溶血磷脂酸触发细胞凋亡在HeLa细胞通过肿瘤的上调坏死因子受体超家族成员21

抽象的

溶血磷脂酸（LPA），天然存在的生物活性磷脂，激活G蛋白偶联受体（GPCR），导致不同的细胞事件，包括细胞存活和细胞凋亡的调节。尽管信号通路介导LPA-调控细胞生长和存活的广泛的研究，基础LPA的凋亡作用的机制在很大程度上仍然不清楚。在这项研究中，我们研究了在HeLa细胞这个问题。我们的数据表明LPA诱导的HeLa细胞在病理浓度的TNFRSF21的表达（肿瘤坏死因子受体超家族成员21）的伴随上调，也称为死亡受体数6的细胞凋亡（DR6）参与炎症。此外，治疗LPA受体（LPAR）拮抗剂细胞废除由LPA的DR6上调。LPA诱导的DR6表达也通过百日咳毒素（PTX），GPCR的抑制剂，并且通过PI3K，PKC，MEK和ERK的抑制剂废除。有趣的是，LPA诱导的DR6表达特异性阻断PKC的显性负形式δ（PKC.δ-DN）。LPA诱导的DR6表达也显着地通过ERK或CREB敲低抑制。这些结果表明MEK / ERK途径和转录因子CREB居间LPA诱导的DR6表达的活化。更有趣的是，DR6使用siRNA方法的显着敲低衰减LPA诱导的凋亡。总之，我们的研究结果表明，在HeLa细胞中LPA诱导的细胞凋亡是由DR6表达的上调介导的。

1.介绍

溶血磷脂酸（1-或2-酰基 - 溶血磷脂酸，LPA）是天然存在的生物活性磷脂。Under normal physiological conditions, LPA is present at a low level in plasma (~100 nM) [1]，其浓度在组织损伤及发炎部位升高[1，2］.LPA是在磷脂生物合成的细胞膜中产生的。LPA还通过几种细胞类型产生细胞外，包括活性血小板，白细胞，上皮细胞，神经元细胞和肿瘤细胞[3.］.越来越多的证据表明LPA在各种炎症性疾病中发挥作用[4- - - - - -6］.LPA调节各种发育，生理和病理生理过程，包括细胞运动性，浸润，增殖，存活和生长因子的产量[7，8通过G蛋白偶联受体(GPCR)检测。血小板衍生LPA在组织再生和创面愈合中发挥重要作用[9，10］.LPA也用作趋化促进各种类型的人类癌细胞[能动性11］.最近的研究表明，肿瘤细胞刺激活化的血小板产生LPA，从而促进肿瘤生长和细胞因子介导的骨破坏[12，13]，而LPA受体的特异性抑制消除了癌细胞对含LPA的恶性腹水反应的迁移[14］.LPA受体的表达增加与侵入性的卵巢癌细胞中增加的水平有关[15，16］.因此，LPA在肿瘤起始和进展中具有多种生物活性，包括增加细胞存活、血管生成、侵袭和转移。矛盾的是，LPA也诱导某些细胞的凋亡，如神经细胞[17来自不同组织的上皮细胞[18- - - - - -20.]、髓系祖细胞、海马神经元和PC12细胞[3.］.然而，LPA诱导细胞凋亡的机制尚不清楚。

死亡受体6（DR6）也称为TNFRSF21，是具有具有细胞质死亡结构域的肿瘤坏死因子（TNF）受体家族的相对较新的成员。以前的研究表明，哺乳动物细胞中DR6的异位表达诱导细胞凋亡[21］.我们最近的研究表明，DR6通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡[22］.在目前的研究中，为了确定LPA诱导凋亡的机制，我们惊奇地发现LPA通过上调死亡受体DR6在HeLa细胞中的表达来诱导凋亡。此外，我们的研究结果强烈表明，PI3K/PKC/MEK/ERK途径和转录因子CREB的激活是lpa诱导DR6表达上调和凋亡的原因。

2。材料和方法

2．1.试剂，化学品和抗体

抗DR6抗体为Santa Cruz公司（圣克鲁斯，CA）购买。PKC的荧光抗体α/β, PKCε, PKCζ/λ、PKC-delta、MEK、ERK1/2、p90RSK、CREB、cleaved caspases 9,7,3和PARP购自Cell Signaling Technology (Danvers, MA)。LPAR1抗体购自Cayman Chemical (Ann Arbor, MI);LPAR2和LPAR3抗体来自LifeSpan BioScience公司(Seattle, WA)。LPA(类别编号857130，水溶性)和LPS来自Avanti极性脂类(Alabaster, AL)。肿瘤坏死因子-α，血管紧张素II，PMA，胰岛素，凝血酶，NGF-β、Ro 31-8220 (PKC抑制剂)和SB203580 (p38抑制剂)购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO)。百日咳毒素(PTX)、UO126和GF10293X来自Biomol International (Plymouth Meeting, PA)。Wortmannin (PI3K抑制剂)和Ki16425 (LPA受体拮抗剂)来自Cayman Chemical (Boston, MA)。ERK和CREB siRNA来源于Cell Signaling Technology。DR6 siRNA购自Santa Cruz Biotechnology (CA)。JNK抑制剂购自Calbiochem (Billerica, MA)。MTT细胞活力检测试剂盒购自R&D System公司(Minneapolis, MN)。TUNEL试剂盒购自美国罗氏应用科学公司。腺病毒载体构建试剂盒来自Qbiogene。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、修饰酶等克隆工具均购自New England Biolabs或Promega。 All other chemicals were purchased from Sigma-Aldrich or other brand companies.

２.２.细胞培养与处理

HeLa细胞在DMEM中培养，用10％DMEM和抗生素（青霉素/链霉素）。细胞饥饿LPA处理之前16小时或作为在每个实验中所指示。Inhibitors were usually pretreated for 30 min followed by LPA treatment except the PTX pretreatment for 15 hours.

２.３.北部的污点

如前所述进行Northern blot [23］.用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA，并进行甲醛-琼脂糖凝胶电泳。RNA转移到尼龙膜(Amersham Biosciences)，紫外交联并与dctp标记的444-bp片段杂交(见补充图2，在补充材料在线https://doi.org/10.1155/2017/2754756）人DR6 cDNA。使用18秒和28S rRNA作为内部对照。使用图像J软件量化杂交带的强度。

２.４.免疫印迹

Western blot如前所述[24］.简而言之，用冷PBS洗涤细胞一次，立即用含50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8 M尿素，5%的裂解缓冲液裂解细胞β- 甲丙醇，2％SDS，0.2 mm NAF，0.1mm NA₂签证官_3.和蛋白酶抑制剂（Roche）。蛋白质浓度通过BCA试剂盒（Fisher Scientific公司）为等量的总蛋白加载而确定的。蛋白质在Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶分离，并转移至PVDF膜（Fisher Scientific公司），然后用不同的抗体探测和通过ECL试剂显影。

2.5。PCR，逆转录PCR，和qPCR

设计人LPAR1、LPAR2、LPAR3的PCR引物进行常规PCR。设计DR6引物扩增人DR6信息RNA，进行逆转录(RT-) PCR。为DR6设计了引物进行定量PCR (qPCR)分析。所有用于基因扩增的引物及相关对照物均在补充表1中补充。使用Bio-Rad热循环仪进行常规和逆转录PCR，程序如下:95°C 2 min，然后95°C 15 s, 55°C 30 s, 72°C 45 s, 32个循环，然后在72°C延伸7 min。逆转录PCR的周期控制在15 ~ 20个周期，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。定量PCR按既往报道进行[25］.简而言之，qPCR混合物加热到95°C 3 min，然后使用MyiQ™系统(Bio-Rad)在95°C 30 s、57°C 30 s和72°C 1 min下进行40个循环。测定每个样本的循环阈值(Ct)值。所有Ct值均归一化到内控基因β肌动蛋白。以Ct值确定DR6 mRNA的相对表达量，用公式计算．

2.6。Adenoviral感染

将具有不同显性阴性(DN) PKC亚型和DR6的腺病毒滴定，并在50倍MOI(感染多重性)下加入细胞培养24小时。

2.7。siRNA下调DR6、ERK和CREB的表达

通过siRNA技术下调ERK和CREB的表达，按照供应商提供的方案进行。进行了两轮siRNA处理，以获得更好的敲除效率。

2.8。MTT法和TUNEL法

在不同的浓度和时间点用LPA处理细胞，并按照供应商的建议进行MTT检测。采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT-)介导的dUTP切口末端标记法(TUNEL)， 25μmlpa 24小时，固定染色。图像是用配备数码相机的奥林巴斯荧光显微镜捕获的。

2.9。统计分析

所有实验至少重复三次。Western blot、Northern blot和PCR/ qpcr的图像条带使用Image J软件(NIH网站)进行定量。数据以均数±标准差表示。使用Prism软件进行统计分析，比较两个学生的差异-test（两组）或单向ANOVA（≥HROW组）。一种小于0.05的值被认为是一个显著差异。

结果

3．1.LPA诱导HeLa细胞凋亡和DR6表达

为了检测LPA是否能诱导细胞凋亡，我们用不同浓度的LPA处理HeLa细胞48小时。采用MTT法和TUNEl法检测lpa诱导的HeLa细胞凋亡。如图所示1(一)和1 (b)MTT法检测细胞活力的降低和tunel阳性细胞数量的增加，表明凋亡效应明显呈剂量依赖性，在10时达到最低水平μ.LPA处理的M个。LPA的HeLa细胞中的促凋亡作用被证实与细胞凋亡信号传导蛋白活化。如图所示1 (c)，LPA治疗（25和50 μM）Caspase-9，Caspase-7和Caspase-3活化和PARP切割显着增加。有趣的是，如图所示1 (d)，LPA的剂量依赖性促凋亡效应是伴随着DR6，TNF的最近鉴定的死亡受体超家族成员的表达的逐渐加力。治疗LPA没有改变DR5和TNFR1，同TNF的另外两个超家族成员的水平。

３．２．LPA以剂量和时间依赖性的方式增加DR6 mRNA和蛋白的表达

接下来，我们比较了不同促凋亡因子和生长因子对DR6表达的影响。对HeLa细胞进行各种刺激，包括0.1μM angiotensin II (AgII), 20 ng/mL insulin, 25 μ中号LPA，1 μg/mL LPS, 50 ng/mL NGF-β， 0.1单位/mL凝血酶，50 ng/mL TNF-α、100 ng/mL佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)。通过Northern blot检测DR6 mRNA在不同时间点的表达情况。如图所示2(一个)，只有TNF-α、PMA和LPA在7小时显著上调DR6表达。肿瘤坏死因子-α已经知道在几种癌症细胞系中诱导DR6 [26］.PMA也有报道在t细胞激活过程中上调DR6表达[27］.如图所示2（b），用25的Hela细胞DR6 mRNA表达 μM LPA短暂增加，在5-7小时达到峰值。如图所示2（c）， LPA以剂量依赖性的方式上调DR6 mRNA的表达，并在25-50时达到平台μM.该结果通过RT-PCR进一步证实(补充图1)。接下来，我们试图确定LPA是否以类似的时间进程调控DR6蛋白表达。如图所示2（d）, 25μM LPA treatment transiently increased DR6 protein expression in HeLa cells as early as 9 hr, with a peak level at 15–17 hr.

3.3。LPA受体1和3调解LPA诱导的DR6上调

我们的数据显示，LPA受体1-3 (LPAR1-3)在HeLa细胞中表达(图)3（a）和3（b））.为了确定LPAR在lpa刺激的DR6上调中的作用，我们用Ki16425 (3μM），一个LPA1 / 3拮抗剂之前添加LPA的。如图所示3（c）和3 (d)结果表明，Ki16425预处理细胞能明显抑制LPA诱导的DR6表达，提示LPA诱导的DR6上调是由LPA受体1和3介导的。

3．4．PI3K, PKC和MEK通路负责lpa刺激的DR6表达

如图所示4(一)在美国，LPA治疗显著诱导MEK、ERK和p90RSK磷酸化。为了确定LPA诱导DR6表达的机制，我们首先检测了百日咳毒素(PTX)的作用，它使LPA受体偶联的Gi/o型G蛋白失活[28，如图所示4(一)；PTX可以抑制lpa诱导的MEK、ERK和p90RSK的磷酸化。lpa诱导的MEK、ERK和p90RSK的磷酸化也受到PI3K抑制剂wortmannin、PKC抑制剂Ro 31-8220和MEK抑制剂U-0126的抑制(图)4(一)）.接下来，我们研究了这些激酶在lpa诱导的DR6表达中的作用。如图所示4 (b)r31 -8220是一种PKC亚型PKC的细胞渗透性抑制剂，它能强烈抑制lpa诱导的DR6 mRNA水平的升高α, PKCβ, PKCγ, PKCε．另一种PKC抑制剂GF 109203X也能显著抑制lpa诱导的DR6 mRNA的表达，但不如Ro 31-8220强。除PKC抑制剂外，MEK抑制剂U-0126和PI3K抑制剂wortmannin也显著抑制lpa诱导的DR6 mRNA表达。G蛋白抑制剂PTX对lpa诱导的DR6 mRNA表达也有抑制作用，但抑制程度较轻。另一方面，SB203580和JNK抑制剂抑制p38和JNK活性对lpa诱导的DR6 mRNA表达增加没有影响。总之，我们的结果表明PI3K/PKC/MEK途径介导lpa诱导的DR6表达。

3.5。PKC-Δ具体地介导LPA诱导的DR6表达

数据显示在图中4强烈建议PKC的激活在功能上参与了LPA诱导表达DR6。为了确定PKC的特定同种型，有助于LPA诱导的DR6表达，我们首先确定主要PKC亚型的LPA诱导的活化，PKCα/β, PKCε, PKCζ/λ, PKCδ．用25μM LPA在不同的时间，并通过Western blot检测PKC亚型的激活情况。如图所示5(一个)，经LPA处理后，检测的所有PKCs均被不同程度激活。其中，PKC的基础磷酸化水平较高α/β对LPA处理无显著影响。同样，PKC的磷酸化水平ε和PKCζ/λLPA治疗也有轻微的增加。另一方面，PKCδ处理后得到显着活化用LPA如通过在它的磷酸化水平的快速和强大的增加来确定。接着，我们确定对LPA诱导的DR6表达这些PKC亚型的显性负形式的表达的效果。如图所示5 (b)，显性阴性PKC表达α, PKCε, PKCζ对LPA诱导表达DR6没有影响。然而，PKC的显性负形式表达δ几乎完全阻止了LPA诱导的DR6 mRNA表达。我们的数据在一起强烈建议PKCδ是PKC的主要亚型，在功能上参与介导lpa诱导的DR6表达的信号通路。这些数据首次证明了PKC亚型特异性转录调控lpa诱导的DR6表达。

3.6。磷酸化的ERK和CREB参与LPA刺激的DR6表达

数据显示在图中4显示LPA诱导ERK和P90RSK的激活。以前的研究报告说，LPA可以通过ERK诱导P90RSK激活[29］.已知丝氨酸/苏氨酸激酶p90Rsk可直接磷酸化转录因子CREB (cAMP反应元件结合蛋白)[30.，31］.因此，我们认为，以确定是否LPA诱导的MEK-ERK-90RSK通路引线的激活CREB的活化和CREB是否参与LPA诱导的DR6表达。如图所示6(一)， LPA在很早就诱导了MEK和ERK1/2的激活。此外，LPA还以时间依赖性的方式强烈诱导转录因子CREB的激活。为了确定这些分子在lpa调控DR6表达中的作用，我们采用了siRNA方法。如图所示6 (b)， ERK和CREB的下调强烈阻断了lpa诱导的DR6 mRNA的表达。如图所示6 (c)，Western blot分析证实ERK和CREB的表达的有效击倒。正如所料，DR6的蛋白水平在ERK-和CREB敲低细胞中显着减少。这些观察结果表明LPA诱导表达DR6通过PKC的活化δ-ERK信号通路及其后续CREB的激活。

3.7。siRNA下调DR6可减弱lpa诱导的细胞凋亡

接下来，我们进一步证实了DR6在LPA诱导的细胞凋亡的作用。首先，要确定DR6的凋亡活性，HeLa细胞感染表达组成积极DR6腺病毒。如图所示7(一)，DR6表达腺病毒的感染导致剂量依赖性细胞凋亡，由PARP的切割确定，细胞凋亡的指标[32]，以及caspase-3的活化。作为对照，在表达LacZ蛋白的病毒感染的细胞中未检测到凋亡迹象。综上所述，这些结果清楚地表明，DR6过表达可诱导HeLa细胞凋亡。接下来，为了确定LPA上调DR6表达是否与LPA诱导的细胞凋亡有关，我们测定了DR6敲低对LPA诱导的细胞凋亡的影响。如图所示7 (b)如预期的那样，用DR6特异性siRNA治疗强烈抑制DR6表达，如通过DR6蛋白水平的降低确定。有趣的是，DR6-siRNA治疗也强烈抑制LPA诱导的细胞凋亡，通过降低胱天蛋白酶活化和PARP切割而确定。这些结果强烈表明LPA诱导的细胞凋亡是通过诱导DR6表达的介导的。

4.讨论

LPA是一种简单的生物活性磷脂，存在于血浆和脑脊液(CSF)等生物体液中。血液中的LPA浓度从0.1到0.1不等μM在血浆中，最多10μM在血清中[33］.在这项研究中，大多数实验使用25进行 μM LPA，在体内动脉粥样硬化病变中发现的病理浓度范围内[34]及急性心肌梗塞[35］.该浓度范围已被用于确定LPA在其他细胞类型中的凋亡活性，如上皮细胞[18和神经元细胞[17］.

LPA通过其G蛋白偶联受体，调节不同的细胞过程，包括细胞存活和在许多不同细胞类型的细胞凋亡28］.LPA作为细胞存活因子的作用已得到很好的研究;然而，由LPA诱导凋亡仍不清楚的机制。在目前的研究中，使用的药物抑制剂，显性负性突变，和siRNA的方法，我们探索了底层LPA诱导的细胞凋亡的机制（S）。为此，我们的研究结果揭示了一些有趣的发现。首先，在LPA浓度病理HeLa细胞诱导的细胞凋亡。其次，LPA治疗导致DR6的显着上调表达。三，击倒DR6的强烈阻止LPA诱导的细胞凋亡。第四，LPA受体1和3拮抗剂抑制LPA诱导的DR6表达。最后，抑制各种激酶的，PI3K / PKC / MEK / ERK，和它们的调节的转录因子CREB强烈抑制LPA诱导的DR6表达。 Together, these results strongly suggest that LPA-induced apoptosis is mediated by upregulation of DR6 expression via activation of PI3K/PKC/MEK/ERK pathways leading to the activation of the transcription factor CREB, which controls the expression of DR6.

在本研究中，第一个和新的发现是DR6作为介导lpa诱导凋亡的效应体的鉴定。DR6是TNF死亡受体家族中一个相对不太明确的成员。到目前为止，DR6仍然是孤儿受体，还没有明确的同源配体。我们目前对DR6的细胞、生理作用和生物学功能的了解大多来自于研究DR6基因在小鼠中的消融作用或DR6在培养细胞中的异位表达[36］.最近的研究报告说，DR6表达在神经变性疾病中上调，例如阿尔茨海默病（AD）和肌萎缩侧硬化（ALS）和DR6的上调表达可能有助于这些神经变性疾病的发病机制[37，38］.有趣的是，LPA也与凋亡神经变性有关[17，39- - - - - -41];然而，LPA诱导凋亡细胞死亡的机制尚不清楚。在本研究中，我们的数据首次证明了LPA上调DR6的表达，而DR6的下调强烈抑制了LPA诱导的细胞凋亡，这强烈提示LPA通过上调DR6的表达来诱导细胞凋亡。因此，我们发现LPA诱导的细胞凋亡是由DR6表达上调介导的，这表明LPA可能通过提高DR6蛋白水平而促进神经变性。

本研究的第二个有趣发现是发现lpa诱导的DR6表达是由转录因子CREB的激活介导的。有研究报道，DR6的外源性表达可以模拟配体激活，触发配体不依赖的下游凋亡信号级联[21，22］.然而，尽管DR6的过度表达导致凋亡细胞死亡，但已经发现DR6的表达水平在人类的几种肿瘤中升高，并且通过激活NF-Kb来调节DR6的升高表达[26］.此外，这些作者还证实了DR6的表达可以被肿瘤坏死因子-诱导α(肿瘤坏死因子-α）治疗和TNF-α-诱导的DR6表达也由NF-kB的激活介导[26］.与此相反，最近有报道称NF-kB的激活抑制(E)-2,4- bis (p-羟基苯基)-2-butenal诱导的结肠癌细胞DR6表达[42］.这些有争议的意见可能会导致从使用不同的实验系统，如不同细胞系和不同的刺激，在这些研究中。有趣的是，在目前的研究中，我们的数据表明，LPA诱导的DR6表达通过CREB的活化所介导。我们的发现进一步支持的假设，不同的刺激激活不同的途径和导致的支配DR6表达不同的转录因子的激活。

LPA是众所周知的存活因子。但是，它也被报道，LPA可以在某些类型的细胞促进细胞凋亡，包括上皮细胞[18，分化神经元模型PC12细胞[39和海马神经元[40］.对于LPA在促进细胞存活和凋亡方面的作用看似矛盾，一种可能是用于诱导凋亡的LPA浓度高于用于细胞存活的LPA浓度。例如，促进细胞存活的LPA浓度在10μ米范围内(43，44］.另一方面，用于诱导细胞凋亡的LPA的浓度大部分高于20 μ米(17，18，39，40］.其他可能性是不同的细胞类型表达了LPA受体的不同同种型，并且具有可变的基因表达和由LPA信号改变的调控模式，如先前的回顾[3.］.

综上所述，我们已经确定了lpa诱导凋亡的信号通路。该通路由LPA受体及其下游PI3K/PKC/MEK/ERK信号级联介导。目前研究中最有趣和新颖的发现是DR6是介导lpa诱导的细胞凋亡的关键因素。LPA作为生存因子的作用机制已被广泛研究。然而，LPA调控细胞凋亡的机制尚不清楚。因此，我们发现LPA可以刺激DR6的表达，导致细胞凋亡，这将有助于更好地理解LPA调节细胞凋亡的机制，并识别新的治疗靶点。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

董云洲、吴勇对这项工作贡献相当。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH) R01AG026640、R21 AG039596、阿尔茨海默氏病协会拨款、美国卫生援助基金会(AHAF, to X. Xu)拨款、美国国立卫生研究院(NIH)拨款HL107466 (to M-Z Cui)、俄克拉何马州先进科学技术中心(OCAST)拨款AR11-043、以及由AHA 12SDG8760002(授予董永)和部分由加速卓越转化科学试点基金G0812D05、美国国立卫生研究院(NCI, NIMHD)试点项目U54 CA143931和U54MD0075984以及NIH/NCI SC1CA200517(授予吴永)提供的资助。

补充材料

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