文摘
糖尿病(DM)患者的风险增加焦虑。高焦虑水平也显示增加糖尿病患者的压力,这可能会导致糟糕的临床结果。焦虑障碍的机制发展糖尿病患者仍然未知。因此,没有可用的治疗方法。在这里,我们测试的假设在DM小鼠的海马区胶质细胞可能负责他们的焦虑行为。此外,我们假定与抗抑郁治疗,氟西汀,可以减少焦虑失调的行为,防止胶质细胞在DM小鼠(少突细胞和星形胶质细胞)。糖尿病小鼠接种单一注射链脲霉素(STZ),其次是与氟西汀治疗。老鼠然后测试Y迷宫,空旷的田野,黑暗与光明的过渡,提升+迷宫测试测量的状态焦虑和认知。完成这些行为测试之后,老鼠牺牲和免疫印迹被用来检测海马组织的制造商少突细胞与星形胶质细胞相互作用的蛋白质。重点是针对成人少突细胞前体细胞(信息公开化)及其标记蛋白质来衡量其增殖和分化。 We found that fluoxetine could effectively mitigate the level of anxiety and attenuate the cognitive dysfunction in diabetic mice. Meanwhile, fluoxetine inhibited astrocyte activation in mice exposed to STZ, prevented the loss of myelin basic protein (MBP), and affected the function of OPCs in these diabetic mice. The results suggested that the changes of these glial cells in the brains of diabetic mice might be related to the high anxiety levels and cognitive deficit in DM mice. Fluoxetine could ameliorate the high anxiety level and prevent cognitive deficit via inhibiting astrocyte activation and repairing the oligodendrocyte damage.
1。介绍
糖尿病(DM)患者出现焦虑症状往往比没有糖尿病的人(1]。高焦虑水平不仅与不良临床结果和增加患者DM并发症,尤其是老年病人,也极大地影响了DM患者的生活质量(2]。焦虑症状包含过多的担心,易怒和疲劳,在社会功能导致的重大障碍3]。然而,没有特定的障碍在DM患者的治疗策略建立了到目前为止(1]。
氟西汀(FLX)是一组的一部分新一代抗抑郁药被称为选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)。FLX有更好的安全性,因为它被证明是安全有效的老年人口,甚至在怀孕期间(4]。FLX已被广泛用于治疗抑郁症和焦虑症在诊所5]。先前的研究已经暗示FLX可以减轻记忆和认知赤字在动物5]。以前的报告还表明,FLX可以施加有利影响记忆和认知功能在病人患有轻度认知障碍(6]。
最近的研究表明,髓鞘和少突细胞赤字发挥作用在抑郁或焦虑行为的形成7,8]。干预目标化合物髓或者少突细胞可以有效地减轻抑郁和焦虑行为(7,8]。白质减少还发现在中枢神经系统(CNS)患者的情绪障碍8]。同时,患者的慢性脱髓鞘疾病,如多发性硬化症(MS)、证明情绪障碍的风险增加(9]。这些发现暗示髓赤字可能会扮演一个角色发展的焦虑和抑郁样行为。糖尿病已被证明是与髓鞘相关异常等周围神经病变(10]。糖尿病周围神经病变是一种破坏性的并发症在许多DM患者后期(11]。在中枢神经系统中,神经影像研究还发现,DM患者显示代谢物变化的大脑灰质和白质(12]。在这里,我们假设DM小鼠中枢神经系统的神经胶质细胞异常发挥了重要作用的赤字记忆和焦虑行为的形成,但FLX可以有效地减轻这些症状在DM小鼠通过调节星形胶质细胞和少突细胞的功能。
2。材料和方法
2.1。动物和治疗
八周大的雄性小鼠C57BL / 6 j被用于这项研究。老鼠在标准实验动物环境。所有的老鼠能有一周的适应时期之前实验的程序进行。动物协议批准的动物保健委员会青岛市立医院,山东,中国。
本研究中使用的四组老鼠:控制( ),控制+ FLX(5毫克/公斤/天; ),STZ(150毫克/公斤, ),STZ + FLX(5毫克/公斤/天; )。STZ和FLX从Sigma-Aldrich购买(美国密苏里州)和圣克鲁斯生物技术(达拉斯,TX)。STZ制备蒸馏柠檬酸钠溶液的pH值在4.5和FLX溶于无菌水(2毫克/ 100毫升水)。单剂量STZ腹腔内注射的管理导致DM在小鼠模型之前报道(13]。水含有FLX给老鼠注射STZ前的一个星期,一直持续到行为测试的最后一天。行为测试进行注射STZ后3周后。小鼠的体重测量每周两次。我们牺牲了收集到的老鼠和大脑行为测试样品后立即完成。
2.2。空旷的田野
方箱是用于执行开放现场试验与次要的修改(如前所述14]。简单地说,老鼠放在一个角落在测试开始前的空地上。每个鼠标的活动观察中央和周边地区。中心区域的总时间和路程在整个测试进行了分析。
2.3。高+迷宫
高架plus-shaped迷宫(EPM)和两个开放和两个封闭的武器( )被用于实验。迷宫到地面的高度大约是50厘米(升高)。在开始测试之前,我们把小鼠在中心区域面临一个开放的手臂。在测试期间,老鼠被允许探针的高架迷宫5分钟(15]。当鼠标进入武器的四个爪子,被认为是一个有效的条目和记录。每个鼠标的总时间呆在张开双臂和每个老鼠进入总张开双臂的数量在每个测试会话记录进行统计分析。
2.4。黑暗与光明过渡测试
黑暗与光明的过渡进行了测试(如前所述)(16]。设备分为一个光明与黑暗框和这两个箱子之间有一个航天飞机的门。黑盒的墙壁被漆成黑色的可移动的黑色盖子顶部。鼠标放在黑盒的盖子覆盖和航天飞机的门是关闭的。1分钟后,航天飞机的门被打开,允许鼠标自由进入灯箱。我们计算第一延迟鼠标进入灯箱以及数字两个盒子之间的转换。测试的时间是5分钟。
2.5。Y迷宫
Y迷宫自发交替测试是一种行为测试调查的意愿老鼠探测新环境。3武器不同的设备由一个120°的中心点。过程进行了与之前报道的轻微改变(5]。每个鼠标最初把最后一只胳膊的面对所有,允许调查Y迷宫在八分钟测试会话。序列进入武器和总数量的条目8分钟期间都被记录下来。交替的百分比表示为连续三胞胎包含条目的数量在会话期间这三个武器占最大的比例可能的变更 。
2.6。免疫印迹
大脑海马提取的样本由与sds - page凝胶电泳。然后,样本的蛋白质转移到硝化纤维膜。我们阻止了上面的膜有5%脱脂牛奶溶解在TBST缓冲区,然后孵化与主抗体膜感兴趣的蛋白质,包括抗体胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(美国马密理博公司),抗体血小板源生长因子受体(PDGFRα)(圣克鲁斯生物技术),anti-2 ,3 - - - - - -环核苷酸3 - - - - - -磷酸二酯酶(CNPase)(美国马密理博公司)和髓鞘碱性蛋白(MBP,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)在4°C的过夜。后洗3次,上面的膜与相应的二次孵化抗体室温下2小时。我们可视化带膜的化学发光反应(美国新泽西州Amersham生物科学)。GAPDH(英国Abcam)或β肌动蛋白(英国Abcam)抗体被用来检测这些管家基因的蛋白表达和视为加载控制。每个蛋白质的结果表示为一个比率为内部控制的蛋白质。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA试剂盒(eBioscience热费希尔科学)被用于调查大脑组织中il - 6水平根据制造商手册。样本加载到板井一式两份,两个值的平均值用于最后的分析。il - 6的最终价值的统计数据被表示为一个比平均水平相比总装载蛋白质。
2.8。统计分析
在这项研究中被表示为值 。显著差异是用单向方差分析,定义Newman-Keuls紧随其后事后测试。我们认为是值小于0.05的统计学意义。
3所示。结果
3.1。FLX改善了工作记忆的DM小鼠Y迷宫测试性能
据说DM小鼠显示巨大的赤字在记忆和认知功能障碍(17]。因此,我们评估了FLX影响工作记忆的DM小鼠Y迷宫测试执行。DM小鼠对自发交替施加显著下降(图1(一)),这表明工作记忆的赤字。然而,FLX可以有效防止DM小鼠(图的记忆丧失1(一))( ,STZ组与对照组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ;单向方差分析)。此外,我们的研究结果还表明,组间无显著差异存在于整个手臂条目(图1 (b)),涉及不同群体之间的交替并不是由于老鼠的流动性的变化。
(一)
(b)
3.2。FLX减毒的焦虑行为DM小鼠
接下来,我们测量了这些DM小鼠和焦虑行为调查FLX是否能减弱这些异常行为。这里采用大田试验测量小鼠焦虑的水平。在这项研究中,总旅行距离和总时间花在每个鼠标的中心记录的分析(图2)。我们发现DM小鼠旅行距离和少花更少的时间在中央区域的开放领域。有趣的是,老鼠在FLX治疗显示,距离明显更好的性能( ,STZ组与对照组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ;单向方差分析中心()和时间 STZ组与对照组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ;单向方差分析)。我们也用EPM测试这些DM小鼠的焦虑水平。如图3(一个),FLX有效地增加了时间张开双臂的DM小鼠EPM的测试,这意味着FLX改善焦虑行为的EPM测试( ,STZ组与对照组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ;单向方差分析)。这些影响是通过以下参数如图进一步验证3 (b)FLX的总数增加进入张开双臂在DM小鼠( ,STZ组与对照组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ;单向方差分析)。最后,介绍了光明与黑暗的过渡测试进一步证实FLX的影响的焦虑行为这些DM小鼠。与上面的结果一致,FLX预防减少时间的灯箱DM小鼠(图4(一))( ,STZ组与对照组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ;单向方差分析)。同时,FLX的延迟降低DM期间首次进入灯箱测试(图4 (b))( ,STZ组与对照组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ;单向方差分析)。集体,以上研究结果在这些测试可能暗示FLX的有效复合减弱DM小鼠焦虑表演和记忆丧失。
(一)
(b)
(一)
(b)
(一)
(b)
3.3。FLX减少GFAP和il - 6的水平,但增加了MBP, PDGFRα,CNPase DM小鼠的蛋白质含量
接下来,我们探讨了可能的潜在机制FLX保护DM小鼠记忆丧失和焦虑行为的形成。测试是否激活星形胶质细胞参与了小鼠暴露于STZ FLX的规定,免疫印迹检测GFAP首先使用抗体,这是一个常见的星形胶质细胞激活蛋白生产商。如图5(一个),GFAP的表达水平增加STZ-induced DM小鼠,这可能是阻止cotreatment FLX的。与此同时,我们发现,il - 6水平明显调节大脑中样本STZ老鼠但可以被FLX治疗(图5 (e))( ,STZ组与对照组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ;单向方差分析)。这两个结果建议FLX可以改善星形胶质细胞的激活大脑中暴露于STZ。其次,我们调查是否STZ引起髓鞘损伤DM小鼠的海马区域通过检测MBP表达水平。我们发现有显著的减少了MBP的表达水平在DM小鼠但FLX可以改善MBP损失(图5 (b))。第三,我们问FLX是否影响成人信息公开化,通常环绕的病变区域髓和髓鞘修复期间扮演重要角色在许多病理场景中(8,18]。我们专注于两个蛋白质,CNPase和PDGFRα。CNPase的开发过程中是一个重要的蛋白质寡树突胶质细胞成为myelin-forming细胞(19]。PDGFRα是其中的一个功能蛋白质标记信息公开化的20.]。如数据所示5 (c)和5 (d),导致PDGFR显著降低STZ治疗α( ,STZ组与对照组相比, ;单向方差分析)和CNPase ( ,STZ组与对照组相比, ;单向方差分析)表达但FLX预防这两种蛋白质的蛋白质损失,分别为( ,STZ + FLX组仅STZ组相比, ; ,STZ + FLX组仅STZ组相比, )。我们的研究结果表明,FLX可能改善DM小鼠的行为性能通过抑制神经胶质细胞的激活和保护髓鞘和OPC损失DM小鼠的海马区。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
最近的发现支持,大脑是糖尿病并发症的共同目标之一(21]。抑郁等情绪障碍的可能性DM患者比非糖尿病患者的两倍(22]。此外,DM cooccurring患者焦虑的风险增加死亡率(23]。焦虑密切相关的失调-肾上腺轴(HPA),它可以引发胰岛素抵抗[24,25]。因此,焦虑或其他情绪障碍可能是一个因素通过生物DM和行为举止。到目前为止,没有特定的化合物可用临床治疗DM患者的焦虑或抑郁。在这里,我们使用STZ-induced DM小鼠模型研究FLX能否有效地防止焦虑行为的形成和内存赤字DM小鼠。我们发现DM小鼠表现出明显的焦虑表现在一系列的行为测试。这里的结果是一致的与来自其他组织的报道26,27]。更重要的是,我们的结果还透露,FLX治疗可以减轻这些异常行为表现。在Y迷宫测试,STZ诱导显著减少自发交替但可以逆转FLX治疗(图1)。这些结果表明FLX不仅可以防止DM患者焦虑行为的形成也起到保护作用对记忆和认知赤字。
星形胶质细胞活化据报道发现在DM小鼠的大脑27]。在这里,我们发现星形胶质细胞激活制造商蛋白质,GFAP,特别是调节在蛋白质水平(图5(一个)),这表明DM小鼠中枢神经系统的神经炎症反应。有趣的是,GFAP的增加抑制了FLX cotreatment。同时,老鼠大脑中的il - 6水平增加,但可以抑制FLX治疗。这些结果与以前的报告相符,FLX可以抑制星形胶质细胞的激活在阿尔茨海默病动物模型(28]。然后,我们探索FLX的有利影响少突细胞通过检测髓磷脂蛋白,MBP。我们发现有一个改善MBP蛋白表达伴随着GFAP的抑制(图5 (b))。这些研究结果提醒我们看看另一种神经胶质细胞,少突细胞。成人OPC增殖和分化是髓鞘再生的关键特性29日]。信息公开化的两个重要标志蛋白与免疫印迹进行调查研究。我们发现STZ PDGFR表达降低引起的α由FLX CNPase,可以逆转(数字5 (c)和5 (d))。这些结果表明FLX还可以调节成人信息公开化的海马区DM小鼠和改善他们的行为表现。
神经行为DM患者的并发症是一个不断上升的问题,需要研究关注自损害神经系统有重大影响的医疗成本和DM患者的生活质量。根据我们迄今已知的知识,有更少的努力基础设置关于这个问题。我们的研究提供了证据,焦虑和记忆丧失是DM小鼠的神经病理变化的重要组成部分。结果是符合以前的报告,焦虑行为可能发展与STZ暴露在老鼠身上30.]。FLX也许是个不错的候选人来处理这些障碍的DM患者通过衰减星形胶质细胞的激活和拯救在中枢神经系统髓鞘赤字。同时,有益也可能造成的直接抗炎作用因为FLX已经被证明能够抑制星形胶质细胞的炎症反应(28]。进一步的研究涉及其他炎症细胞在中枢神经系统中,像小胶质细胞,需要精心的细节在STZ-induced DM小鼠细胞反应。
5。结论
本研究的主要发现是,FLX能够发挥其预防效果在DM小鼠记忆丧失和焦虑行为。FLX的有益效应可能是由于其调节激活星形胶质细胞和少突细胞功能障碍在糖尿病小鼠的中枢神经系统。FLX能否提供有利于患者DM认股权证在临床进一步调查。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
不存在任何利益冲突的所有作者在本研究中。
确认
作者感谢资金支持的普通外科,青岛市立医院,青岛,山东,中国,从青岛大学医学院的技术支持。