后明显thrombin-enhanced cox - 2蛋白水平降低(图gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba)。此外,与这两个siRNAs转染也降低了铂族元素的释放gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba凝血酶引起的(图gydF4y2Ba2 (d)gydF4y2Ba)。总之,这些研究结果支持,GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba或GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}protein-coupled受体调节thrombin-induced cox - 2的表达和分泌/铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在HTSMCs。gydF4y2Ba

3.3。凝血酶调节通过PKC cox - 2的表达gydF4y2BaαgydF4y2Ba激活gydF4y2Ba

以前的报告表明,在A549细胞,凝血酶增强PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba活动导致蛋白表达(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。在我们最近的报告中,PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba也表示,上调cox - 2诱导(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。因此,我们假设PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba不得从事的cox - 2表达HTSMCs由凝血酶引起的。图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba表明,预处理HTSMCs PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba抑制剂Go6976 cox - 2表达显著减少由凝血酶。此外,如图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba,Go6976也废除了mRNA水平和cox - 2由凝血酶诱导的启动子活动。为了进一步验证PKCgydF4y2BaαgydF4y2Bathrombin-mediated cox - 2表达的基本功能,PKC的水平吗gydF4y2BaαgydF4y2Ba蛋白质是撞倒了转染的核的蛋白质含量也显著降低thrombin-enhanced cox - 2(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba)。此外,PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba核转染也抑制了thrombin-induced铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分泌(图gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba)。除此之外,我们的发现证明了凝血酶诱导的胞质PKC易位gydF4y2BaαgydF4y2Ba成膜时间的方式(图gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba),它被SCH79797、GPA2 GPA2A或Go6976(图gydF4y2Ba3 (f)gydF4y2Ba)。总之,这些发现表明PAR1 / GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba或GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}端依赖PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba激活介导cox - 2 upregulation导致铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在HTSMCs合成凝血酶引起的。gydF4y2Ba

3.4。凝血酶调节通过激活MAPKs cox - 2的表达gydF4y2Ba

凝血酶被证明激活p38 MAPK [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba],JNK1/2 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba],第42页/ p44 MAPK [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba在各种类型的细胞。此外,MAPK activation-mediated cox - 2诱导验证(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。因此,我们假设MAPKs参加thrombin-induced upregulation cox - 2。图gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba表明,预处理HTSMCs p38 MAPK的抑制剂(SB202190) MEK1/2 (U0126),或JNK1/2 (SP600125) concentration-dependently抑制HTSMCs thrombin-induced cox - 2的表达。此外,作为显示在图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba,这些抑制剂也减少了的信使rna表达水平和cox - 2由凝血酶诱导的启动子活动。进一步确保MAPKs thrombin-mediated反应中的关键角色,HTSMCs转染JNK2,页,或小干扰rna撞倒了JNK2 p38,页,或p38蛋白表达,分别,然后明显抑制thrombin-enhanced cox - 2蛋白的水平(图gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba)。此外,我们的研究结果表明,凝血酶时间增强JNK1/2磷酸化,p38 MAPK,和第42页/ p44 MAPK在HTSMCs,减少SP600125, SB202190, U0126,单独(图gydF4y2Ba4 (d)gydF4y2Ba)。通过验证,PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba能刺激激活MAPKs在许多类型的细胞(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。因此,我们调查了MAPKs和PKC之间的关系gydF4y2BaαgydF4y2Ba在HTSMCs激活凝血酶。在这里,我们表明,Go6976预处理明显减毒thrombin-induced p38 MAPK的磷酸化,JNK1/2,第42页/ p44 MAPK在HTSMCs(图gydF4y2Ba4 (d)gydF4y2Ba)。这些发现暗示thrombin-stimulated反应,PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba是MAPKs的上游信号。最后,预处理与这三种抑制剂HTSMCs MAPKs也抑制了thrombin-induced铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba释放(图gydF4y2Ba4 (e)gydF4y2Ba)。,这些发现表明,MAPK激活调节cox - 2 upregulation与铂族元素有关gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在HTSMCs暴露于凝血酶。gydF4y2Ba

3.5。凝血酶诱导通过NF - cox - 2的表达gydF4y2BaκgydF4y2BaBgydF4y2Ba

拜会等人指出,在原始264.7细胞,genipin-enhanced cox - 2蛋白表达是受NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB (gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。因此,我们假设NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB参与thrombin-induced cox - 2的表达。图gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba与helenalin HTSMCs表明,预处理细胞(NF -的抑制剂gydF4y2BaκgydF4y2BaB)浓度依赖性thrombin-stimulated cox - 2蛋白表达减少。此外,抑制NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB通过helenalin还压抑,凝血酶诱导的信使rna表达水平和推广活动的cox - 2(图gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba铂族元素)以及分泌gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba5 (c)gydF4y2Ba)。确定NF -的重要功能gydF4y2BaκgydF4y2BaB在凝血酶引起的cox - 2表达,p65蛋白被击倒的水平与p65 siRNA转染的细胞,抑制cox - 2表达的蛋白质水平的由凝血酶(图gydF4y2Ba5 (d)gydF4y2Ba)。除此之外,在HTSMCs,我们表明转染point-mutated NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba显著的减毒B-COX-2启动cox - 2的活性由凝血酶刺激(图gydF4y2Ba5 (e)gydF4y2Ba)。此外,我们注意到,凝血酶时间提升核易位的胞质NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB p65和NF -逐步推广活动增加gydF4y2BaκgydF4y2BaB,达到最大反应在4 h(数字gydF4y2Ba5 (f)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 (g)gydF4y2Ba)。我们进一步研究了凝血酶能否诱导的磷酸化NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB在HTSMCs p65。我们的研究结果表明,凝血酶时间诱导NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB p65激活最大反应10分钟内,由helenalin废除(图gydF4y2Ba5 (h)gydF4y2Ba)。此外,我们的实验采用芯片分析来验证是否凝血酶刺激NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB加入了启动子的cox - 2 upregulation cox - 2是一个重要的一步。图gydF4y2Ba5(我)gydF4y2Ba表明,凝血酶时间招募p65 cox - 2启动子结合使用最大绑定15 - 30分钟内反应。总之,这些发现表明NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB-dependent通路调节cox - 2表达伴随着铂族元素的水平gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产HTSMCs凝血酶引起的。gydF4y2Ba

3.6。凝血酶诱导激活NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba通过PAR1 B / PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba/ MAPK通路gydF4y2Ba

各种各样的信号分量,PI3K / Akt (gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba],MAPKs [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),已被证明刺激NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB的活动。在HTSMCs中,我们研究了NF -之间的关系gydF4y2BaκgydF4y2BaB, PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba,MAPKs对凝血酶的反应。首先,我们发现粗加工HTSMCs helenalin, U0126, SB202190或SP600125明显阻塞thrombin-stimulated胞质NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB p65易位到细胞核,由immunofluorescent染色(图检查gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba)。此外,NF - thrombin-stimulated子活动gydF4y2BaκgydF4y2BaB和p65绑定能力与cox - 2的启动子被Go6976阻碍,SB202190, SP600125或U0126(数字gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6 (c)gydF4y2Ba)。最后,我们的数据表明,thrombin-induced磷酸化的NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB p65被SB202190阻碍、SP600125或U0126(图gydF4y2Ba6 (d)gydF4y2Ba)。因此,我们建议thrombin-stimulated NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaPAR1 / G B激活规范gydF4y2Ba_问gydF4y2Ba或GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}/ PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba/在HTSMCs MAPKs通路。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

Thrombin-triggered反应细胞主要是由受体帕尔斯的家庭,尽管少数例外已经观察到(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。一项研究表明,通过PAR1[凝血酶能促进气道重塑gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。免疫反应性的帕尔斯已经证明在各种类型的细胞呼吸气道。PAR激活已被证明刺激细胞有丝分裂发生和引起组织炎症gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。内源性铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba已经发现了能够调节和维护自发豚鼠气管的语气通过收缩受体的激活EP1和松弛剂受体EP2 [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。因此,铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba可以通过EP2调解bronchodilation和抗炎作用和/或EP4受体(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。相比之下,铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba已经被证明是高水平在慢性阻塞性肺病的肺成纤维细胞与对照组相比。铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba可以诱导成纤维细胞衰老及相关炎症伴有COX-2-dependent生产活性氧和激活p53的gydF4y2Ba在体外和体内gydF4y2Ba(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。此外,铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba也贡献作为调停者proinflammation和血管生成在COPD受试者的航空公司通过interleukin-8表达的增加和血管内皮生长因子(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。先前的研究也支持,高水平的COX-2-synthesized铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba参与气道炎症(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。慢性炎症状态与cox - 2 upregulation肺癌(可能是一个重要的一步gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。因此,COX-2-derived铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba呼吸道炎症的可能是一个至关重要的因素。然而,HTSMCs thrombin-induced cox - 2表达的分子机制并不完全为特征。在这个研究中,我们证实转染核PAR1, GgydF4y2Ba_问gydF4y2BaαgydF4y2BaGgydF4y2Ba_我gydF4y2BaαgydF4y2Ba,PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba,p38 JNK2页,或为特定的基因沉默和p65 PAR1的抑制剂,GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba,PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba,p38 MAPK MEK1/2 JNK1/2、NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB预处理降低cox - 2的水平upregulation与铂族元素有关gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba合成了凝血酶(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。本研究证实,cox - 2的表达是通过PAR1 / G介导的gydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}或GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba/ PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba/ MAPK-dependent NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB在HTSMCs挑战与凝血酶激活。gydF4y2Ba

凝血酶是公认的关键影响体内平衡的维护,这是一种促凝血的丝氨酸蛋白酶,在初始阶段发布相关的血管内凝固组织的损伤。另一方面,凝血酶刺激范围广泛的细胞反应包括许多免疫和炎症反应gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。Asero等人显示更高水平的血浆凝血酶原片段gydF4y2Ba 在哮喘受试者(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba比正常的志愿者,这表明hyperactivation凝血反应能引起生产的促炎细胞因子参与哮喘的病理过程(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。另一份报告也公布了哮喘患者有更高的转化率最大凝血酶原与凝血酶的浓度比对照组高gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在COPD患者中,最大的凝血酶水平高于对照组,凝血酶生成的因素二水平和利率(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。GPCRs构成一个大家庭的受体负责激活细胞内信号转导途径,而外面感觉分子细胞,最终导致细胞反应。凝血酶已经昭然于发挥直接作用于细胞通过激活的部分,一个家庭GPCRs [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。到目前为止,四个亚型称为PAR1-4已确定。先前的研究表明,凝血酶具有很多重要的影响在呼吸系统炎症反应,导致气道中性粒细胞的积累和提高水平的肿瘤坏死因子(TNF)gydF4y2BaαgydF4y2Ba与凝血酶(BAL流体在老鼠挑战gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。此外,凝血酶刺激肺上皮细胞通过PAR1标准杆4杆但不是三杆可以诱导引发的upregulation和分泌,铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,il - 6 (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。因此,凝血酶似乎是一个传统的病原体不同炎性疾病的气道和肺部。事实上,我们发现PAR1-3 HTSMCs细胞膜的存在。在这个研究中,我们证实凝血酶可能诱导cox - 2 upregulation与铂族元素有关gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分泌通过PAR1 / GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}或GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba由使转染验证或初加工HTSMCs各自siRNAs或药理抑制剂。因此,我们建议,这些反应引起的凝血酶/ PAR1 / GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}或GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba可能促进气道炎症。在未来,我们将调查PAR3是否还参与thrombin-induced气道炎症。gydF4y2Ba

PKCs调节多种途径参与细胞应激反应,成长,和死亡。PKCs的亚型分为三类(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。此外,陈等人先前表示,在人类呼吸道上皮(NCI-H292)细胞,肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba移植cox - 2表达伴随着铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过激活PKC释放gydF4y2BaαgydF4y2Ba(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。此外,先前的研究还透露,凝血酶诱导PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba激活,导致epithelial-mesenchymal过渡和胶原蛋白分泌在A549人肺泡上皮细胞(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba参与是揭示了我们的研究结果表明基因沉默或药理PKC抑制剂gydF4y2BaαgydF4y2Ba显著抑制cox - 2的水平upregulation与铂族元素有关gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHTSMCs暴露于凝血酶的分泌。因此,我们的结果在HTSMCs建议upregulation cox - 2与铂族元素相关的gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba由凝血酶分泌通过路径依赖PKC介导的gydF4y2BaαgydF4y2Ba激活。gydF4y2Ba

MAPKs激活信号模块通过各种刺激和至关重要的。MAPKs由三组已被发现是第42页/ p44 MAPK, p38 MAPK和JNK1/2。凝血酶也被披露诱导激活JNK1/2 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),第42页/ p44 MAPK [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba],和p38 MAPK [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba在各种类型的细胞。MAPKs也透露,促进cox - 2表达(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),符合我们的研究结果表明,在HTSMCs,基因沉默和初加工p38 MAPK的抑制剂,JNK1/2,第42页/ p44 MAPK降低cox - 2表达和铂族元素的水平gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba合成凝血酶引起的。因此,我们建议MAPKs起到至关重要的作用在调节cox - 2表达和铂族元素的感应gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba合成HTSMCs凝血酶。MAPK受PKC激活gydF4y2BaαgydF4y2Ba在各种类型的细胞(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。此外,在HTSMCs, PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba抑制可以减少thrombin-induced MAPK磷酸化。因此,我们建立了凝血酶增强cox - 2表达和铂族元素的水平gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba合成通过PAR1 / PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba端依赖MAPK在HTSMCs激活。gydF4y2Ba

先前的研究发现cox - 2启动子包含许多功能激活元素的结合位点,包括AP-1和NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB (gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB在炎症的进化阶段具有传统角色,因此被认为是炎症反应的主要监管机构。各种各样的因素,包括细胞因子、凝血酶化学和物理压力,病毒和细菌感染可以提高NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB激活(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。然而,在HTSMCs, NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB参与thrombin-induced cox - 2表达尚不清楚。我们的研究结果显示,引发的cox - 2表达水平显著地抑制了凝血酶预处理NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba小干扰rna转染B抑制剂helenalin或p65。此外,转染与cox - 2启动子含有NF - point-mutated结合位点gydF4y2BaκgydF4y2BaB和抑制cox - 2启动子活动由凝血酶刺激,表明NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB活性增强是由凝血酶,参与upregulation HTSMCs cox - 2的水平。此外,我们表明,增强凝血酶磷酸化和NF -易位gydF4y2BaκgydF4y2BaB p65 p65 cox - 2启动子,绑定和NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB子活动,由Go6976减轻,SP600125, SB202190或U0126。坚持,我们的结果表明,凝血酶增强的cox - 2表达水平与铂族元素相关联gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过PAR1合成/ PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba/ MAPKs / NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba在HTSMCs B通路。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

在HTSMCs这份报告中,我们构造thrombin-enhanced的cox - 2表达水平与铂族元素有关gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba合成是介导通过PAR1 / GgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba或GgydF4y2Ba_{i / ogydF4y2Ba}/ PKCgydF4y2BaαgydF4y2Ba/ MAPK-dependent NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB激活(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。这份报告提供了新的机制的愿景thrombin-stimulated upregulation cox - 2和铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba释放,导致炎症反应的夸张。更好的理解基因的调控机制gydF4y2Bacox - 2gydF4y2Ba将建立更多的机会发展抗炎治疗肺部炎症的治疗策略。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

AA:gydF4y2Ba	花生四烯酸gydF4y2Ba
BSA:gydF4y2Ba	牛血清白蛋白gydF4y2Ba
芯片:gydF4y2Ba	染色质immuno-precipitationgydF4y2Ba
cox - 2:gydF4y2Ba	Cyclooxygenase-2gydF4y2Ba
DMEM:gydF4y2Ba	杜尔贝科修改鹰的媒介gydF4y2Ba
发射极耦合逻辑:gydF4y2Ba	增强化学发光gydF4y2Ba
ELISA:gydF4y2Ba	酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba
GAPDH:gydF4y2Ba	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶gydF4y2Ba
GPA2:gydF4y2Ba	GP antagonist-2gydF4y2Ba
GPA2A:gydF4y2Ba	GP antagonist-2AgydF4y2Ba
GPCRs:gydF4y2Ba	G-protein-coupled受体gydF4y2Ba
HTSMCs:gydF4y2Ba	人类气管平滑肌细胞gydF4y2Ba
免疫球蛋白:gydF4y2Ba	免疫球蛋白GgydF4y2Ba
物:gydF4y2Ba	c-Jun n端激酶gydF4y2Ba
MAPK:gydF4y2Ba	增殖蛋白激酶gydF4y2Ba
票面价值:gydF4y2Ba	Protease-activated受体gydF4y2Ba
PBS:gydF4y2Ba	磷酸盐gydF4y2Ba
铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:gydF4y2Ba	前列腺素EgydF4y2Ba2gydF4y2Ba
PKC:gydF4y2Ba	蛋白激酶CgydF4y2Ba
sds - page:gydF4y2Ba	十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba
核:gydF4y2Ba	小干扰RNAgydF4y2Ba
Tris-HCl:gydF4y2Ba	三羟甲基甲胺gydF4y2Ba
ttb:gydF4y2Ba	Tween-Tris-buffered盐水。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

CCY、LDH、yf、CKH CYH, c my设计并进行了研究。CCY、LDH、yf、CKH CYH, CYH执行和收集数据。CCY、LDH、yf、CKH CYH, c my分析和解释数据。CCY和c my准备手稿。CCY、LDH、yf、CKH CYH, c my回顾了手稿。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作得到了科技部,台湾(格兰特数字:most109 - 2320 b - 039 - 061和most110 - 2320 - b - 039 - 071);中国医科大学、台湾(批准号:CMU109-MF-09);和长庚医疗研究基金会、台湾(格兰特数字:CMRPG3H0063, CMRPG5J0142、CMRPG5J0143 CMRPG5L0181)。gydF4y2Ba