文摘

Methyltransferase-like 3 (METTL3), RNA N6-methyladenosine (m6甲基转移酶,对m至关重要6一个信使rna修改。作为一个关键酶m6甲基化修饰,METTL3已经涉及到免疫和炎症调节。然而,鲜为人知的作用和基本机制METTL3在类风湿性关节炎(RA)。本研究的目的是阐明功能和METTL3在RA发病机制的潜在机制。我们使用定量实时聚合酶链反应检测METTL3在RA患者的表达和控制以及巨噬细胞细胞系。CCK-8用于细胞增殖试验。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)估计代il - 6和TNF -α在巨噬细胞。免疫印迹和免疫荧光评估NF -的激活κ在巨噬细胞。的表达METTL3在RA患者显著升高。它与c反应蛋白和ESR呈正相关,RA疾病活动的两个常见的标记。此外,有限合伙人可以提高METTL3表达和生物活性的巨噬细胞,而过度METTL3显著减毒在巨噬细胞对LPS诱导的炎症反应。此外,METTL3 LPS-induced炎症在巨噬细胞的影响依赖于NF -κb .本研究首先演示了METTL3在RA的至关重要的作用,它提供了新颖的见解认识风湿性关节炎的发病机理和RA的有前途的生物标志物。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病和慢性加倍的关节破坏,这是一种高致残疾病,因为关节畸形和损失函数(1]。关节炎症可引起发红、肿胀、疼痛和关节畸形(2]。风湿性关节炎的病因仍不太为人所知。完善,风湿性关节炎的发展是由于遗传和环境因素,如吸烟(3]。除了这些之外,肥胖、压力、紧张抑郁,和雌性激素在RA的发病机制(扮演重要角色3]。许多研究表明,免疫系统的失调,包括异常激活和T和B淋巴细胞,肥大细胞,巨噬细胞,是与类风湿性关节炎的发展密切相关4]。高水平的自身抗体产生的B细胞特异表达会导致肺损伤,如anticitrullinated蛋白抗体(5,6]。炎症细胞炎症网站可以吸引和招募的刺激下相当大的介质从巨噬细胞和肥大细胞。因此,持续慢性炎症导致关节损伤和畸形(1]。因此,至关重要的是识别小说和有前途的生物标志物风湿性关节炎的早期诊断和靶向治疗的病人。

在过去的几年中,N的角色6-methyladenosine (m6)RNA的甲基化在自身免疫、炎症和癌症引起密切关注(7- - - - - -10]。米6是最常见的posttranscription修改RNA (11]。的关键酶6甲基化修饰主要包括m6甲基转移酶(作家),m6demethylase(橡皮擦),m6一个rna结合蛋白(读者)(12]。Methyltransferase-like 3 m (METTL3)是一种关键酶6甲基化修饰和甲基转移酶复杂的一个重要成员,包括METTL3 METTL4,肿瘤1-associated蛋白质(WTAP) [13]。它已经表明,m6一个甲基化由METTL3组织和细胞特异性(12- - - - - -15]。因此,METTL3的作用可能改变在不同组织和细胞(16]。METTL3已经被移植之前报道作为一个肿瘤抑制基因的m6A修改(17]。然而,陈和他的同事们发现METTL3可以促进肝癌进展的转录后的沉默SOCS2通过YTHDF2 [18]。更有趣的是,风等人的研究已经涉及METTL3可以抑制炎症影响MyD88可变剪接的(19]。然而,METTL3在RA的角色,自身免疫和炎性疾病,仍然是模糊的。在目前的研究中,我们调查METTL3在RA的表达及其与疾病的关系的活动。一系列的细胞在体外实验阐明了METTL3潜在作用及其分子机制在RA,这可能有助于探索RA的发病机制,探索小说对RA生物标志物。

2。材料和方法

2.1。参与者

例(47)参与本研究承认潍坊医科大学的附属医院2018年3月至2018年9月。30控件注册在同一时间在同一家医院健康检查,当控制风湿性疾病史的都排除在外。所有RA病例新活跃的病人和尚未疾病修饰治疗风湿病的治疗药物和/或类固醇之前血液样本集合。RA患者伴有其他风湿性疾病被排除在外,如干燥的疾病。本研究机构的伦理委员会批准的医院。病人和控制测试之前都签署书面知情同意。所有参与者的特点提出了详细表1。

表1
参与者的特征。
2.2。细胞培养和转染

THP-1细胞在RPMI1640培养培养基(表达载体Corp .)、大岛屿,NYUSA)管理10%胎牛血清(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)加青霉素、链霉素、谷酰胺5%以下公司2在37°C。在治疗之前,THP-1细胞被刺激和诱导macrophage-like细胞(pTHP-1) 100 ng / ml phorbol-12-myristate-13醋酸(美国σPMA) 48 h。细胞被慢病毒转染质粒聚凝胺(8μ48 h和g / ml)用于以下实验。

2.3。定量实时聚合酶链反应(存在)

外周血单核细胞(PBMCs)被Ficoll-Paque从新鲜的血液样本中提取淋巴细胞分离试剂(TBD,天津,中国),在2000转离心30分钟。我们使用的提取外周血单核细胞CD14微(Miltenyi研究,圣地亚哥,CA)根据协议。从这些细胞总rna提取试剂盒(美国表达载体)和量化通过测量吸光度与紫外分光光度计。共有1μg RNA被用来合成cDNA,用作PCR模板使用SYBR绿色Mastermix工具包(豆类,大连,中国)。引物如下所示。GAPDH:正向引物:GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;反向引物:GGATCTCGCTCCTGGAAGATG。METTL3:正向引物:TTGTCTCCAACCTTCCGTAGT;反向引物:CCAGATCAGAGAGGTGGTGTAG。METTL14:正向引物:AGTGCCGACAGCATTGGTG;反向引物:GGAGCAGAGGTATCATAGGAAGC。肥胖相关蛋白(FTO):正向引物:AGAGCTCTAGAACCACCATGGATTACAAAGATGAC;反向引物:CTAAGATTGCGGCCGCCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGC。 AlkB homologue 5 (ALKBH5): forward primer: CGGCGAAGGCTACACTTACG; reverse primer: CCACCAGCTTTTGGATCACCA. YTHGF1: forward primer: ACCTGTCCAGCTATTACCCG; reverse primer: TGGTGAGGTATGGAATCGGAG. YTHGF2: forward primer: AGCCCCACTTCCTACCAGATG; reverse primer: TGAGAACTGTTATTTCCCCATGC. IL-6: forward primer: AGTCCTGATCCAGTTCCTGC; reverse primer: CTACATTTGCCGAAGAGCCC. TNF-α:正向引物:ATGTGGCAAGAGATGGGGAA;反向引物:CTCACACCCCACATCTGTCT。

2.4。米总6测量

采用无血清细胞被播种在six-well文化菜隔夜RPMI1640培养基。然后,细胞治疗1μ美国CA g / ml有限合伙人(σ)为0,6、12、24小时。rna提取根据协议。甲基化量化工具(美国纽约EpiGentek,法明岱尔)应用于确定水平的m6细胞的RNA修改。

2.5。细胞计数工具包(CCK-8)

我们使用CCK-8工具包(Vazyme生物科技、南京、中国)来确定细胞增殖。简而言之, 每口井THP-1细胞孵化和激活PMA (100 ng / ml) 48小时在96孔板和无血清培养基培养12小时,然后刺激1μ美国g / ml有限合伙人(σ)为0,12、24、48小时。450海里的吸收是由标仪(美国BioTek)孵化后CCK-8试剂2小时37°C。

2.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)

il - 6的浓度,TNF -α、ESR、CRP ELISA测定根据设备的协议(美国研发系统)。我们决定吸收的波长450 nm校正波长为540 nm。实验重复了三遍。

2.7。免疫印迹

总共30μg /通道蛋白被用于检测提取外周血单核细胞和pTHP-1细胞。我们采用了布拉德福德分析工具包(Bio-Rad实验室、CA、美国)量化蛋白质。抗体的蛋白质样本孵化METTL3(细胞信号技术,美国)和p-NF -κB(细胞信号技术,美国)β肌动蛋白(σ,美国)。

2.8。免疫荧光

被LPS激活后(1μg / ml) 4小时,磷酸化NF -的状态κB pTHP-1核的细胞被免疫荧光估计。简而言之,与p-NF——pTHP-1细胞被孵化κ美国B抗体(CST)然后二级抗体和FITC标记。最后,细胞被发现使用共焦激光扫描显微镜(TCS SP8徕卡)。

2.9。统计分析

统计分析是由使用GraphPad棱镜(美国CA GraphPad软件)。用于分析的数据是正常分布。未配对学生的 - - - - - -测试或单向方差分析是用于统计分析。皮尔森相关分析是分析之间的关系时使用的表达METTL3和ESR和血清中CRP水平。双尾 被认为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。RNA的表达N6 Methylation-Related基因在RA

我们筛选的表达6methylation-related基因在RA患者和健康对照组的PBMCs定量实时聚合酶链反应,包括基因METTL3, METTL14, FTO, ALKBH5 YTHDF1, YTHDF2。如图1(一)- - - - - -1 (f)的表达,与正常对照组相比,METTL3在RA患者PBMCs显著增加,同时观察其他关键方面没有区别6methylation-related酶(METTL14 FTO, ALKBH5 YTHDF1,和YTHDF2)。单核细胞是主要的细胞参与炎症和免疫规定。这里,表达升高METTL3还发现在RA患者单核细胞与控件(数字1 (g)和1 (h))。综上所述,METTL3在RA调节。

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图1
m的表达式6在RA methylation-related基因(例/控制:47/30)。(a)的mRNA水平增加METTL3 RA与健康对照组。(b) mRNA水平METTL14在RA与健康对照组进行比较。(c) mRNA RA的FTO水平与健康对照组相比。(d) mRNA RA的ALKBH5水平与健康对照组。(e) mRNA水平YTHDF1在RA与健康对照组进行比较。(f) mRNA水平YTHDF2 RA与健康对照组。(g)的mRNA水平增加METTL3在RA患者单核细胞与控制。(h)增加METTL3蛋白质在RA患者单核细胞与控制。
3.2。METTL3和RA患者的疾病活动之间的联系

有趣的是,皮尔森相关分析表明,METTL3的表达与CRP(图呈正相关2(一个))。同样,积极的协会的表达与ESR METTL3 RA(图中观察到2 (b))。因此,高水平的METTL3 PBMCs可能预测高RA患者的疾病活动。

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图2
METTL3和RA疾病活动之间的联系。(一)积极与CRP在RA METTL3协会。(b)积极与ESR METTL3 RA协会。
3.3。有限合伙人增强METTL3的表达

鉴于积极METTL3和c反应蛋白之间的联系以及ESR在RA,我们假设一个高水平的METTL3可以诱导炎症条件,这可能因此抵御炎症。结果,我们进行体外细胞实验观察炎症的影响在METTL3表达和m的水平6pTHP-1巨噬细胞RNA修改。有限合伙人可以提高METTL3的表达在这两个层次的信使rna和蛋白质以时间依赖方式(数字3(一个)和3 (b))。水平的米6RNA修改也增加pTHP-1巨噬细胞在时间的方式(图3 (c))。综上所述,炎症可能促进METTL3的表达和生物活性。然而,METTL3是否影响巨噬细胞的炎症和RA发展仍然未知。

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图3
LPS促进METTL3 pTHP-1细胞的表达和活性。(一)增加METTL3的mRNA水平细胞( ;LPS刺激为0小时、6小时、12小时、24小时; 和 )。(b)增加METTL3蛋白的表达在细胞( ;LPS刺激0小时、6小时、12小时、24小时)。(c)总m6细胞中的一个内容(LPS刺激0小时,6小时,12小时,24小时; ; 和 )。
3.4。METTL3抑制pTHP-1巨噬细胞的激活

就是明证CCK-8化验,巨噬细胞的增殖显著抑制METTL3-overexpressed pTHP-1细胞被LPS激活后12,24和48小时(图4(一))。此外,il - 6和TNF -的一代α由有限合伙人显然是阻止METTL3 pTHP-1巨噬细胞中过表达时(数据4 (b)和4 (c))。因此,N的一个关键酶6-methyladenosine (m6甲基化,METTL3可能影响RA通过抑制巨噬细胞的增殖和炎症反应,在RA起到了至关重要的作用。

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图4
METTL3抑制pTHP-1细胞的增殖和活化。(a) CCK-8试验检测细胞的增殖0小时,12小时,24小时和48小时( ; ; )。(b)减少mRNA水平的il - 6和TNF -α在METTL3-overexpressed pTHP-1细胞( ; ; )。(c)水平的il - 6和TNF -下降α蛋白质在文化METTL3-overexpressed细胞的上清液( ; 和 )。
3.5。METTL3抑制NF - pTHP-1巨噬细胞的炎症反应κB

失调的METTL3似乎影响巨噬细胞的炎症反应。然而,潜在的分子机制仍然是模糊的。在这项研究中,我们发现,NF -的磷酸化κB显然是克制METTL3-overexpressed pTHP-1细胞虽然细胞被激活为4小时(图有限合伙人5(一个))。此外,磷酸化的核易位NF -κB细胞也克制METTL3过表达(图时5 (b))。综上所述,在LPS-induced METTL3的修改影响炎症巨噬细胞是依赖于转录因子NF -κB。

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图5
METTL3减毒LPS-induced炎症巨噬细胞通过NF -κB信号通路。(一)METTL3抑制NF -的磷酸化κB在LPS引起的细胞( )。(b) METTL3抑制p-NF——核易位κB在LPS引起的细胞( )。

4所示。讨论

类风湿性关节炎是一种慢性系统性自身免疫性疾病,病因在很大程度上是未知的(20.]。众所周知,多种因素在RA与炎症和免疫障碍有关,包括遗传因素,环境因素,和表观遗传放松管制21,22]。各种炎症介质负责关节炎和关节畸形,如肿瘤坏死因子-α、il - 6和IL-17 [23]。除了炎症、自身免疫性疾病密切相关的开发和进展RA。作为一个关键酶m6甲基化修饰,METTL3一直建议调节炎症和自身免疫平衡(13,19]。本研究首先显示的证据表明METTL3调节RA和积极与疾病相关的活动。此外,METTL3抑制巨噬细胞的增殖和活化NF -κB。

米6A是一个甲基化腺苷N6位置的,这是被视为最丰富的epitranscriptomic修改mRNA在真核细胞24]。大量的研究已经证明,m6一个甲基化参与各种生理过程包括mRNA稳定和翻译。其修改影响胚胎发育、细胞分化和压力已经好了24- - - - - -26]。有几个关键基因m6甲基化改性,主要包括METTL3 METTL14, FTO, ALKBH5, YTHDF [27,28]。METTL3也称为MTA70,最初确定为甲基转移酶参与的过程6一个甲基化29日]。积累的证据强烈支持METTL3参与各种生理环境和在癌症30.- - - - - -32]。METTL3位于核散斑,这表明METTL3可能RNA代谢起着重要的作用33,34]。鉴于其对炎症的影响,癌症和免疫调节(19),我们假设METTL3可能影响的开发和进展RA通过调节macrophage-mediated炎症。在这项研究中,我们首先发现m的表达6methylation-associated基因(METTL3 FTO, ALKBH5 METTL14, YTHDF1,和YTHDF2)在PBMCs RA患者,发现METTL3在RA与健康对照组相比明显调节。有趣的是,LPS刺激可以提高总m6巨噬细胞以时间依赖方式的内容移植METTL3。它可以得出结论,METTL3调节巨噬细胞炎症的情况下。

巨噬细胞被激活时感染致病因素,如有限合伙人,PGN,和病原微生物的核苷酸成分,导致磷酸化和易位的转录因子NF -κB核和诱发的生成目标基因与炎症有关,例如,il - 6和TNF -α(33,35,36]。NF -κB信号通路是一个典型的通路相关的炎症和免疫调节类风湿性关节炎(37]。越来越多的数据表明,m的表达和调控6methylation-related基因与多种免疫信号通路相关,特别是NF -κB通路(8,18]。在这项研究中,发现了METTL3在外周血单核细胞,调节的关键细胞类型PMBCs参与炎症和免疫的规定。此外,我们证明了METTL3对美元的影响6巨噬细胞刺激有限合伙人修改。因此,我们假设METTL3-dependent m6修改与LPS诱导的巨噬细胞炎症有关。在体外实验验证后,我们发现METTL3可以阻止巨噬细胞增殖和炎症反应的细胞因子的生产,也就是说,il - 6和TNF -α。此外,它的抑制影响LPS-induced炎症巨噬细胞是依赖于NF -κB信号通路。然而,典型的其他关键基因信号通路是否参与m6巨噬细胞除了NF -修改κB更多未来的研究需要调查。

总之,本研究显示了强有力的证据支持METTL3在RA的至关重要的作用。METTL3可以通过NF -减弱LPS-induced巨噬细胞的炎症κb在这个研究结果有助于了解类风湿性关节炎发病机理,探索新颖的生物标志物对RA诊断和治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

书珊城京华Wang Yan,红英陆co-first作者。

确认

这项工作是由国家自然科学基金支持的(81601408),山东省自然科学基金对于年轻学者(ZR2019QH012和ZR2016HQ12),和潍坊科技发展项目(2017年2019 gx031 2019 yx020, yx019)。