文摘

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的癌症之一,具有很高的死亡率。虽然预防和治疗肝细胞癌有所改善,但仍面临预后不良,死亡率高。microrna在肝细胞癌的肿瘤发生中扮演重要角色,但潜在的机制并没有被很好的研究。这里,mir - 559之间的功能和交互和PARD3调查在肝癌细胞。增加PARD3和减少mir - 559表达观察肝癌细胞与正常肝细胞相比,特别是在Huh-7细胞。研究进一步表明,PARD3沉默或mir - 559过度受损的扩散,在Huh-7细胞自噬和血管生成。从力学上看,PARD3代表一个mir - 559的目标。此外,调查显示,mir - 559抑制诱导PARD3的表达,从而提高细胞增殖,在Huh-7细胞自噬和血管生成。这些结果揭示了mir - 559之间的交互和PARD3在肝癌细胞和提供新的见解他们作为治疗肝癌治疗的潜在目标。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的一种恶性肿瘤(1]。尽管越来越多的研究关注肝癌,底层对其肿瘤发生和发展机制仍不清楚。由于肿瘤细胞的扩散和转移依赖于血管生成的形成,新血管形成的进步实际上是重要的细胞增殖,入侵和转移在实体肿瘤(2]。目前,大量的药物靶向血管生成已获批准第一线和二线治疗肝细胞癌(3]。

细胞自噬是一个高度管制异化的过程。在正常或压力条件下,自噬参与移除受损的细胞器和细胞内物质的变换来维持体内平衡(4,5]。自噬的调节异常严重的后果和相关的开发和发展各种疾病,如感染性神经退行性和代谢疾病,以及癌症(6]。此外,研究表明,自噬可能参与维持肝细胞癌的发生(7]。肝癌发展的早期阶段,自噬对肿瘤的形成是通过抑制炎症和维持基因组的稳定性。一旦癌症发展,自噬可能充当prosurvival机制保护肝细胞死亡引起的不同类型的刺激,包括氧化应激,从而维持癌症恶化[8]。

microrna的长度很短19-25非编码rna的核苷酸抑制靶基因表达的特别sequence-specific方式绑定到3 - - - - - -UTR区域的目标基因(9]。microrna的表达异常与大多数肿瘤的发展,如肝癌,并参与肿瘤细胞生长的规定,自噬和血管生成10]。mir - 559是一种microrna,它已被证实能参与细胞增殖的抑制作用和入侵在肝癌细胞(11]。PARD3(纬向缺陷3同族体)是一种脚手架蛋白组成的氨基端结构域,一个c端结构域,和三个PDZ结构域(12]。PARD3调节细胞增殖、迁移和入侵在大多数癌症,包括肺癌、膀胱癌(13,14]。PARD3信号有关的同时,激活自噬活动增加和大肠癌细胞增殖15]。发现PARD3在肝细胞癌中,与不良预后相关(16]。然而,其在肝癌中的作用还没有被报道。生物信息学分析显示,PARD3 mir - 559的目标基因。因此,在目前的研究中,进行了一系列的实验调查mir - 559和PARD3对肝癌细胞的影响,以及进一步阐明mir - 559和PARD3之间的关系。

2。材料和方法

2.1。细胞系,细胞培养

肝癌细胞系(snu - 387, Huh-7、HCCLM3 mhcc - 97 h细胞)和正常的人类L02肝细胞行提供的写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞培养在high-glucose DMEM(美国Gibco BRL),补充的胎牛血清(10%,的边后卫)和青霉素和链霉素(1%;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)37°C公司为5%2。

2.2。CCK8化验

细胞生存能力是CCK8试验检测到的。 细胞接种于96孔板6 h。然后,细胞转染si-RNA或microrna的模仿/抑制剂24 h。中被删除,取而代之的是新鲜培养基含有10% CCK8解决方案(Meilunbio;中国)和培养另一个1小时。450纳米的光密度是衡量与标(沃本Biotek, Inc .,妈,美国)。

2.3。细胞转染

si-RNA PARD3, mir - 559模拟或mir - 559缓蚀剂是来自GenePharma(上海,中国)。细胞被播种在6-well盘子50 - 60%和转染si-RNA或microrna的模仿/抑制剂使用RiboFECT™CP转染试剂(Ribobio、广州、中国)按指令。

2.4。rt - pcr分析

试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)被用来提取总RNA按指令。一个Mir-X™microrna存在结核病绿色装备(豆类、日本)和PrimeScript RT试剂盒(豆类)被用于microrna和总RNA逆转录,分别。相对水平mir - 559是U6表达式的规范化。rt - PCR进行使用结核病绿色预混料Taq交货(豆类)StepOne +实时PCR系统(应用生物系统公司、钙、美国)。相对被规范化GAPDH基因水平表达。表中给出的引物序列1。

表1
引物的信息。
2.5。免疫印迹分析

肝癌细胞被收集和处理RIPM细胞溶解缓冲区获得总蛋白。蛋白质浓度测定采用BCA蛋白量化工具(科瑞,武汉,中国)。然后,蛋白质是除以sds - page和转移到PVDF (0.45μ米)膜。接下来,膜浸泡在脱脂牛奶(5%)。阻塞后,这些墨迹被孵化与抗体PARD3(美国帕洛阿尔托BioVision;1:1000),LC3-I / II(细胞信号技术(CST),贝弗利,妈,美国;1:1000),Beclin1 (Absin,上海,中国;1:1000),p62 (Absin, 1: 1000), VEGF (CST, 1: 1000), Ang-2(圣克鲁斯、钙、美国;1:1000)和β肌动蛋白(Absin,1: 1000)在一夜之间在4°C。最后,乐队是孵化一个HRP-conjugated二级抗体(1:2500)(在室温下,1 h)并使用bioimaging量化。使用价值的蛋白质水平β肌动蛋白作为加载控制。

2.6。HUVEC管形成化验

在肿瘤cell-conditioned介质(TCM)制备、稳定转染Huh-7细胞在DMEM培养补充10%的边后卫(37°C, 24 h)。然后,改变了媒介DMEM包含的边后卫(1%)和培养(48小时)。然后,中收集和离心机(600克,5分钟)。中医上层清液分离细胞被移除,然后集中利用微孔3 kDa Centricon列。中医应该立即使用或存储在-20°C,直到能整除的使用。

管形成化验在体外, HUVECs的细胞培养与中医12 h,直到形成管状结构,在37°C 24-well板涂层与基底膜基质。使用光学显微镜捕获管的形成。四个图像得到不重叠的位置和管测量使用ImageJ软件的数量。

2.7。Dual-Luciferase记者分析

建立了野生型和突变体荧光素酶向量的预测结合位点PARD3和mir - 559。然后,细胞cotransfected mir - 559模拟或数控模拟24 h。转染后细胞和细胞溶解,离心收集(10000克,5分钟)。上上层的收集,使用Dual-Luciferase记者的荧光素酶活性检测分析系统(WI Promega公司麦迪逊,美国)。

2.8。目标预测

microrna绑定的预测与PARD3使用TargetScan执行数据库(http://www.targetscan.org/vert_72/)。

2.9。统计分析

数据分析统计使用GraphPad 8.0,表示为 。两组之间的差异被双尾学生的表现 - - - - - -测试或单向方差分析之后,事后Dunnett的测试。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。mir - 559肝癌细胞中表达下调,PARD3调节

mir - 559的表达水平和PARD3检测在肝癌细胞系(Huh-7、HCCLM3 snu - 387和mhcc - 97 h)和正常肝细胞株(L02) rt - pcr检测。如数据所示1(一)和1 (b)明显,mir - 559表达下调,而PARD3显然是在肝癌细胞调节。蛋白表达分析显示一致的结果(图1 (c))。Huh-7细胞系显示最低mir - 559的表达和表达PARD3最高,这是使用在以下研究探索PARD3在肝癌中的作用及其mir - 559之间的相互作用。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
mir - 559表达下调,PARD3调节肝细胞。(一)mir - 559肝癌细胞的表达水平。(b)的mRNA表达PARD3在肝癌细胞。(c) PARD3在肝癌细胞的蛋白质水平。得到的值从三个独立的实验,显示为 。 , ,和 ,相比之下,L02细胞。
3.2。mir - 559超表达或PARD3沉默抑制Huh-7细胞的扩散和自噬

进一步调查mir - 559的影响和PARD3 Huh-7细胞,Huh-7细胞转染mir - 559模拟或si-PARD3,分别。这项研究的结果发表在数字2(一个)和2 (b);mir - 559的mRNA表达和蛋白表达的PARD3分别增加和减少Huh-7细胞转染后mir - 559模拟和si-PARD3,验证成功转染。然后,细胞CCK8试验测定的可行性。超表达mir - 559显著降低细胞的生存能力,和类似的调查发现在细胞si-PARD3(图2 (c))。PARD3过度自噬增强和促进大肠癌的发展15]。LC3-II水平/我被称为autophagosomal标记(17]。据报道,自噬过度LC3-II有助于恶性进展和预测预后不良在肝细胞癌(18]。Beclin1自噬的关键调节器,Beclin1-dependent自噬已被证明是相关的肝细胞癌的发展(17]。作为一种重要的自噬受体P62参与自噬过程。当自噬活动减弱或自噬系统受损,P62蛋白质在细胞质中积累,因此,P62被认为是蛋白质的一个重要标志反映自噬活动(19]。在这项研究中,mir - 559 upregulation下降LC3-II /我的表达和Beclin1 p62的表达增加。PARD3沉默显示了类似的结果(图2 (d))。这些结果表明,mir - 559超表达或可能抑制扩散和自噬在Huh-7差别PARD3对这些细胞。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
mir - 559超表达或PARD3沉默抑制Huh-7细胞的扩散和自噬。Huh-7细胞转染和mir - 559数控/模仿或si-RNA NC / PARD3 24 h。(a)的相对表达mir - 559。(b)的相对PARD3的蛋白表达。(c)细胞的生存能力是CCK8试验检测到的。(d)的相对蛋白质含量LC3-II /我,Beclin1, p62。得到的值从三个独立的实验,显示为 。 # # # ,相对于模拟数控或siRNA-NC。
3.3。mir - 559超表达或抑制PARD3 Huh-7细胞的血管生成减少

增加研究表明,异常血管生成是一个关键的过程在癌症的发展20.]。因此,mir - 559的作用或PARD3评估在Huh-7血管生成细胞利用在体外管形成试验。如图3,HUVECs培养中医从mir - 559模拟或si-PARD3-treated细胞发达少血管生成的能力。研究报道,proangiogenic分子包括VEGF和Ang-2参与癌症发展(21]。结果表明,VEGF的蛋白质含量和Ang-2也显著减少HUVECs培养与中医治疗mir - 559模拟和si-PARD3。总的来说,以上结果表明,过度PARD3可能差别mir - 559或对这些抑制肝癌的进展。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
mir - 559超表达或抑制PARD3 Huh-7细胞的血管生成减少。Huh-7细胞转染和mir - 559数控/模仿或si-RNA NC / PARD3 24 h。(一)在体外HUVEC管形成试验使用条件培养基,在每组管长度的量化。(b)免疫印迹分析蛋白质的表达VEGF和Ang-2。得到的值从三个独立的实验,显示为 。 # # # ,相对于模拟数控或siRNA-NC。
3.4。PARD3 mir - 559的目标基因

进一步探索mir - 559之间的相关性和PARD3 TargetScan软件被用来分析microrna与PARD3之间的交互。七个守恒的结合位点确定mir - 559 3 - - - - - -UTR区域PARD3基因。阐明PARD3是否mir - 559的直接目标,包含3的荧光素酶报告质粒 - - - - - -UTR PARD3成立。如图4,细胞的荧光素酶活性类似cotransfected mir - 559模拟或负控制模拟的变异3 - - - - - -UTR组。然而,相对荧光素酶活性与野生型3 - - - - - -UTR被mir - 559模拟明显下降。这些结果表明,PARD3被mir - 559直接监管。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
PARD3 mir - 559的目标基因。(一)目标预测PARD3和mir - 559之间。(b)荧光素酶记者构造包含野生型或突变mir - 559削减网站PARD3 cotransfected mir - 559模拟或模拟数控成Huh-7细胞。得到的值从三个独立的实验,显示为 。 ,相对于模拟数控。
3.5。PARD3沉默逆转的影响mir - 559 Huh-7细胞抑制剂

进一步验证是否在Huh-7 mir - 559细胞的影响相关的直接监管PARD3, Huh-7细胞接受si-PARD3和mir - 559抑制剂,PARD3的蛋白质水平,细胞生存能力,自噬和血管生成,分别评估。明显抑制mir - 559诱导PARD3 mRNA和蛋白表达,而si-PARD3完全阻止这一现象(数字5(一个)和5 (b))。此外,mir - 559增强细胞增殖,抑制自噬,和血管生成,但是在Huh-7 mir - 559细胞的抑制作用被逆转PARD3沉默(数字5 (c)- - - - - -5 (f))。这些结果表明,mir - 559调节细胞增殖,通过负调节PARD3自噬和血管生成。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图5
PARD3沉默逆转的影响mir - 559 Huh-7细胞抑制剂。Huh-7细胞cotransfected mir - 559抑制剂和si-PARD3 24 h。信使rna (a)和蛋白质(b)的PARD3 Huh-7细胞。(c)使用CCK8试验检测细胞的可行性。(d) LC3-II /我的表达水平,Beclin1, p62免疫印迹试验测定。(e) HUVEC管形成试验提出了使用条件培养基在体外。(f) VEGF的蛋白质含量和Ang-2被Huh-7细胞免疫印迹检测。得到的值从三个独立的实验,显示为 。 , ,和 ,与抑制剂相比,数控;# # 和# # # ,相比之下,mir - 559抑制剂。

4所示。讨论

肝细胞癌是一种常见的类型的肝癌,包括超过90%的原发性恶性肝癌(3]。虽然肝癌已经广泛研究,底层机制对其肿瘤发生和发展仍知之甚少由于其复杂性。近年来,越来越多的证据表明,大多数microrna是发生密切相关,肝细胞癌的转移,预后不良(22]。此外,进步分子机制的探索microrna持有这些分子具有吸引力的承诺目标HCC的诊断和管理(23]。我们的研究发现,mir - 559在各种肝细胞表达下调,而PARD3调节在肝癌细胞(图1)。此外,过度mir - 559或击倒PARD3降低肝癌细胞的增殖(图2 (c))。这些结果表明,mir - 559和PARD3之间的关系可能会参与肝癌细胞的发展。

自噬被认为作为一个肿瘤抑制维持细胞内环境的稳定。然而,肿瘤发生后,自噬可以使肿瘤细胞在肿瘤微环境中生存,促进肿瘤的生长和发展6,24]。因此,阻断自噬可能是肝癌治疗的理想目标。我们的研究结果表明,upregulation mir - 559或PARD3沉默抑制自噬抑制肝癌生长。自噬activation-related蛋白的表达明显下降,如LC3-II /我和Beclin1 [17]。相比之下,自噬inhibition-related蛋白的表达明显增加,如p62 [25)(图2 (d))。

在肝细胞癌血管生成途径是特异表达,暗示的参与血管生成在开发和肝癌的发病机制2]。许多血管生长因子能促进肿瘤血管生成,肿瘤本身可以引起这些血管生长因子的分泌通过各种各样的方式26,27]。特别是,血管内皮生长因子(VEGF)主要调节内皮细胞的生长和存活,加速促进肿瘤血管生成和肿瘤发展自诱导肿瘤休眠细胞恢复细胞周期进程(28]。这项研究显示,过度的mir - 559或PARD3击倒抑制肿瘤血管生成减少VEGF的表达和Ang-2(图3),两个代表性的血管生成因素。

由于microrna的主要功能是抑制靶基因的表达通过干扰他们的转录通过绑定到3 - - - - - -UTR区域目标基因(29日]。结合生物信息学预测和双荧光素报告实验,PARD3被确认为一个目标基因mir - 559(图4)。因此,肝癌细胞的高表达PARD3 mir - 559的差别,对这些有关。与此同时,它表明,mir - 559抑制诱导PARD3的蛋白质含量,而细胞生存能力,在肝癌细胞自噬,血管生成促进了mir - 559抑制。然而,淘汰赛PARD3逆转了这些现象。因此,mir - 559细胞生存的作用,自噬,血管生成可能通过调节PARD3表达式。

总之,这些结果表明,PARD3 mir - 559的目标基因。mir - 559抑制扩散的过度表达,自噬,细胞和肝癌血管生成通过减少PARD3的表达,从而导致肝癌的发展阻力。因此,mir - 559可以作为一种新型的治疗肝癌的目标。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

的利益冲突

作者认为没有利益冲突的披露。

作者的贡献

Chunjing王设计了实验,把它们。成成李分析和解释数据。鲁伊·郝准备手稿的贡献所有的合作者。

确认

这项工作得到了教育部门的吉林省“13日五年科学技术研究计划项目(批准号JJKH20200054KJ)。