文摘

已发现神经肽甘丙肽及其受体对神经元有保护作用。然而,甘丙肽对星形胶质细胞的作用尚不清楚。本研究旨在调查甘丙肽的影响生存能力的培养的大鼠皮层星形胶质细胞氧化应激诱导后H2O2和可能的受体和信号机制。甘丙肽的治疗有显著的保护作用对H2O2全身的培养的皮质星形胶质细胞的毒性。H2O2诱导的upregulation磷酸化细胞外signal-related kinase1/2 (pERK1/2)星形胶质细胞,由coapplication甘丙肽的抑制,表明一个pERK1/2信号通路参与甘丙肽的保护作用。GalR2表达水平高于GalR1和GalR3培养皮层星形胶质细胞,和GalR2兴奋剂AR-M1896模仿甘丙肽对星形胶质细胞的影响,这意味着甘丙肽主要由GalR2保护作用。与此同时,甘丙肽没有影响大鼠大脑皮质星形胶质细胞的A1-type转换。这些结果表明,甘丙肽保护大鼠大脑皮质星形胶质细胞氧化应激的抑制H2O2全身upregulation pERK1/2,主要通过GalR2。

1。介绍

在中枢神经系统(CNS)星形胶质细胞有助于保持体内平衡的中枢神经系统1]。血脑屏障作为一个组成部分,星形胶质细胞作为中枢神经系统功能障碍,吸引和限制炎症(2]。星形胶质细胞保持他们之间的平衡反对谷氨酸摄取和释放功能(3,4),提供神经胶质细胞参与癫痫的病理生理学5]。星形胶质细胞可能带动线粒体癫痫发作一代(6),即使是典型的星形胶质细胞导致自发分散的创伤性脑损伤后反复发作(7]。星形胶质细胞参与突触可塑性,神经元网络振荡,和认知过程,扮演一个角色在阿尔茨海默病(8]。星形胶质细胞对各种形式的中枢神经系统通过一个过程称为活性astrogliosis侮辱。这个过程是一个高度异构状态;星形胶质细胞的功能可能是有害的或有益的(9]。因此,两种不同类型的反应性星形胶质细胞被称为" A1 "(有害的)和“A2”(有益),分别根据神经炎症和缺血(10]。

甘丙肽,氨基酸神经肽(29 - 30日11],广泛表达在中枢神经系统12]。它参与了许多生理和病理功能,如记忆、癫痫、阿尔茨海默病,和抑郁13]。到目前为止,三个甘丙肽受体已经被克隆,称为GalR1, GalR2, GalR3 [13]。发现甘丙肽共存与许多经典神经递质,如5 -羟色胺在中缝背核(DR)、去甲肾上腺素在蓝斑(LC)和乙酰胆碱在内侧隔核(女士)12,14]。因此,甘丙肽起cotransmission作用在中枢神经系统15]。许多研究表明,甘丙肽也有神经营养/神经保护效应除了神经传递的作用。神经元保护功能已被证明是主要从体外培养海马神经细胞体内动物模型和转基因模型(16- - - - - -18]。主要由GalR2甘丙肽是介导的神经保护(17,18]。然而,GalR1最近被发现对神经元的保护作用在大鼠海马和脑缺血小鼠大脑19,20.]。然而,一些研究已经完成调查甘丙肽对星形胶质细胞的保护作用。造粒机和他的同事们发现,甘丙肽能够诱导c-fos mRNA在培养大鼠星形胶质细胞,提供证据的存在功能性甘丙肽受体在神经胶质细胞(21]。在目前的研究中,甘丙肽的影响H后培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞的可行性2O2全身的氧化应激以及受体和信号机制。

2。材料和方法

2.1。大鼠大脑皮质星形胶质细胞的文化

的大脑皮质星形胶质细胞的文化准备已经新生儿的雄性sd大鼠中。斩首后,脑干、小脑和间脑被移除在寒冷的解剖缓冲区,脑膜剥落,然后大脑被剪碎,孵化与0.25% trypsin-EDTA 37°C 5分钟,通过200目过滤。细胞培养在37°C 5%的二氧化碳1小时与10%胎牛血清的DMEM / F12补充。收集培养基,细胞在DMEM / F12 resuspended补充10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素和镀poly-L-lysine-coated 75厘米2烧瓶37°C的5%的股份有限公司2孵化器。大约2周后,文化达到融合,动摇了在250 rpm 18小时37°C到驱逐坚持星形胶质细胞细胞层,主要是少突胶质细胞。建立了二级星文化通过使胰蛋白酶化融合性的文化和底板上菜肴。在目前的研究中,星形胶质细胞被用于通道3。星形胶质细胞转化时,肿瘤坏死因子α(MCE) 30 ng / ml il - 1α(3 ng / ml, MCE)和C1q (400 ng / ml, BioVision)添加在中。

2.2。细胞毒性试验

星形胶质细胞对各种化学物质的敏感性检测使用细胞计数工具包(CCK,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)技术。星形胶质细胞是镀的密度在96 - 5000细胞/板。24小时孵化后37°C公司5%2孵化器,培养基被替换为新的媒介和药物,为额外的24小时孵化。10μl CCK试剂添加到每个好,孵化前2小时阅读波长450纳米。药物添加到每个包含几组,车辆,H2O2H2O2+甘丙肽,甘丙肽,H2O2+ AR-M1896, AR-M1896。吸光度与车辆被转换为百分比进行比较。

2.3。免疫细胞化学染色

细胞25毫米poly-L lysine-coated玻璃盖玻片和PBS冲洗两次,pH值7.2 - -7.4,4%多聚甲醛固定在PBS在室温下15分钟,冲洗三次与PBS、孵化和PBS包含0.3% Triton x - 100为30分钟,封锁在10%山羊血清PBST 1小时,孵化与主要单克隆anti-GFAP鼠抗体(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)一夜之间在4°C,与PBS冲洗三次,与二次孵化山羊anti-mouse Alexa萤石488(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 2小时在RT与PBS冲洗三次,与甘油安装,共焦显微镜下检查(美国徕卡)或倒置荧光显微镜IX51(奥林巴斯、日本)。

2.4。免疫印迹

星形胶质细胞与PBS洗,细胞溶解在里帕溶解产物含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Applygen,中国)和磷酸酶抑制剂(σ,美国),和用近2分钟。细胞溶解产物离心20分钟在13000 g在4°C。浮在表面的蛋白质在12% sds - page凝胶分离和转移到PVDF膜。与Tris-buffered脱脂牛奶5%盐水阻塞后,pH值7.5,含0.1%渐变20 (TBS-T)在室温下2小时,墨迹是孵化主要抗体TBS-T一夜之间在4°C。主要包括抗体兔子anti-pERK1/2抗体(1:1000年,细胞信号技术)和鼠标anti-Gapdh抗体(σ1:10000)。然后,墨迹TBS-T三次清洗和孵化了辣根peroxidase-conjugated二级抗体(山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse)(1: 5000年,中国)RT对2小时。最后,这些墨迹冲洗和可视化使用增强化学发光系统(美国罗克福德热费希尔科学)根据制造商的指示。光学密度的污点是量化使用ImageJ软件。比率的pERK1/2 Gapdh计算每个样本,和褶皱变化与对照组相比。

2.5。反转录的信使核糖核酸

总信使rna分离大鼠大脑皮质星形胶质细胞的文化使用试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国),信使rna是反向转录使用上标™三世RT试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的手册。

2.6。聚合酶链反应(PCR)

PCR反应进行了使用PrimeSTAR®HS DNA聚合酶(豆类、东京、日本)在下列条件:2分钟98°C,周期10年代98°C和1分钟68°C,然后10分钟68°C。引物是列在表中1。的身份PCR产品经测序。

表1
PCR引物。
2.7。实时定量PCR (qPCR)

实时定量PCR SYBR绿色(ABI)进行。总反应系统是20μl, 50°C 2分钟,95°C 10分钟,40周期为95°C 15秒,60°C 1分钟。Gapdh是设置为内部参数和相对mRNA水平与2计算−ΔΔCt方法。引物是列在表中2。

表2
qPCR引物。
2.8。统计分析

结果给出了 或中位数(四分位范围)。用单向方差分析或非参数测试数据进行评估。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。H2O2全身毒性在培养大鼠大脑皮质星形胶质细胞

使用CCK试验,我们发现H的毒性作用2O2在星形胶质细胞生存能力依赖于H的浓度2O2应用(图1)。的最大影响H2O2星形胶质细胞的生存能力下降到20%以下。当150年以来星形胶质细胞生存能力是60%μM H2O2应用,我们选择这个浓度测试本研究中甘丙肽的影响。


图1
H2O2全身毒性在培养大鼠大脑皮质星形胶质细胞。细胞生存能力由CCK分析决定。H2O2导致剂量依赖性对星形胶质细胞生存能力的影响。数据了 。 , 与对照组。
3.2。甘丙肽的保护作用与H2O2全身毒性在培养大鼠大脑皮质星形胶质细胞

为了研究甘丙肽的保护作用与H2O2全身毒性、培养大鼠大脑皮质星形胶质细胞治疗与车辆,150μM H2O2,150年μM H2O2(1 +甘丙肽与不同浓度μ米、100 nM、10 nM, 1纳米,100点,10点和下午1点),分别。如图2(一个)时,星形胶质细胞治疗的共同甘丙肽1 nM和100点,细胞的异常高的相比,H2O2治疗组显著( )。甘丙肽在较低(< 10点)或更高(> 10 nM)浓度没有显著影响细胞损失引起的H2O2。同时,甘丙肽治疗,各种浓度(1μ米、100 nM、10 nM, 1纳米,100点,10点和下午1点)没有任何重大影响星形胶质细胞生存能力(图2 (b))。GFAP免疫细胞化学染色后,我们发现星形胶质细胞的数量更少,治疗H2O2相对于对照组(数字2 (c)和2 (d)),而甘丙肽(1纳米)拯救部分损失的星形胶质细胞(图2 (e))。甘丙肽本身并没有改变星形胶质细胞的数量明显(图2 (f))。

(一)
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(c)
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图2
甘丙肽的保护作用与H2O2全身毒性在培养大鼠大脑皮质星形胶质细胞。(一)使用CCK试验,治疗1 nM和100点甘丙肽显示显著的保护作用对H2O2全身毒性;(b)甘丙肽治疗没有任何重大影响星形胶质细胞生存能力与对照组相比;(氟)甘丙肽逆转细胞死亡引起的H2O2。GFAP免疫细胞化学染色的不同组:对照组(c)、150年(d)μM H2O2150年集团(e)μM H2O2+ 1 nM甘丙肽组和(f) 1 nM甘丙肽组。数据了 。 , 与H2O2组。 μm。
3.3。pERK1/2参与甘丙肽的保护作用与H2O2全身的毒性

确定pERK1/2参与甘丙肽的保护作用与H2O2全身毒性,我们进行免疫印迹实验。结果表明,pERK1/2蛋白质含量在150年显著增加μM H2O2组相对于对照组( )。Coapplication 1 nM甘丙肽显著抑制H2O2全身的upregulation pERK1/2级别( )。然而,pERK1/2蛋白质含量更高的H2O2+甘丙肽组相对于对照组( )(图3)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
甘丙肽抑制H2O2全身upregulation pERK1/2蛋白的水平。(a)代表滴pERK1/2控制,150年μM H2O2,150μM H2O2+ 1 nM甘丙肽组;(b)的比率pERK1/2 Gapdh是计算和比较。数据了 。 , 与对照组相比, , 相比之下,H2O2组。
3.4。GalR2参与甘丙肽的保护作用与H2O2全身的毒性

的mRNA表达甘丙肽、GalR1 GalR2,和发现GalR3培养大鼠皮层星形胶质细胞,分别。如图4,表达水平GalR2温和而GalR1水平和GalR3非常弱,建议主要GalR2存在于大鼠大脑皮质星形胶质细胞。


图4
温和的表达GalR2和弱表达GalR1 GalR3培养大鼠皮层星形胶质细胞。甘丙肽的表达、GalR1 GalR2, GalR3被rt - pcr检测。

探讨甘丙肽受体的亚型(s)介导的对H galanin-induced保护作用2O2在培养的大鼠皮层星形胶质细胞毒性,GalR2兴奋剂AR-M1896 [22使用了)。培养的星形胶质细胞处理车辆,150μM H2O2和H2O2(1 + AR-M1896各种浓度μ米、100 nM、10 nM, 1纳米,100点,10点和下午1点),分别。如图5(一个),共同与AR-M1896浓度从100纳米到10点( )显示星形胶质细胞生存能力要明显高于H2O2一个人。但治疗AR-M1896独自在不同浓度测试上面并没有改变星形胶质细胞生存能力与CCK试验(图测量5 (b))。这些结果表明,主要GalR2介导甘丙肽在培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞的保护作用。

(一)
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(b)
(b)
图5
AR-M1896的保护作用与H2O2全身毒性培养的皮质星形胶质细胞的老鼠。(一)使用CCK技术,治疗100 nM-10点对H AR-M1896显示显著的保护作用2O2全身毒性;(b)治疗AR-M1896本身没有任何重大影响星形胶质细胞生存能力与对照组相比。数据了 。 , 与H2O2组。
3.5。没有调制甘丙肽对培养的A1转录水平的影响皮质星形胶质细胞

据报道,星形胶质细胞可以转化为A1-type反应性星形胶质细胞,导致神经元死亡(10]。为了研究甘丙肽是否能够恢复A1反应性星形胶质细胞星形胶质细胞休息,il - 1α,肿瘤坏死因子αA1, C1q应用诱导反应性星形胶质细胞(10]。如图6治疗后,身体的星形胶质细胞肥大。与此同时,A1 TNF等记录α,il - 1β强劲,伊诺培养大鼠大脑皮质星形胶质细胞是高(图7和表3)。然而,coapplication甘丙肽没有显著影响的upregulation A1成绩单(图7、表3)。

(一)
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(b)
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(c)
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图6
培养皮层星形胶质细胞激活TNF的结合应用α,il - 1α,C1q。胞体肥大。免疫细胞化学染色检测GFAP的星形胶质细胞不同的组:对照组(a)、(b)肿瘤坏死因子α+ il - 1α肿瘤坏死因子+ C1q集团(c)α+ il - 1α+ C1q +甘丙肽组和(d)甘丙肽组。 μm。
(一)
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(b)
(b)
(c)
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图7
肿瘤坏死因子α,il - 1β的培养的皮质星形胶质细胞升高,伊诺mRNA结合肿瘤坏死因子的应用α,il - 1α,C1q。甘丙肽的应用并没有改变A1表型。肿瘤坏死因子的相对转录水平α,il - 1β,并与qPCR伊诺基因检测。数据中位数(四分位范围)。 , 与对照组。
表3
肿瘤坏死因子的相对转录水平α,il - 1β,伊诺星形胶质细胞的基因。

4所示。讨论

甘丙肽已被认为是神经系统的神经递质和神经调质(23]。与此同时,积累的证据表明,甘丙肽也是一个神经营养/神经保护作用的神经元子集在周边和中枢神经系统16]。例如,在体内和体外模型的损伤,观察海马神经元细胞死亡在甘丙肽基因敲除小鼠,观察海马神经元细胞死亡galanin-overexpressing转基因小鼠,与WT控制(24]。甘丙肽还能抑制淀粉样β蛋白引起的神经毒性的主要培养海马神经元从人类,老鼠,和转基因动物25,26]。

在目前的研究中,第一次,我们表明,甘丙肽,在浓度从100点到1海里,有显著的保护作用2O2全身的细胞培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞的死亡。外生H2O2治疗诱导活性氧(ROS)生成的细胞。当活性氧积累超过细胞的能力,由此产生的氧化应激导致星形胶质细胞死亡(27]。H2O2已经被证明能够提高蛋白激酶的磷酸化ERK在星形胶质细胞(28]。虽然ERK1/2-MAPK的激活被认为是细胞生存信号,增长和扩散,它也表明,抑制活跃信号通路减少星形胶质细胞死亡引起的氧化应激(29日]。在目前的研究中,upregulation pERK1/2诱导的H2O2被甘丙肽部分逆转,表明甘丙肽抑制H2O2全身毒性对大鼠脑星形胶质细胞通过抑制pERK1/2的激活。应该注意的是,甘丙肽也被报道在神经元激活ERK信号(30.]。因此,甘丙肽可能不同的信号机制在不同的细胞。

GalR1和GalR2广泛表达在中枢神经系统的表达GalR3是有限的(31日,32]。它已经表明,甘丙肽的神经保护作用都是通过其受体介导的。因此,通过GalR2甘丙肽具有神经保护功能(17,18,24]或GalR1 [19,20.]。我们的研究表明,GalR2 mRNA表达温和而GalR1和GalR3 mRNA表达很低在培养大鼠皮层星形胶质细胞。此外,GalR2兴奋剂AR-M1896模仿甘丙肽在星形胶质细胞的保护作用。这些结果表明,GalR2参与皮质星形胶质细胞的保护。这是与以往的研究一致神经元GalR2介导甘丙肽的保护作用[18,33]。有趣的是,甘丙肽的浓度效应只在从100点到1海里,和AR-M1896效果只有在浓度从10点到100海里。甘丙肽的钟形剂量反应已经被报告为一个临界浓度窗口在早期研究[26]。此外,我们也看到AR-M1896比甘丙肽广泛有效的集中在当前的研究中。钟形剂量反应的机制仍不清楚。一个可能的解释是甘丙肽可能作用于不同的受体亚型有不同的亲和力。然而,它需要进一步的调查。

最近的一项研究表明,星形胶质细胞转化为A1活性类型时接受il - 1的结合α,肿瘤坏死因子α,C1q体外(10]。A1-type反应性星形胶质细胞被认为是神经毒性和急性中枢神经系统损伤后导致神经元死亡。例如,A1-type星形胶质细胞已被证明是一个角色在创伤性脊髓损伤的神经炎症34]。块A1小胶质细胞星形胶质细胞转化的阿尔茨海默病的神经保护的模型或帕金森病35,36]。因此,调制的有害影响A1-type星形胶质细胞可以治疗中枢神经系统疾病的一个重要战略。然而,甘丙肽没有影响A1-type转变培养大鼠大脑皮质星形胶质细胞的研究。

5。结论

从H甘丙肽保护大鼠大脑皮质星形胶质细胞2O2全身的细胞死亡通过抑制upregulation pERK1/2,主要由GalR2。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突存在。

确认

这项工作是支持由北京市科技拨款委员会(Z181100001518001),首都医科大学科学研究基金(PYZ2017065),中国国家自然科学基金(81671345,81671345,81401119),上海市科技委员会(关键项目,KZ201610025026)和北京自然科学基金(公里/ KZ7172018)。