文摘
糖尿病性视网膜病变被认为是神经与血管的紊乱,高血糖的主要风险因素被认为是这一病理。糖尿病性视网膜病变也呈现低度的慢性炎症性疾病,包括增加视网膜细胞因子的水平,比如interleukin-1β(il - 1β)。然而,葡萄糖和il - 1多高β影响不同类型视网膜细胞仍有待澄清。在视网膜神经细胞培养中,我们发现,il - 1β和IL-1RI出现在小胶质细胞、星形细胞和神经元。暴露的视网膜神经细胞培养高葡萄糖调节mRNA和蛋白水平的il - 1β。高葡萄糖减少小胶质和macroglial细胞增殖,而il - 1β增加他们的扩散。有趣的是,在高葡萄糖条件下,尽管小胶质细胞的数量减少,他们表现出更少的分歧的形态,显示更多的激活状态,在支持的upregulation ED-1的水平,小胶质细胞激活的标志。总之,il - 1β可能发挥关键作用在糖尿病性视网膜病变,影响小胶质和macroglial细胞,最终导致神经改变糖尿病患者。特别是,因为il - 1β有一个重要的角色在糖尿病视网膜小胶质细胞的激活和增殖,il - 1的限制β——炎症过程可能会提供一个新的治疗策略,防止糖尿病视网膜病变的进展。
1。介绍
糖尿病视网膜病变是视力丧失和失明的主要原因在西方国家和糖尿病最常见的并发症。高血糖症被认为是潜在的糖尿病性视网膜病变的主要致病因素,blood-retinal屏障的破坏(马上回来),第一个改变临床明显,和疾病的一个标志1]。
事实上,在视网膜神经功能障碍的早期迹象,即改变视网膜电流图和色彩和对比敏感度,损失发生前的检测微血管变化在糖尿病患者和动物2- - - - - -5]。尽管理解糖尿病视网膜病变的发病机理的研究进展,神经功能障碍的机制远未被完全理解。
越来越多的证据表明,糖尿病性视网膜病变具有低度的慢性炎症性疾病。多个基因参与炎症过程中调节早期糖尿病大鼠视网膜(6,7]。在糖尿病患者的玻璃液,interleukin-1β(il - 1的水平β)、白介素和肿瘤坏死因子(TNF)增加8- - - - - -10]。此外,增加细胞因子的生产,如il - 1β和TNF的表达粘附分子,白细胞粘附和血管通透性11- - - - - -13)在糖尿病动物的视网膜上被观察到。此外,糖尿病大鼠视网膜的体外实验,il - 1的水平β也增加了(14- - - - - -17),这是与马上回来渗透率的增加(12,14]。穆勒已经表明,神经胶质细胞与糖尿病大鼠获得活性表型,以应对糖尿病,增加炎症相关的基因的表达(16]。在培养的视网膜细胞暴露于高葡萄糖,增加(Ca2 +]我由观察purinergic受体的激活视网膜神经元和小胶质细胞(18]。这种增强钙反应也可能导致增加的炎症介质的释放,在糖尿病视网膜神经递质。早期视网膜小胶质细胞的激活在糖尿病性视网膜病变是一种常见的反应,与进步在视网膜神经退化。活化的小胶质细胞导致他们的扩散和迁移,增加吞噬,并释放多种促炎介质(19]。视网膜被视为免疫组织的特权;然而,强有力的证据支持一个角色对小胶质细胞的激活和炎症在糖尿病视网膜病变的发病机制17,20.,21]。
il - 1β是一种促炎细胞因子已知移植大量的炎症介质,包括il - 1β本身,肿瘤坏死因子、诱导一氧化氮合酶和趋化因子(22- - - - - -25]。il - 1β引发反应细胞只有通过il - 1 I型受体的激活(IL-1RI)虽然也可以绑定到il - 1 II型受体(IL-1RII),一个诱饵受体。尽管增加视网膜il - 1β水平在糖尿病条件下被描述和与糖尿病视网膜病变的发病机制,目前尚不清楚,视网膜细胞表达il - 1β和IL-1RI。
为了更好地理解多高葡萄糖和il - 1β影响视网膜细胞,我们评估是否高葡萄糖调节il - 1β表达和研究视网膜细胞产生il - 1β及其受体表达在初级视网膜神经细胞培养。重要的是,我们也评估了特异性高葡萄糖和il - 1的影响β本身在视网膜神经细胞培养主要影响澄清哪些细胞类型。
2。实验的程序
2.1。道德声明
程序涉及动物按照指南进行了欧洲共同体指令使用动物实验室(2010/63 /欧盟),翻译在2013年葡萄牙法律(Decreto-lei 113/2013),并按照视觉和眼科学研究协会(下午)指南在视觉研究中使用的动物。实验通过我们机构伦理委员会(Comissao de Etica哒Faculdade de药物哒Coimbra的大学)(批准ID: FMUC / 07/12)。此外,人与动物得到适当的教育(实验室动物科学协会联合会(FELASA)课程)葡萄牙当局的要求,和所有正在努力减少动物的痛苦。斩首和手术剪刀的方法用于执行安乐死是纯种老鼠幼崽(产后一天3 - 5)。
2.2。大鼠视网膜神经细胞的主要文化
主要鼠视网膜神经细胞培养得到3-5-day-old Wistar鼠的视网膜,如前所述[26,27]。2天后在文化、细胞培养和25毫米葡萄糖(最终浓度30毫米)或25毫米D-mannitol(+ 5毫米葡萄糖已经出现在细胞培养基),用作渗透控制,为进一步7天在文化和维护。葡萄糖的浓度在控制条件是5毫米。细胞也暴露于il - 1β(10 ng / ml)和脂多糖(LPS);积极控制炎症;1μg / ml)在体外(DIV) 8天24 h。
2.3。免疫印迹分析
免疫印迹分析视网膜神经细胞培养的细胞溶解产物如前所述执行(27用微小的变化)。等量的蛋白质是由钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),使用凝胶8% - -12%。电泳转移和阻塞后,膜与初级孵化抗体(列在表1)在一夜之间在4°C。使用的二次抗体anti-mouse或anti-rabbit碱性phosphatase-linked免疫球蛋白二次抗体(1:20000;通用电气医疗集团、英国)。蛋白质免疫反应性的乐队是可视化增强chemifluorescence衬底(ECF;通用电气医疗集团)。荧光检测的成像系统(佛罗里达州Thyphoon 9000年,通用电气医疗集团)和数字量化乐队的免疫反应性进行了使用ImageQuant 5.0软件(分子动力学Inc .森尼维耳市。美国CA)。β肌动蛋白被用作蛋白质加载控制。
2.4。免疫细胞化学
如前所述(执行Immunocytohemistry27]。表中列出使用的主要抗体1。二次抗体使用Alexa萤石594 -共轭anti-mouse免疫球蛋白g(1: 250)和Alexa萤石488 -共轭anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 250)。细胞核与DAPI染色(1:5000)。在激光扫描共焦显微镜细胞可视化LSM 710元(德国蔡司)。
2.5。评估细胞的生存能力
视网膜神经细胞培养的细胞生存能力评估(如前所述28]。
2.6。末端转移酶dUTP尼克结束标记(TUNEL)染色
细胞发生凋亡被TUNEL分析确定了使用无出路的荧光的TUNEL系统(美国Promega公司)如前所述29日]。细胞细胞核也与DAPI染色标签。倒置荧光显微镜的图像获得(DM IRE2、徕卡微系统公司、英国)。至少至少10个随机领域每个盖玻片。
2.7。定量实时聚合酶链反应
隔离从视网膜细胞总RNA,进行互补脱氧核糖核酸的合成,qPCR如前所述[30.]。目标老鼠基因(il - 1的引物βNM_031512)和参考基因(老鼠产生HPRT NM_012583)被预先设计和验证试剂盒(QuantiTect底漆,试剂盒)。
2.8。ELISA
在DIV 9日的条件培养基包含主要的视网膜神经细胞暴露于不同实验条件(控制、高葡萄糖、甘露醇和有限合伙人)被存储在−80°C,直到执行ELISA测定。大鼠il - 1βELISA开发工具包(英国PeproTech)是用来测量il - 1的水平β在视网膜神经细胞培养基。在100年重复使用每个样本化验μl的培养基。
2.9。流式细胞术
分析细胞发生细胞凋亡进行使用膜联蛋白V-FITC分析工具包(BD生物科学),遵循制造商的指示和使用PI染色。染色细胞分析FACSCalibur(美国Becton Dickinson)配备了488 nm氩激光器和635海里红色二极管激光器。收集到的事件/样本共20000名。流式细胞仪数据分析与CellQuest软件(Becton Dickinson)和绘制荧光强度的函数FL-1(绿色)和FL-3(红色)荧光。我们使用膜联蛋白V-FITC(发射518海里)与π(碘化propidium)(发射617海里)确定可行的细胞(膜联蛋白V−π−),早期凋亡细胞(膜联蛋白V+π−(膜联蛋白V),坏死细胞−π+(膜联蛋白V),晚期凋亡细胞+π+)。
2.10。统计分析
结果意味着±SEM。统计学意义是通过学生的决定t测试或方差分析,其次是Dunnett事后考验。差异被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。大鼠视网膜神经元和神经胶质和小胶质细胞表达il - 1β和IL-1RI
il - 1β促炎细胞因子,可以合成多种细胞类型,如白细胞、内皮细胞、神经元和神经胶质细胞。因为视网膜是由不同的细胞类型,可能会产生il - 1β,我们首先分析了视网膜细胞是否出现在文化(神经元,macroglial和小胶质细胞)能够合成il - 1β并确定那些可以直接受到il - 1的影响β,即细胞表达IL-RI。il - 1的表达β和IL-1RI的分布主要鼠视网膜神经细胞培养进行了双标记免疫细胞化学。特定的细胞标记被用来识别不同的细胞类型出现在细胞培养:TUJ-1(神经元),GFAP (macroglial细胞),和Iba-1 CD11b(小胶质细胞)。
如图1(一),il - 1β在TUJ-1免疫反应性存在+,CD11b+,GFAP+细胞。同样,IL-1R1+细胞免疫反应性的TUJ-1+,Iba-1+,GFAP+细胞(图1 (b))。这些观察表明,视网膜神经细胞表达il - 1β并且可以适应它,因为他们也表达IL-1RI。
(一)
(b)
3.2。高葡萄糖增加il - 1β在大鼠视网膜神经细胞表达
因为高血糖是糖尿病性视网膜病变的主要危险因素(27,28)和il - 1的水平β增加在糖尿病大鼠的视网膜14- - - - - -17),我们评估了血糖升高对il - 1的影响β表达在视网膜神经文化为了评估如果高葡萄糖本身能够移植il - 1β表达式。
首先,我们对il - 1β在这些文化由qPCR mRNA的表达。il - 1的显著增加β信使rna含量在高glucose-treated细胞(283.2±32.8%的控制)(图2(一个))。没有检测到变化在细胞暴露于甘露醇,表明葡萄糖的影响不是由于渗透性的增加。此外,il - 1的显著增加β信使rna在细胞治疗有限合伙人(增加到39868 .7±4043.4%的控制)(图2(一个)),il - 1的积极控制β基因表达upregulation。
(一)
(b)
决定是否增加il - 1β信使rna表达相伴与il - 1的生产β文化媒体,我们评估其蛋白质含量的视网膜神经细胞ELISA测定。il - 1的显著增加β在高葡萄糖水平检测治疗(增加到244.52±52.2%的控制)(图2 (b))。没有检测到变化在细胞暴露于甘露醇,证明不是由于增加渗透性的影响。正如所料,il - 1的显著增加β水平也发现LPS-treated细胞(333.8±98.3%的控制)(图2 (b))。
3.3。il - 1β不诱导视网膜神经细胞死亡
从我们实验室之前的研究29日,30.)显示培养的视网膜细胞暴露7天高葡萄糖减少细胞生存能力,这是伴随增加凋亡细胞核的数量被TUNEL检测。由于il - 1β是一个重要的调停人的炎症反应,参与多种细胞过程,包括细胞增殖、分化和细胞凋亡31日,32),我们评估是否暴露于il - 1β本身可能会增加在视网膜神经细胞凋亡。
视网膜细胞培养被暴露于il - 1β24小时,视网膜细胞生存能力被TUNEL分析评估和流式细胞术。il - 1β没有增加的数量TUNEL吗+细胞比控制条件(图3(一个))。来证实这些结果,我们另外进行流式细胞术与膜联蛋白V和π,旨在区分凋亡与可行的细胞的特性。一个典型的代表点阴谋后视网膜细胞暴露于il - 1的分析β如图3 (b)。暴露在il - 1β24小时没有增加这些文化的细胞死亡。点图分析表明,94.8±0.3%的细胞暴露于il - 1β是可行的,类似于控制条件(94.5±0.5%的细胞是可行的)。有趣的是,曝光的视网膜神经细胞il - 1β24 h诱导增加减少MTT(120.5±4.4%的控制;图3 (c)),这是经常使用的可行性或增殖试验。由于il - 1β没有增加细胞死亡,这个观察表明,il - 1β促进细胞增殖。为了验证是否增加MTT还原诱导il - 1β是由IL-1RI的激活,视网膜细胞暴露在il - 1β一起针对IL-1RI抗体。抗体的存在阻止了MTT减少il - 1诱导的增加β(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。高葡萄糖和il - 1β以不同的方式对视网膜小胶质细胞增殖的影响
因为我们发现增加减少MTT和TUNEL的数量没有变化+文化接触细胞il - 1β我们推测,il - 1β会影响一些细胞类型在这些文化的扩散。评估这一假说,视网膜神经细胞的增殖能力评估ki - 67或增殖细胞核抗原(PCNA)免疫反应性。因为增加了葡萄糖水平升高il - 1β在视网膜的文化中,我们也评估高葡萄糖对视网膜神经细胞增殖的影响。如图4(一)的数量,明显降低ki - 67+细胞在细胞暴露于高葡萄糖为7天(减少到49.07±6.5%的控制)。没有观察到变化在甘露醇细胞(数据没有显示)。相反,数量的显著增加ki - 67+细胞(增加149.8%±15.1%的控制)和il - 1细胞培养中观察到β24 h(图4(一))。类似于观察和ki - 67免疫反应性,PCNA高glucose-treated细胞中蛋白质含量降低和增加细胞暴露于il - 1β(图4 (b))。这些结果表明,长时间暴露于高葡萄糖和il - 1β在细胞增殖产生相反的影响。
(一)
(b)
(c)
识别哪些细胞出现在文化增殖,我们进行双标记使用CD11b免疫细胞化学实验+(小胶质)或GFAP+(macroglial)和ki - 67。关于小胶质细胞数量显著减少ki - 67+CD11b+细胞(32.3%±20.5%的控制)在视网膜神经细胞暴露于血糖升高,而在il - 1β治疗细胞数量显著增加ki - 67+CD11b+观察细胞(增加到193.6%±41.1%的控制)(图4 (c))。关于GFAP+ki - 67+细胞,很少或没有观察到阳性细胞控制条件(平均0.1±0.1 ki - 67+与GFAP colocalizing+每个字段),细胞在细胞暴露于高葡萄糖,我们没有发现任何GFAP+ki - 67+细胞。当细胞暴露在il - 1β,ki - 67的平均数量+细胞与GFAP colocalizing+每个字段细胞为0.5±0.2,展示macroglial细胞增殖增加(图4 (c))。
这些结果表明,在高葡萄糖减少视网膜神经胶质细胞增生,尤其是小胶质细胞,il - 1β增加macroglial和小胶质细胞增殖。
支持这一观察,我们下一个评估高葡萄糖和il - 1的影响β在两Iba-1的总数+和GFAP+细胞。小胶质细胞微环境变化非常敏感,以及细胞培养条件的变化。他们被认为是il - 1的主要生产商β,从而可以进一步激活小胶质细胞。高葡萄糖诱导Iba-1的数量明显下降+细胞(49.2±5.1%的控制)。然而,il - 1β诱导Iba-1的数量显著增加+细胞(144.9±10.9%的控制),如图5(一个)和5 (b)。GFAP的数量+细胞明显减少了高葡萄糖(77.3±1.6%的控制),但强烈增加了il - 1β(153.9±8.6%的控制)(数据5 (c)和5 (d))。因此,GFAP高glucose-treated细胞中蛋白质含量降低(74.7±5.4%的控制)。然而,没有改变GFAP蛋白含量时观察到的细胞暴露于il - 1β(图5 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
然而,我们注意到,不仅数量还微和macroglial细胞的形态学改变。提出了一个圆形小胶质细胞形态以更少的过程,表明更多的激活状态。另一方面,il - 1β治疗细胞培养,小神经胶质细胞呈现圆形和分歧的形态(图5 (d))。关于macroglial细胞,我们观察到细胞暴露于高葡萄糖有分枝的较低(图5 (c))。检查是否小胶质细胞被激活,我们评估ED-1免疫反应性(活化的小胶质细胞标记)免疫细胞化学和免疫印迹。有趣的是,显著增加ED-1蛋白质含量检测在细胞暴露于高葡萄糖为7天(增加到127.6±9.0%)(图5 (g))。正如所料,在il - 1β治疗细胞外,我们还观察到ED-1增加蛋白质含量(131.8±10.9%的控制)(数据5 (f)和5 (g))。
4所示。讨论
高血糖的主要风险因素被认为是糖尿病性视网膜病变的发展。然而,在过去的十年中,越来越多的证据表明,糖尿病性视网膜病变具有低度的慢性炎症性疾病(21]。事实上,它已经表明,macroglial和小胶质细胞的激活是一个重要的特性出现在糖尿病视网膜的神经炎症(17,31日- - - - - -34]。此外,增加产量的炎症介质,如il - 1β(21,35),肿瘤坏死因子-α(35),没有(12,21)已经发表在糖尿病动物的视网膜。
提出了工作成果表明,长期暴露在高葡萄糖上调il - 1β表达在视网膜神经细胞培养。在中枢神经系统,主要的il - 1的细胞来源β在压力条件下活化的小胶质细胞,细胞因子的顺向upregulation在星形细胞(25]。然而,一项研究表明,暴露在高葡萄糖,4天,上调il - 1是不够的β小胶质细胞表达(36]。然而,本研究使用脑源性执行小胶质细胞和更少的时间暴露于高葡萄糖(4天)比在我们的研究中(7天暴露)在视网膜细胞培养。
我们组曾表明,长期接触(7天)高葡萄糖减少细胞生存能力在视网膜神经细胞培养30.]。暴露于高葡萄糖增加(Ca2 +]我反应神经元和小胶质细胞在视网膜神经细胞培养18]。这些改变可能导致神经递质和促炎介质释放导致视网膜细胞死亡。此外,我们表明,早在3天的暴露在高葡萄糖也导致一个小,但意义重大,降低细胞生存能力,和细胞生存能力不断下降被发现更长的潜伏期,在最后时间点达到最低,7天(37]。凋亡细胞核的数量的增加被TUNEL分析7天后孵化高葡萄糖与减少伴随的细胞生存能力评估与MTT试验(28,37]。使用一些标记来识别类型的细胞发生凋亡视网膜文化暴露于高葡萄糖,我们表明,TUNEL很少+神经细胞免疫反应性的(NeuN TUJ-1),小胶质(CD11b),或macroglial (GFAP、波形蛋白)细胞标记。高的凋亡细胞比例高葡萄糖条件被认为是感光细胞和双极细胞37]。
在目前的研究中,il - 1β并不影响视网膜细胞凋亡细胞的数量的文化。有趣的是,il - 1β增加肝癌的减少。尽管经常用作细胞生存能力分析,也用作增殖试验。高葡萄糖减少MTT还原(28)和il - 1β增加,这些结果让我们假设接触高葡萄糖和il - 1β有相反的对细胞增殖的影响。符合这一点,我们进一步评估高葡萄糖和il - 1的影响β在细胞增殖ki - 67免疫染色。通过细胞计数,我们发现CD11b的数量明显下降+ki - 67+细胞和CD11b的数量+视网膜细胞文化暴露于高葡萄糖。因为它没有增加TUNEL检测+CD11b+这些文化细胞暴露于高葡萄糖(29日),这个观察表明,减少并不是由于CD11b的细胞凋亡+细胞。
由于il - 1βCD11b的数量增加+细胞,和高葡萄糖增加il - 1β在视网膜神经细胞培养生产,我们预计CD11b的增加+文化细胞暴露于高葡萄糖。然而,正如上面提到的,高葡萄糖CD11b的数量减少+细胞。一个可能的解释是,高葡萄糖可能减少CD11b扩散+细胞由于细胞周期阻滞38]。不过,有一个增加ED1细胞暴露于高葡萄糖水平,表明小胶质细胞激活。事实上,这种可能性是支持的il - 1的增加β水平细胞暴露于高葡萄糖时,自活化的小胶质细胞容易释放细胞因子水平的增加。
类似于观察小胶质细胞,il - 1βGFAP的数量增加+细胞,以及GFAP的数量+与ki - 67细胞染色,表明胶质细胞也激增。受伤后,Muller细胞被激活并接受反应性胶质增生,特点是增加细胞增殖和基因表达的改变39]。然而,视网膜细胞暴露于高葡萄糖时,有一个减少GFAP水平和GFAP的数量减少+细胞,表明葡萄糖升高本身对胶质细胞增殖有抑制作用,尽管上调il - 1的水平β在这些文化。减少胶质细胞增殖并不是由于胶质细胞死亡(40]。这些观察表明,il - 1的影响β在胶质细胞增殖明显依赖于它的浓度在细胞培养基。相对较低的水平的il - 1β细胞因子,这并不是能够诱导神经胶质细胞增殖。
连续刺激与压力信号可导致慢性小胶质细胞过度刺激由此损失了其自身调节的机制,放大炎症(41),可能因此对神经元是有害的。当视网膜文化对il - 1β24 h,我们没有发现任何水平的变化TUJ-1(数据未显示),一个神经元标记。然而,我们不能排除这种可能性,在更长时期内il - 1β,小神经胶质细胞可能有不利影响在这些文化变化从一个保护性促炎的方法(42,43]。
它曾表明,暴露在高葡萄糖增加TNF表达(37]。肿瘤坏死因子受体1的封锁,这是表达的视网膜神经细胞,防止高glucose-induced细胞死亡。此外,它表明,肿瘤坏死因子的分泌和单核细胞趋化蛋白1鼠皮质小胶质细胞,引发了暴露于高葡萄糖,是由活性氧产量和NF -κB途径激活,这可能是神经损伤和糖尿病脑病的发病机制(44]。此外,IL-1RI-deficient老鼠免受diabetes-induced视网膜病理(45),表明il - 1β信号可能发挥关键作用在糖尿病性视网膜病变的发展。考虑到IL-1RI il - 1的关键控制点β活动,阻止IL-1RI活动应该被视为一个可能的治疗糖尿病视网膜病变的治疗策略。在视网膜上,穆勒活化的小胶质细胞和细胞反应不是独立的而是描述涉及双向反馈信号,帮助启动和传播协调适应性反应(46]。因此,在这项研究中,细胞增殖的变化和表达的特异性标记表明有适应性反应可能有助于抑制神经细胞死亡的指导和放大炎症过程,以恢复和维持体内平衡在神经细胞培养。
5。结论
总之,我们的研究结果表明,高葡萄糖增加il - 1β在视网膜细胞培养生产。此外,我们发现高葡萄糖和il - 1β以不同的方式影响macroglial和小胶质细胞。高葡萄糖减少小胶质和macroglial扩散,而il - 1β增加他们的扩散。这些显然是对立的影响可能与il - 1的水平β。当细胞暴露于高葡萄糖,il - 1的水平β达到显著降低比较的条件,当细胞暴露于il - 1β只有。其他可能的解释可能是不同的曝光时间il - 1β(7天与24小时接触)或高葡萄糖的影响细胞周期阻滞可能重叠的潜在增殖影响il - 1β。
因为overactivation视网膜小胶质细胞可能产生不良的影响,限制了il - 1β介导炎症过程可能是一个机制来预防糖尿病视网膜病变的进展。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Filipa。巴普蒂斯塔和西莉亚a Aveleira同样这项工作。
确认
这项工作是支持的基础科学和技术(FCT)、葡萄牙(SFRH /桶/ 86830/2012;SFRH / BD / 35961/2007;SFRH / BD / 30235/2006;SFRH /桶/ 111710/2015;SFRH /桶/ 73942/2010;SFRH / BD / 18827/2004),战略项目PEst-C /分/ ui3282/2011 - 2013和UID / NEU / 04539/2013 (FCT,葡萄牙,COMPETE-FEDER) COMPETE-FEDER (poci - 01 - 0145 -菲德尔- 007440),先涛公司2020支线运营项目(Centro - 01 - 0145 -菲德尔- 000008:BrainHealth 2020)。