文摘

识别介质引起小胶质细胞激活和移情的非编码微rna (microRNA)液对解剖基础神经退化的机制至关重要。我们用脂多糖(LPS)诱导N9小胶质细胞激活探索新的生物标记/信号通路和确定炎症microrna (inflamma-miR)细胞及其提取液。Upregulation伊诺和mhc ii的差别(M1-markers)和对这些精氨酸酶1,FIZZ1 (M2-markers)和CX3CR1 (M0 / M2极化)证实了开关的N9 LPS-treated细胞M1表型,作为小胶质细胞/巨噬细胞的描述。细胞显示增加扩散,TLR4 / TLR2 / NF -激活κB通路,和增强的吞噬作用,通过调节MFG-E8进一步证实。我们发现NLRP3-inflammasome激活这些细胞,可能占增加细胞外的细胞因子HMGB1的内容和MMP-9我们已经观察到。我们首次展示,inflamma-miR分析(调节mir - 155和mir - 146 - a +表达下调mir - 124)在M1极化N9细胞,激活巨噬细胞和小胶质细胞被别人注意到,复制的导出液,可能调节受体细胞的炎症反应和传播过程。数据显示,LPS-treated N9细胞像M1极化小胶质细胞/巨噬细胞,同时为药物研发提供新的目标。特别是研究收益率新颖见解exosomal循环microrna的重要新兴治疗方法针对小胶质细胞在神经炎症激活。

1。介绍

小胶质细胞是一种独特的细胞群在中枢神经系统(CNS)作为他们的后代骨髓起源和通常被认为是大脑中的居民免疫细胞(1]。他们构成了大约10 - 20%的神经胶质细胞群和不断监测周围环境,作为中枢神经系统内稳态的传感器2,3]。小胶质细胞迅速改变自己的形态、基因表达和功能性能在任何威胁到组织内稳态,获得一个激活的表型,为每个刺激和中枢神经系统是一个自适应过程特定地区(4]。越来越多的证据支持他们参与突触的发展和改造(5),强调小胶质功能延伸免疫防御机制。虽然小胶质细胞是脑内稳态的保护者,如果长期或慢性刺激他们可能成为有害的神经元数量。事实上,加剧了阶段的神经毒性可以进步病理条件包括神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症或帕金森病(6),小胶质细胞积极贡献和神经元变性和神经炎症7]。

尽管小胶质细胞反应的多样性,他们的激活已被公认为特征的表型经典描述为巨噬细胞(8]。监督者/无极性表型,也称为M0,描述了预警但不活化的小胶质细胞的不断筛选环境(9]。几乎独家小胶质fractalkine受体CX3C趋化因子受体1 (CX3CR1),是高度表达M0表型(10),但,除了小胶质细胞的维护监测、CX3CR1 / fractalkine相声也很重要在促进迁移激活细胞(11]。M1表型或经典活化的小胶质细胞可以诱导脂多糖(LPS)或移行细胞(IFN -γ)增加生产促炎细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶(MMPs),以及活性氧和nitrosative物种(ROS和RNS resp),其他(12]。M1小胶质细胞与神经毒性相关的表型与增强的主要组织相容性复合体II级(mhc II),诱导一氧化氮合酶(伊诺/ NOS2),和interleukin-1β(il - 1β)标记。另一种M2表型,损害有关决议(13)可能包括几个亚型(7),是由il - 4、il - 10和转化生长因子-β(TGF -β)。精氨酸酶1 (__arg1)发现,在炎症区1 (FIZZ1)和Ym1 M2极化的识别标记14]。然而,尽管这些标记物的表达是用来区分小胶质细胞表型,还有很多东西要学习小胶质细胞特定功能分化的决定因素。

通常的刺激的toll样受体)已知信号级联触发核转录因子的易位(NF -κBκB)进入细胞核和促炎基因的表达15),涉及inflammasome的激活。然而,它的激活小胶质细胞的神经毒素可能是未知的。Inflammasome介质组成nod样受体家族,pyrin域包含3 (NLRP3)和caspase-1负责地震和il - 1的乳沟βproforms [16]。最近,这是显示的释放alarmin高机动组框1 (HMGB1)是由NLRP3 inflammasome激活(17和构成信号激活小胶质细胞18),尽管监管过程仍不清楚。

与炎症介质的释放,小胶质细胞迁移和吞噬细胞反应的一部分损伤。蛋白质的牛奶脂肪globule-EGF因子8所示(MFG-E8)承认磷脂酰丝氨酸(PS)凋亡的神经元,从而使小胶质吞噬作用[19]。然而,其具体规定在不同的具有挑战性的情况下仍然未知。

大部分已经确认了这些炎症通路不同研究与小胶质细胞/巨噬细胞主要的文化。由于这种文化时间消费和减少产量的实验分析,所有收集到的信息对小胶质细胞炎症介质是支离破碎的。因此,我们在这里接受了一个集成的评估研究几种炎症信号通路导致小胶质细胞M1的upregulation偏振相关生物标志物的差别,对这些小胶质细胞N9的M2亚型在有限合伙人的待遇。N9细胞永生化细胞所产生的胚胎的主要文化从腹侧中脑和大脑皮层ICR / CD1小鼠使用致癌小鼠逆转录病毒携带v-myc或禽流感v-mil致癌基因的逆转录病毒MH2 [20.]。这些细胞已经被优先使用的简便的操作,但只有有限数量的炎症介质和基因被确定在N9细胞,尽管同样应对有限合伙人主要小胶质细胞来源于同一个鼠标应变(21]。

小分子核糖核酸(microrna)最近出现了炎症的关键调节因素和介质的小胶质细胞/巨噬细胞极化22]。实际上inflamma-miRs, mir - 155和mir - 146 a与小胶质细胞极化到M1。虽然第一增强了促炎反应,第二个作为负调节(23)是必不可少的在阻止过度的炎症。面对面,mir - 124、miR-21和mir - 145与抗炎反应抑制M1表型极化(24]。然而,接受这样的小胶质细胞表型监管是相当复杂和mir - 146,作为一个例子,可能会增加在M1小胶质细胞极化也在瘠薄/衰老巨噬细胞(25),而mir - 124已被确定在监视的小胶质细胞,以及M2小胶质细胞(26]。最近解决另一个问题是特别重要的液持续炎症。液小泡(~ 100 nm)通过内吞作用的形成过程和发布multivesicle身体与质膜融合(27,28]。他们一直与细胞间交流,即使在很远的地方,直接将信使rna,蛋白质,和microrna,最后被必不可少的调节基因表达的受体细胞。

自从小胶质细胞通路的开关向M1表型并不完全了解,我们首先N9小胶质细胞的极化特征到M1亚型在有限合伙人曝光,基于小胶质细胞/巨噬细胞M1和M2生物标志物,和顺向小胶质细胞固有的功能,如吞噬作用和趋化性。最近一直在关注microglia-dependent inflammasome激活(29日,30.),但没有数据可用LPS-treated小胶质细胞,这就是为什么我们评估了inflammasome multiprotein复杂的在我们的模型中。一旦成为强有力的microrna fine-tuners神经炎症的31日],表示运输时调节炎症反应液中主要骨骨髓来源树突状细胞(32),我们决定在LPS-polarized细胞和评估他们的表现在他们的导出液来扩展我们的知识等问题,仍然很少探讨小胶质细胞主要文化和未知的N9细胞。实际上,exosomal microrna目前正在广泛研究疾病的生物标志物和理解它们是如何加载到液和传递给特定的受体细胞可能有助于开发治疗方法来调节固有细胞的功能。这里,我们进一步澄清小胶质细胞炎症介质和目标,一旦调制可能限制小胶质细胞的激活在神经退行性疾病,如阿尔茨海默病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

2。材料和方法

2.1。N9细胞培养和治疗

从特蕾莎修女Pais N9细胞株是一份礼物(葡京大学分子医学研究所、葡萄牙)。细胞(8.3×10⁴细胞/厘米²镀)裸12 -或6-well组织培养板(橙色科学、Braine-l 'Alleud,比利时)在培养基(RPMI媒体配备胎牛血清(的边后卫)(10%)和谷酰胺(1%)和抗生素青霉素和链霉素(1%)],并成长为实验前融合。没有任何实验中观察到细菌污染。诱导N9细胞反应我们使用300 ng / mL的脂多糖(LPS,大肠杆菌Calbiochem O111: B4, 437627年,达姆施塔特,德国)稀释在基底媒体24 h,如崔和他的同事所述33]。响应LPS-treated细胞与参与小胶质细胞(控制)。

2.2。确定细胞死亡

Phycoerythrin-conjugated膜联蛋白V (V-PE)和7-aminoactinomycin-D (7-AAD)混合物(番石榴Nexin®试剂,# 4500 - 0450,微孔,Billerica,妈,美国)被用来确定可行的百分比,early-apoptotic和late-apoptotic /坏死细胞,流式细胞术。孵化后,附着小胶质细胞被收集的胰蛋白酶化和添加到细胞中孵化的媒体。离心后,颗粒细胞在PBS resuspended包含1%的牛血清白蛋白(BSA),沾染了番石榴Nexin试剂根据制造商的指示,并分析了在一个番石榴easyCyte 5 ht流式细胞分析仪(番石榴Nexin软件模块,微孔),像往常一样在我们的实验室34]。两个读数为每个样本进行。

2.3。定量rt - pcr

孵化后,手机媒体被收集和细胞与试剂盒®(美国生活儿童学,卡尔斯巴德,CA)使用细胞拳击手在实验室中实现(35]。那时总RNA提取N9细胞使用试剂盒试剂方法根据制造商的指示和量化使用Nanodrop nd - 100分光光度计(Nanodrop技术,威明顿、德、美国)。执行转换成cDNA RevertAid H -合成第一链cDNA工具包(美国马热科学、沃尔瑟姆)。定量rt - pcr(存在)是由使用β肌动蛋白作为一种内生控制规范化表达水平。用于引物的序列表中表示S1(补充数据,在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6986175)。存在在7300年完成实时PCR系统(应用生物系统公司,生活技术)使用SYBR绿色qPCR大师混合(热科学)。96孔板的执行中存在与每个样本一式三份,和没有模板控制包括每个放大。存在优化的条件下实现:52°C 2分钟紧随其后的95°C的10分钟,最后40周期在95°C 0.15分钟和1分钟62°C。为了验证的特异性扩增,melt-curve分析,放大后的协议。非特异性PCR的产品没有发现在任何情况下。使用ΔΔCT相对信使rna浓度计算方程。microrna的分析、转换的cDNA,普遍实现了互补脱氧核糖核酸合成装备(Exiqon、Vedbaek、丹麦)所描述的卡多佐et al。36),遵循制造商的建议。的miRCURY LNA™通用RT microrna的PCR系统(Exiqon)与预先设计引物结合使用(Exiqon),表示在表S1(补充数据),使用SNORD110作为参考基因。聚合酶的反应条件包括激活/变性和well-factor决心在95°C 10分钟,其次是50放大周期在95°C为1分钟10年代和60°C(升温1.6°/ s)。使用ΔΔCT相对信使rna浓度计算方程。两个读数为每个样本进行。

2.4。免疫印迹分析

孵化后,手机媒体被收集和细胞与细胞裂解缓冲(美国细胞信号,贝弗利,MA) + 1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSFσ)像往常一样在我们的实验室37]。短暂,总细胞提取细胞溶解5分钟在冰用颤抖,收集细胞拳击手,用20秒。然后溶解产物是离心机,享年14000岁10分钟在4°C,和上层的收集和储存在−80°C。核提取准备像往常一样在我们的实验室37]。蛋白质含量在细胞外的媒体是通过使用三氯乙酸沉淀在10% (v / v)的丙酮溶液。离心后的15000年10分钟在4°C,包含10毫米的颗粒在丙酮洗二硫苏糖醇resuspended裂解缓冲和储存在−80°C。蛋白质总浓度和核提取物,以及细胞外介质,确定使用蛋白质分析工具包(美国Bio-Rad大力神,CA)根据制造商的规格。然后,等量的蛋白质受到sds - page和转移到硝化纤维膜。阻塞后5% (w / v)脱脂牛奶溶液,膜与初级孵化抗体(补充数据,表S2)稀释5% (w / v) BSA在一夜之间在4°C,紧随其后的是二级抗体山羊anti-rabbit HRP-linked (sc - 2004 1: 5000年,圣克鲁斯生物技术®、钙、美国)和山羊anti-mouse HRP-linked (sc - 2005 1: 5000年,圣克鲁斯生物技术)稀释在屏蔽解决方案。化学发光检测是由使用LumiGLO®试剂(细胞信号)和乐队在ChemiDoc可视化™XRS系统(Bio-Rad)。分析了蛋白质的相对强度乐队使用图像实验室™分析软件(Bio-Rad)。一个阅读了每一个样本。

2.5。免疫细胞化学

免疫荧光检测,N9细胞固定刚做好的4% (w / v)多聚甲醛在PBS和执行标准的采用技术如前所指出[37]。一夜之间,短暂,细胞被孵化在4°C主要抗体:兔子anti-Iba1(和光,1:250年,019 - 19741,kouichi Wako纯化学工业有限公司,大阪,日本),兔子anti-NF -κ200 B(1: 500或1:核提取物、sc - 372,圣克鲁斯生物技术),和山羊抗- ki - 67(1: 50,圣克鲁斯生物技术、sc - 7846)。二级抗体孵化2 h在室温下是山羊anti-rabbit Alexa萤石488年,山羊anti-rabbit Alexa萤石594年,抗体和兔594(1:1000年,英杰公司公司™,卡尔斯巴德,CA,美国)。细胞核染色了赫斯特33258年染料(蓝色,Sigma-Aldrich)。荧光是可视化使用AxioCam HR相机适应一个AxioScope A1®显微镜(德国蔡司)。合并后的10个随机的紫外和荧光显微图像领域被使用禅宗2012收购了每个样本(蓝色版,蔡司)软件。原始的放大使用400和630 x。

N9小胶质细胞的形态特征,我们使用了粒子测量分析ImageJ(美国国家卫生研究院的1.47 v)自动测量二维面积,周长,和Feret单一直径小神经胶质细胞后Iba-1疣状,被认为是有价值的附加参数来评估小胶质细胞的形状(38]。如图S1表示,我们观察到有分枝的N9小胶质细胞呈现低数量的影响相比,主要培养小胶质细胞(图印地)获得小鼠皮层(39]。然而,我们可以观察到不同的N9小胶质细胞形态,包括圆形/椭圆形(图印地),有分枝的2或3流程(图S1C-D)和变形形状,完全没有影响或较厚和短分支(图S1D-E)。易位NF -κB从细胞质到原子核是由量化的NF -的数量κB-positive核和归一化细胞的总数。小胶质细胞的增殖能力进行评估,我们量化细胞的数量显示ki - 67在细胞核中表达。ki - 67存在于细胞核在细胞周期的所有阶段而缺席的静止期(G0)。

2.6。亚硝酸盐水平的量化

没有估计水平评估亚硝酸盐(NO的浓度₂),稳定的最终产品从没有新陈代谢,格里斯在媒体文化的方法,如我们出版40]。短暂,细胞外媒体自由细胞碎片在96年与格里斯试剂混合,组织培养板10分钟在黑暗中,在rt,吸光度在540 nm决心使用标。为每个分析使用校准曲线。所有样品都是在重复测量和使用平均值。两个读数为每个样本进行。

2.7。明胶Zymography

MMP-9 MMP-2活动确定N9细胞外媒体通过执行sds - page zymography 0.1%明胶- 10%丙烯酰胺凝胶,nonreducing条件下,如前所述41]。经过电泳,凝胶水洗1 h和2.5% triton - x - 100 50毫米三包含5毫米CaCl pH值7.4₂和1μM ZnCl₂,删除SDS凝胶和复性MMP的物种。诱导凝胶溶解,凝胶在37°C的环境发展中缓冲区(50毫米三pH值7.4,5毫米CaCl₂,1μM ZnCl₂一夜之间)。酶活性分析,凝胶沾0.5%考马斯亮蓝r - 250 (Sigma-Aldrich)和30%乙醇使退色/ 10%醋酸/ H₂O (v / v)。白明胶酶活性,发现作为一个白色带蓝色背景,用计算机图像分析测量(图像实验室,Bio-Rad)。一个阅读了每个样本。

2.8。Caspase-1活动分析

caspase-1活动是由比色法(Calbiochem,达姆施塔特,德国)公布的美国(42]。简单,细胞被收获,用冰冷的PBS和细胞溶解30分钟在冰上裂解缓冲。caspase-1的活动是由酶在细胞溶解产物评估劈理的发色团衬底的机构,根据制造商的指示。蛋白酶的蛋白水解反应进行了试验包含2毫米Ac-YVAD-pNA缓冲区。孵化后的反应混合物,形成机构测量参考滤波器620 nm。一个阅读了每个样本。

2.9。小胶质细胞吞噬红细胞测定

评估N9小胶质细胞的吞噬能力,细胞被孵化为0.0025% (w / w)荧光乳胶珠子,直径1μm, 75分钟37°C和固定刚做好的4% (w / v)多聚甲醛在PBS。与兔anti-Iba1 N9细胞应用(和光)1:250年,019 - 19741,kouichi,和核与赫斯特33258年复染色染料(蓝色)。紫外和荧光图像的随机微观领域(原始放大:400 x)获得的每个示例使用禅宗2012(蓝色版,蔡司)软件。总吞噬细胞,每个细胞的摄取珠子数量统计与ImageJ软件确定吞噬细胞的百分比和平均每个细胞的摄取珠子数量(41]。

2.10。细胞迁移试验

细胞迁移试验中执行48-well microchemotaxis室(Boyden室、神经探针、马里兰州、美国)当我们发表(39]。简单地说,N9细胞在无血清RPMI resuspended和50μL细胞悬液放入每个顶级(2 - 4×10⁴细胞每)。井底部满心无血清RPMI(基础培养基),或与ATP (10µ米),有限合伙人(300 ng / mL)在基础培养基稀释。小胶质细胞被允许通过聚碳酸酯track-etch迁移6 h薄膜和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(神经探针)对解决油井底部。后来,细胞膜被冷甲醇和底部固定。在PBS细胞染色沾10% (w / v),刚做好的和过滤。总细胞数的数量在十微观领域与ImageJ软件(原始放大:100 x)获得观察完整使用徕卡IM50软件和徕卡DFC490相机(徕卡微系统公司位于德国),适应一个AxioSkope HBO50显微镜(蔡司)。对于每一个实验,至少有三个井每条件。

2.11。外来体隔离

从细胞外液得到媒体的N9细胞从控制或LPS-stimulated细胞,根据王et al。43),小的修改。简单地说,20毫升的细胞外媒体离心机在100010分钟去除死细胞和碎片另一离心16000紧随其后60分钟,单独的微泡(~ 1000 nm大小)。上层清液是通过恢复0.2µm过滤器移除水中的悬浮粒子和超L-XP100进一步离心机离心(美国加州贝克曼库尔特公司)在100000年为120分钟。这颗粒分数(液、大小~ 100 nm) resuspended PBS和在100000年再次离心为120分钟。最后的颗粒含液resuspended在裂解缓冲液内和RNA提取使用miRCURY隔离Kit-Cell (Exiqon),根据制造商的指示。简而言之,裂解液后,RNA是吸收硅矩阵,用推荐的缓冲区,并筛选了20µL提供洗脱缓冲的离心。互补脱氧核糖核酸的合成,rt - pcr进行如上所述。

2.12。动态光散射(DLS)测量

尺寸测量是在25°C Zetasizer Nano年代DLS装置(莫尔文仪器,伍斯特,英国)。上述的超速离心法过程后,每个样本在PBS稀释,读三次ζ筛选器纳米年代(1600年禅)评估收集粒子的直径。直方图的粒子的百分比与特定的直径计算使用DTS(纳米)7.03软件(莫尔文仪器)。数据代表平均每个样品测量。

2.13。统计分析

至少四个独立实验的结果表示为均值±s.e.m。对比LPS-treated N9细胞和参与细胞(控制)的所有实验都是通过双尾学生的以及或未配对以及与韦尔奇的修正,根据方差是否相等或不同,分别。比较两组以上的,即在形态特征、趋化性试验,和吞噬作用测试,是由单向方差分析后跟Bonferroni事后多重比较校正使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。的值被认为是显著的吗和非常重要。

3所示。结果

3.1。LPS-Treated N9小胶质细胞获得M1表型,Upregulation特定的M1-Markers,主要变形形态和增殖率增加

尽管小胶质的可塑性反应,小胶质细胞激活的不同子集以特定标记物的表达,正如前面提到的。此外,除了著名的促炎反应由TLR / NF-kB通路,小胶质细胞激活也可能意味着基因表达谱的改变不仅通过诱导特定基因的转录还表达下调非必需的功能。我们已经探讨了M1和M2的mRNA表达标记,以及fractalkine受体CX3CR1 N9小胶质细胞暴露在有限合伙人,在之前的研究没有完全记录。如图1N9的孵化小胶质细胞与LPS M1-markers导致表达增加Nos2和mhc ii的差别,同时促进对这些M2-markers__arg1和Fizz1(图1(一))。信使rna和蛋白质的表达水平有限合伙人CX3CR1减少被发现的曝光(图1 (b)和1 (c)、职责),表明降低患病率的细胞与监督者/抗炎作用,从而有利于M1极化小胶质细胞的主要代表。

形态变化和增加细胞密度已经表示microgliosis [44]。虽然不足以描述小胶质功能行为,这些参数说明小胶质细胞激活仍然有用。因此,我们另外进行了形态描述了使用小胶质细胞特定的免疫细胞化学标记Iba1,连同细胞面积、周长、直径和Feret [38]。如图2,我们的结果表明,N9小胶质细胞变化从圆形/椭圆形或分歧的形态变形形状,呈现完全没有影响或厚和较短的树枝,在大约75%的细胞()孵化有限合伙人(数字2(一个)和2 (b))。之前我们已经表明,被动孤立主要小胶质文化也显示类似的形态(39]。因此,区域、周边和Feret LPS-treated细胞(数字的直径增加2 (c),2 (d)和2 (e)、职责)。为了评估细胞密度,我们评估了Cd11b表达和细胞的数量呈现核ki - 67的表达。我们观察到增加Cd11b表达式(图2 (f))和更多的ki - 67阳性细胞核(数字2 (g)和2 (h)LPS-stimulated细胞)与控制样本。现在,考虑到N9小胶质细胞的细胞生存能力有限合伙人曝光后,我们发现可行的细胞的数量减少(从控制的84%到67% LPS-treated N9细胞,、表1),由于小胶质细胞数量的增加显示early-apoptotic特性。

3.2。M1极化N9小胶质细胞显示减少对化学引诱物迁移能力但显示增加吞噬作用和MFG-E8表达式

后确认N9的小胶质细胞M1分化细胞的典型特征,我们想知道是否有限合伙人可以修改他们的迁移能力。,我们已经进行了趋化性试验使用Boyden室,和迁移LPS-treated和参与小胶质细胞测试对知名化学引诱物,如ATP (10µ米)(3,9和有限合伙人(300 ng / mL)45]。参与N9细胞高度对ATP chemoattraction(~ 2倍增加,)相比,那些自由迁移的基础培养基和LPS-treated细胞显示变得反应迟钝(图3)。然而,需要注意的是,LPS-treated细胞显示相同的迁移能力参与小胶质细胞向基础培养基。有限合伙人透露chemoattractive容量较低相比,ATP (),观察ATP, LPS-treated细胞也会减少流动性相比没有暴露于LPS刺激。

当小胶质细胞吞噬属性的分析,对于清除残骸和消除病原生物体(46与有限合伙人),治疗减少细胞没有细胞内珠的数量(),同时增加那些摄取超过6珠()(数据4(一)和4 (b))。此外,我们能够观察到,第一次在这个模型中,24小时孵化与LPS诱导的表达和释放MFG-E8 N9细胞(~ 1.5 ~ 2倍,分别),表示通过免疫印迹分析总提取物和细胞外的媒体(分别地。,数据4 (c)和4 (d))。我们可能会假设LPS-treated加强吞噬细胞的能力作为防御机制尽管他们增加静止。

3.3。M1极化激活的小胶质细胞介导的炎症TLR2和TLR4 / NF-kB Inflammasome信号级联,HMGB1的释放

通过研究信号通路介导TLR / NF -κ激活,我们发现TLR4是转移到小胶质细胞的膜与LPS孵化,证明了增加糖化的表达形式(,图5(一个))。我们也注意到增加TLR2的表达式(,图5 (b))。因此,NF -κB是易位到细胞核,证明了~蛋白表达增加核分数倍(,图5 (c))和提高染色的LPS-treated N9相比小胶质细胞细胞核控制样本(数据5 (d)和5 (e))。NF -κB transactivation还演示了在活性小胶质细胞的主要文化39),涉及inflammasome激活(47,48)与成熟相关的小胶质促炎细胞因子il - 1β和地震caspase-1 [16,49]。因此,下一步是评估这样的级联事件N9小胶质细胞暴露于有限合伙人。如图5,有限合伙人的表达显著增强Nlrp3inflammasome(图5 (f),)以及IL-1beta(图5 (g),),地震-(图5 (h),在N9细胞)。inflammasome也观察到治疗N9的激活细胞(50),不灭的小胶质细胞(51,培养初级小胶质细胞(未发表的数据)与淀粉样β蛋白肽。此外,高caspase-1活动我们观察(图5(我),)进一步表明调解能力增加il - 1的乳沟β和地震proforms [49]。

M1极化小胶质细胞还与其他炎症介质的产生有关,如ROS和基质金属蛋白酶(12,13]。事实上,我们发现高浓度的MMP-9(~三倍,),但是不是MMP-2(数字6(一)和6 (b)、职责),这可能源于观察到的NF -κB激活(数据5(c) -5(e))证明MMP-9基因表达的调节,但不是MMP-2 [52]。没有被认为是信号分子和促炎介质。我们的研究表明,亚硝酸盐的浓度,间接表明水平不,是同样显著增强在细胞外介质(图6 (c))。

有限合伙人的促炎效应增强的内源性危险信号分子HMGB1发布的坏死细胞(53]。大多数研究报道HMGB1影响巨噬细胞和小胶质细胞激活18,54),但只有少数报告其增加表达在活化的小胶质细胞,在脑缺血后(55)和活性原代小胶质细胞培养(39]。此外,我们最近发现一个多2倍的基因和蛋白表达增加HMGB1 N9细胞治疗1µ米淀粉样β蛋白肽(50]。因此,我们研究了细胞和细胞外的模式分布HMGB1的炎症N9细胞。令人惊讶的是,我们观察到降低HMGB1蛋白表达在细胞溶解产物小胶质细胞激活的有限合伙人和核提取物(数字6 (d)和6 (e))。然而,一旦HMGB1被证明是大量释放到细胞外环境在病理条件下(54),我们决定评估其在细胞上清液。按照这个,HMGB1被发现在培养基中积累与LPS孵化N9小胶质细胞后24 h(~ 2倍增加,),如图6 (f)。这些结果表明,HMGB1 LPS-induced后迅速释放到细胞外空间小胶质激活。

3.4。微分表达式的Inflamma-miRs M1极化N9由有限合伙人小神经胶质细胞衍生的液囊完成

识别microrna的亚型随后N9细胞极化有限合伙人我们评估特定的炎症microrna的表达与小胶质细胞的激活有关,即mmu - mir - 155 - 5 - p (mir - 155),与M1表型相关,hsa - mir - 146 - 5 - p (mir - 146 - a)与修复、分辨率和hsa - mir - 124 - 3 - p (mir - 124),表示在监督者和抗炎小胶质细胞。这样inflamma-miRs以前中确定活性培养小胶质细胞(39]mir - 155和mir - 146发现在N9升高细胞在治疗淀粉样β蛋白肽(50]。

作为显示在图7与LPS诱导的表达升高,小胶质细胞刺激mir - 155 (~ 3,)和mir - 146 a(2倍,mir - 124的差别),而促进对这些基因的表达(0.4倍,)。这些数据支持的收购时所激活的小胶质细胞M1表型有限合伙人与神经保护属性和持续的丧失upregulation mir - 155的促炎特性调控网络。有趣的是,mir - 146 a的过度表达可能构成机制调节炎症反应(56),举例M1 / M2 / M0景观的复杂性。此外,我们发现N9细胞能够释放液约160 nm直径,由DLS分析(图7 (b))。我们观察这些细胞外囊泡进行同样的microrna M1极化细胞,证明这种液概括细胞的microrna的货物原产地。此外,由于在nonstimulated N9 mir - 124只检测到细胞(控制),我们可以假设mir - 155和mir - 146 a是最与促进相邻细胞的表型转化。

4所示。讨论

在这项研究中,我们有异形N9小胶质细胞的激活在LPS刺激细胞,功能,和分子水平,通过考虑基因或蛋白表达炎性/抗炎相关的标记。此外,我们不仅为特征的不同面孔的小胶质反应与M1极化还探索了新的炎症玩家的参与。数据支持LPS-induced小胶质细胞M1表型的激活炎症级联由TLR / NF -κB在N9细胞信号通路。更有趣的是,我们提供了新的证据表明减少迁移能力,但增加吞噬MFG-E8的参与生产和释放。此外,我们的研究是创新的证明,有限合伙人触发upregulation NLRP3 inflammasome复杂N9细胞并导致HMGB1释放到细胞外介质一起MMP-9。我们第一次获得upregulation mir - 155和mir - 146,以及减少表达N9 mir - 124的细胞治疗有限合伙人,正如前面观察到巨噬细胞和小胶质细胞M1极化细胞(24),我们表明,类似的代表形象出现在液隔绝LPS-treated N9细胞上清液。

N9细胞系已广泛应用于小胶质的评价函数在不同的条件下,作为替代原代细胞培养,由于产量的增加和细胞文化的同质性。更重要的是,没有发现差异N9细胞和小胶质细胞的主要文化之间相对于激活的炎症介质有限合伙人(21]。以前的分离研究证明一个装配的效果由有限合伙人,包括NF -κB激活(57),与过程收缩变形形态(58,59),释放促炎介质(4,58)、低迁徙能力(33[],增加吞噬能力60]。尽管如此,仍有有限的信息关于这些细胞的激活模式和合并后的事件涉及表型转向M1极化,这是强制性的要探讨小胶质细胞的内在特征和治疗药物测试。此外,也没有描述inflammasome激活复杂,也inflamma-miR分析和外来体货物确认。此外,只有我们的数据报告HMGB1表达的增加在淀粉样β蛋白peptide-treated N9细胞(50),以及它的核质中穿梭,进一步释放LPS-treated细胞,当我们描述在这个研究。我们首先解决N9小胶质细胞主要转向M1亚型的有限合伙人,所述的巨噬细胞和小胶质细胞的主要文化12,13]。利用建立标记允许M1和M2激活细胞之间的分化(审查[8M1-markers]),我们观察到Nos2和mhc ii调节而M2-markers吗__arg1和Fizz1后被下调有限合伙人。CX3CR1,差别在整合,我们也观察到对这些条件中确定M1单核巨噬细胞(61年和在初级小胶质细胞暴露于有限合伙人62年]。此外,低CX3CR1与标记神经元损失后全身炎症(11)和促进sepsis-induced免疫抑制单核细胞所产生的无法识别CX3CL1并杀死病原微生物(63年]。因此,减少CX3CR1在我们的模型中可能与持久的小胶质细胞的激活。

变形N9小胶质细胞数量的增加和减少分歧的细胞特性的小胶质细胞激活和观察治疗后与有限合伙人(58,59]。小胶质细胞的增殖率增加了有限合伙人,我们获得的N9细胞基于核的ki - 67和upregulation标志Cd11b表情,以前注意到BV2-stimulated小胶质细胞(64年]。然而,体内数据不维持增殖小胶质细胞在全身炎症的存在(65年),尽管它被证明在缺血(66年]。

小胶质细胞的能力感觉遥远的信号和被吸引到他们,一个函数指定的趋化作用,是由多种趋化现象的化合物在网站发布的损伤,通过细胞受伤或致病生物。所声称的人(3],ATP是一个选择性作用和促进了N9小胶质细胞的迁移,一个属性,但是降低LPS处理后,可能由于减少过程妥协迁徙能力对化学引诱物信号(9]。的确,细胞迁移到损伤网站速度比形态变化与小胶质细胞的激活有关,其中嘌呤等ATP再也不能吸引,甚至排斥他们(67年]。这样的变化可能与改变P2Y等表面标记₁₂在有限合伙人接触(68年]。事实上,以前P2Y受体与小胶质细胞趋化功能ATP (69年]。减少迁移能力向有限合伙人也M1极化N9的功能细胞,尽管有一些争议对LPS诱导或抑制迁移的能力(45,70年,71年),因为它可能取决于LPS浓度和介质发布的站点附近的活化的小胶质细胞损伤(72年]。

吞噬作用是另一个小胶质神经保护属性函数,它是极其重要的,不仅需要对突触可塑性,也对间隙的细胞碎片和消除病原生物体(46]。我们的研究结果表明,有限合伙人增加N9小胶质细胞吞噬作用,如前所述,LPS-treated BV2细胞,以及小胶质细胞和巨噬细胞的主要文化73年]。体内研究表明,有限合伙人管理增加小胶质细胞吞噬作用的可行的神经元在开发过程中,炎症和神经病理学,房地产计价phagoptosis [74年]。新发现的增加表达phagocytosis-associated蛋白质MFG-E8,一起释放,当N9细胞治疗与有限合伙人。仍然有争议的数据关于保护/ MFG-E8的有害作用。一方面,MFG-E8一直与小胶质细胞相关的消炎作用,证明了Spittau et al。75年),当这些细胞被刺激了TGF -β在MGF-E8^−−/老鼠显示增加促炎反应(19),以及感染性鼠标MFG-E8水平的差别提出对这些76年]。另一方面,刘和他的同事们(77年)表明,MFG-E8过度发生与肿瘤坏死因子-α和il - 1βupregulation。因此,考虑到增加细胞内的表达和释放MFG-E8发现在我们的模型中,我们假设MFG-E8 upregulation是典型的M1极化小胶质细胞。

考虑到炎症信号级联,TLR4/2-NF——的激活κB通路和促炎反应由有限合伙人是一致的(57,58]。inflammasome知之甚少的角色在小胶质细胞的激活模式。我们的数据显示,首次表达NLRP3, il - 1β,地震mRNA增加有限合伙人暴露,可能与caspase-1的激活。Bauernfeind和他的同事们(47)提出,NF -κB诱发mRNA的表达NLRP3,进一步要求inflammasome复合物的形成。其他人已经报道的激活NLRP3 caspase-1复合物和招聘,结合地震/ il - 1β释放,在初级小胶质细胞(78年)和巨噬细胞(49)刺激infection-associated代理。我们的结果也符合作品主要BV-2细胞系和鼠小胶质细胞报道,小胶质细胞暴露于LPS显示增加一代的氧化还原分子(NO)和伊诺激活(57,58),以及增强MMP-9表达式(70年)和活动(79年]。最有趣的,TLR2-dependent没有表达被证明是必要的对小胶质MMP-9表达式(80年]。虽然它已被证明,MMP-2可能也参与神经胶质细胞的激活81年)和最近的研究表明增加MMP-2释放到细胞外媒体在小胶质细胞治疗淀粉样β蛋白肽(未发表的结果),我们没有观察到任何差异LPS-stimulated nonstimulated细胞(控制)的MMP-2释放。结果发现这个区别MMP-9和MMP-2可能解释为具体结合位点NF -的存在κB在MMP-9,缺乏MMP-2启动子区域,据Fanjul-Fernandez et al。52]。

我们接下来的表达进行了探讨alarmin HMGB1在炎症的背景下在我们的文化模式,因为它被描述为一个信号释放到细胞外环境,导致炎症机制通过愤怒和TLR2和TLR4受体的激活(18]。我们是第一个报告,减少其核和胞质内容N9 LPS刺激后小胶质细胞很可能由于其大量释放到细胞上清液。实际上,HMGB1释放细胞从细胞核转位后细胞质(82年),这表明HMGB1的分泌可能与inflammasome复杂激活(17]。

microrna在microglia-mediated免疫反应的影响(最近审阅的83年)和异常表达inflamma-miRs给导致慢性炎性状态和是一个重要的死亡风险因素(84年]。microrna是年龄在18岁至25岁之间的小非编码RNA分子核苷酸长度参与基因表达的调控。主要炎症microrna mir - 155、miR-21 miR146a / b, mir - 124 (85年]。我们发现upregulation mir - 155和mir - 146,连同mir - 124的表达,在N9小胶质细胞在有限合伙人曝光。此模式支持了极化的增加表示M1小胶质N9的有限合伙人M2极化,(几个作者所描述的24,36]。Freilich和他的同事们(22)发现了一个类似的表达谱主要培养小胶质细胞在短期孵化与有限合伙人(4小时)。mir - 155的目标是细胞因子信号的抑制因子1 (SOCS1) CCAAT / enhancer-binding蛋白α(C / EBPα),Smad2 [24,36)在抗炎反应是重要的球员。因此,mir - 155的表达增加强化炎症和维持小胶质细胞激活和产生的神经毒性。我们还演示了在这里孵化与LPS促进upregulation N9 mir - 146 a的小胶质细胞。这样的效果可能TLR2和TLR4激活的结果,所述BV-2和转换端13.31细胞系(86年]。其他表明mir - 146 a调节NF -κB信号通路通过直接针对IRAK1, tumor-necrosis-factor-receptor-associated因子6 (TRAF6),蛋白质转导通路的NF -κ由免疫刺激[B transactivation87年]。然而,在我们的模型中,mir - 146 a的upregulation 24 h与有限合伙人无法孵化抑制炎症反应。这不能是同样的观察到当72 h治疗化验(数据没有显示)。有趣mir - 146 a的表达增加可能与LPS宽容,以前在单核细胞和建议作为调优机制来防止过度刺激炎症状态(88年]。对mir - 124,以促进小胶质细胞静止(89年),是显示开关单元极化M1和M2表型(90年在不同子集的单核细胞和小胶质细胞(26]。这一发现表明,mir - 124的表达减少,我们发现在我们的模型与表型M1优势是一致的。我们的数据也表明,在液inflamma-miRs概括的表达谱中发现的一个细胞,这表明M1极化小胶质细胞可以直接运输microrna相邻细胞和调节其表型,除了释放可溶性的炎症信号。因此,促炎的环境中观察到许多毒害神经的情况可能持续通过小胶质细胞表型相关的microrna的细胞转移到液。

5。结论

总体而言,目前的数据集成相关的信号级联一个M1路径N9小胶质细胞的激活,一起创新数据指向inflammasome复杂的活化,减少神经元fractalkine受体CX3CR1 downregulation, mir - 124在孵化有限合伙人。新发现还包括LPS-induced MFG-E8的表达增加,mir - 155, mir - 146 a,一起提高HMGB1的分泌和MMP-9示意图如图表示8。我们的研究首先发现mir - 155的交付小胶质细胞相邻细胞可能由液,正如前面观察树突状细胞对内毒素(32]。LPS-induced M1 N9细胞的极化模型,通过探索新的分子和通路参与这样的活动,增强我们的理解与小胶质细胞炎症相关的神经退行性过程,而有前途的标志物用于神经系统疾病,特别是液和mir - 155的货物。最后,我们的研究进一步表明,针对NLRP3 inflammasome, HMGB1信号,mir - 155转移到液可能是合适的治疗方法在抑制神经炎症疾病,小胶质细胞激活有至关重要的作用。

信息披露

资金组织没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

多拉英国和安娜丽塔Vaz构思和设计了体外实验。卡达执行实验室工作,除了mRNA分析中存在由Catia戈麦斯,多拉的英国人,安娜丽塔Vaz,卡达Catia戈麦斯。多拉的英国人,安娜丽塔Vaz和卡达分析了数据和准备数据。卡罗来纳达和安娜丽塔Vaz准备手稿。多拉英国监督项目和写最后的手稿。所有的作者都有阅读和批准。

确认

这项工作由项目PTDC / SAU-FAR / 118787/2010(多拉英国人),在某种程度上,通过即时通讯。ULisboa (UID / DTP / 04138/2013)从Fundacao para Ciencia e Tecnologia葡京(FCT)和圣Misericordia之德,葡萄牙。安娜丽塔Vaz拥有博士后研究奖学金(SFRH /桶/ 76590/2011)和卡罗莱纳达和Catia戈麦斯接受博士奖学金(SFRH / BD / 91316/2012和SFRH / BD / 102718/2014,职责),所有从FCT。

补充材料