文摘

由于肥胖及其相关疾病的高发病率和严重程度,强烈希望开发新的治疗策略,甚至阻止它的发展。我们先前描述银杏叶对提取(GbE)改善胰岛素抵抗和肥胖大鼠的体重增加。在目前的研究中我们对旨在评估的影响GbE炎性反应和胰岛素信号在食源性肥胖大鼠腹膜后脂肪仓库。老鼠被喂食高脂肪的饮食之后2个月,治疗与对500毫克/公斤GbE 14天。老鼠被安乐死和腹膜后脂肪仓库样本用于免疫印迹,rt - pcr和ELISA实验。对的GbE治疗提升显著减少食物/能量摄入和身体相比,体重增加参与肥胖的老鼠。此外,显著增加Adipo R1和il - 10基因表达式和IR和一种蛋白激酶磷酸化也观察到,在NF -κB p65磷酸化和TNF -α水平显著降低。对我们的数据表明,GbE可能潜在疗法治疗与肥胖相关的代谢疾病,治疗肥胖与特殊利益主体对坚持营养教育项目。

1。介绍

肥胖和超重的发病率已大大增加了世界各地。在2008年,35%的全球人口超重,11%是肥胖1]。此外,据估计,肥胖将达到三分之一的人口在2030年(2]。这个观点特别让人忧虑,因为肥胖相关慢性并发症,如胰岛素抵抗、2型糖尿病(T2D),亚临床炎症,和其他人3]。

有人建议,食用高脂肪的饮食是直接参与肥胖发病机制,因为它会影响中央控制食物摄入量和外围的新陈代谢,导致身体体重增加,胰岛素抵抗,和其他代谢紊乱4,5]。因此,我们先前已经表明,长期hyperlipidic饮食摄入促进身体肥胖大鼠显著增加,三酰甘油,葡萄糖等离子体水平的胰岛素敏感性的相应损失(6]。

胰岛素抵抗是一种慢性疾病,胰岛素不能激活自己的信号级联,导致高血糖。已经高度相关的内脏脂肪过多过剩,增加白色脂肪组织(窟)的细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α(TNF -α)和白细胞介素- 6 (il - 6)3,7]。此外,高脂肪饮食摄入被指出是胰岛素抵抗的重要危险因素,因为它会损害胰岛素信号通路和刺激炎症,通过toll样受体信号级联(5,7,8]。

考虑到大多数hypoglycemiants出现不良的副作用(9- - - - - -12),由于胰岛素抵抗的程度发展强烈希望发现新的药物和治疗方法。它提出了银杏叶对提取物(GbE)对高血糖的影响可以是积极的。这种植物提取物主要含有黄酮苷24%左右和6%的萜类化合物,包括A, B, C, M, J, P和Q ginkgolides [13]。

我们先前描述,对延长GbE治疗显著降低食物摄入量和身体肥胖,预防高血糖和血脂异常,而增加胰岛素敏感性评价ITT(胰岛素耐量试验)的肥胖老鼠喂食了lard-enriched hyperlipidic饮食(6]。同意我们之前的发现,对其他研究提出GbE摄入量提高血糖的健康和T2D患者(14,15]。此外,减少在口服葡萄糖海拔刺激老鼠的糖精代理证明(16]。

对上面的数据显示的有利影响GbE对胰岛素抵抗和肥胖引起的疾病。然而,它是非常重要的对更好的描述机制GbE改善胰岛素的行动。在这种背景下,本研究旨在评估如果14天对口腔GbE改变治疗腹膜后窟仓库胰岛素和toll样受体信号级联的食源性肥胖大鼠胰岛素抵抗的典范。

2。材料和方法

2.1。动物

动物研究伦理委员会的圣保罗大学联邦德批准所有的程序在这项研究中使用的动物(过程数量:271359)。所有的努力都是尽量减少痛苦。雄性Wistar鼠从CEDEME(巴西圣保罗)被安置4每笼和维护在控制条件下的光(12:12 h光明/黑暗,灯在6点)和温度(23°C±1°C),和免费的食物和水。

2个月大的老鼠被喂食高fat-enriched饮食准备通过增加40% (w / w)标准粮+ 28% (w / w)猪油,2% (w / w)豆油,10% (w / w)蔗糖、20% (w / w)酪蛋白,为了获得的蛋白质含量控制饮食,和丁羟甲苯的0.02% (w / w)额外的石油。这提供了19.5%的能量是碳水化合物,23.2%的蛋白质,57.3%为脂肪。表1显示了大量营养素和脂肪酸成分的饮食。

8周后,动物分为两组,根据下面描述的植物疗法治疗。

2.2。植物疗法治疗

银杏叶对提取(GbE)是来自安徽南部大鹏(中国)和含有26.12%的黄酮苷类,萜类化合物的6.86%,2.20%的ginkgolide, 1.11%的ginkgolide B, bilobalide ginkgolide C的1.05%和2.50%。

植物疗法治疗14天时间执行。肥胖的动物被分为两组:O + V(肥胖+车辆)和O + Gb(肥胖+银杏叶)。O + g组每日填喂法对500毫克/公斤GbE [17,18)稀释1毫升0.9%生理盐水(车辆),而O + V是填喂法1毫升的车辆。

2.3。身体体重增加,累积食物,能量摄入

在植物疗法治疗期间,24小时每日食物摄入量和体重测量。食物摄入量的评价计算餐提供的数量之间的差异和24小时后的遗迹。

身体体重增加最后重量计算的区别(治疗)的最后一天和初始重量(治疗)的第一天。积累了食品和能源摄入量意味着测量的第一个13天的治疗。在治疗的最后一天,老鼠一直通宵禁食。

2.4。腹膜后脂肪组织和血清参数

老鼠与硫喷妥钠麻醉(80毫克/公斤的身体wt,腹腔内),10个小时禁食期后斩首。腹膜后白色脂肪组织仓库被和均质1.0毫升的裂解缓冲(100毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,10毫米EDTA和0,1毫克/毫升抑肽酶;PMSF约2毫米;10毫米原钒酸钠;100毫米氟化钠;10毫米焦磷酸钠;和10% tritonx - 100)。水平的促炎细胞因子TNF -α和抗炎细胞因子il - 10测定的酶联免疫试剂盒(研发系统)。

门静脉血液也为脂联素的测量收集Milliplex地图(微孔)。

2.5。西方墨点法

老鼠深深的与硫喷妥钠麻醉(80毫克/公斤的身体wt,腹腔内)。腹腔开放和消极的控制样品(O + V−−和O + Gb)获得从左侧后腹腔脂肪仓库。集合后,样本立即插入瓶含3.0毫升的裂解缓冲(100毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,10毫米EDTA,和0.1毫克/毫升抑肽酶;PMSF约2毫米;10毫米原钒酸钠;100毫米氟化钠;10毫米焦磷酸钠;和10% tritonx - 100)、均质和离心机在16000 g 40分钟4°C。然后,门静脉暴露和10⁻⁵静脉注射的胰岛素注射(注射)。右侧腹膜后脂肪仓库被输液胰岛素注射后90秒(积极的样本:O + V +和O + g +)在上述相同的协议(19,20.]。总蛋白是由BCA工具包(BioRad)和量化样本用于免疫沉淀反应和提取总评价。

减少非特异性抗体绑定的风险,我们评估了与抗体免疫沉淀反应后IR红外磷酸化水平。一夜之间进行免疫沉淀反应实验中,样品被孵化与10µL主要抗体anti-IR(胰岛素Rβsc - 711)和蛋白质沉淀的蛋白琼脂糖(GE)。毕竟,蛋白质10% sds - page分离。蛋白质被湿然后转移到硝化纤维膜传输装置(Bio-Rad)。1小时的膜是preincubated阻断缓冲区(5%牛血清白蛋白(BSA), 1米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,5 M氯化钠和0.02% Tween-20)。膜在4°C隔夜孵化与主抗体p-Tyr(8954)细胞信号传导等。所有膜被孵化与特定的辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG抗体(细胞信号7074)化学发光检测(Amersham生物科学)紧随其后。因为所有样本与红外抗体免疫沉淀反应,我们认为乐队的分子量95 kDa IR的磷酸化形式有关。此外,IR水平作为内部标准,因为所有的其他蛋白质都被免疫沉淀反应的方法。

执行总提取实验中,蛋白质量化后,总蛋白8% sds - page分离。蛋白质是由半干转移转移装置(Bio-Rad)。

膜都是一夜之间在4°C的环境中与主抗体phospho-Akt(细胞信号爵士473 - 9271);一种蛋白激酶(9272)细胞信号,phospho-NF -κB p65(细胞信号爵士536 - 3033),NF -κB p65(6956)细胞信号,MyD88(4283)细胞信号,TLR4 (SC 293072),和微管蛋白(2146)细胞信号传导等。所有膜被孵化与特定的辣根peroxidase-conjugated反鼠标/兔免疫球蛋白抗体(细胞信号7076;7074年细胞信号,resp)。其次是化学发光检测(Amersham生物科学)。微管蛋白(2146)细胞信号级作为内部标准。

与接穗进行图像定量分析软件(Scion公司,弗雷德里克,医学博士,美国)。在所有的实验中,每组至少有一个样本进行了分析同时结果表示为百分比变化相对于基底的水平。

2.6。RNA提取和定量实时聚合酶链反应(qPCR)

为了评估Adipo R1的基因表达,Adipo R2,和il - 10,其他团体(O + V和O + Gb)五大鼠进行。对总RNA提取,二百毫克的冷冻腹膜后脂肪组织从每个样本被加1毫升的试剂盒均相试剂(美国表达载体)。样品在16.000 g离心机在4°C和15分钟水相被和异丙醇混合0.5毫升。在16.000 g离心10分钟后在4°C,球是用1毫升的75%乙醇洗净,然后溶解在20µL DEPC-Treated水(美国Ambion)。

一微克的RNA是反向转录cDNA使用高容量cDNA工具包(应用生物系统公司)。基因表达被实时评估使用Taqman qPCR PCR检测。引物和探针目录数据Adipo R1 (Rn01483784_m1) Adipo R2 (Rn01463173_m1), il - 10 (Rn00563409_m1)和肌动蛋白b (Rn00667869_m1)。

反应是在96孔板和一式三份。放大条件包括40的循环50°C / 2分钟,95°C / 10分钟,95°C / 15秒,60°C / 1分钟。该方法被用来评估放大产品的相对量化。

2.7。统计数据

执行统计分析使用PASW统计版本19(美国SPSS . n:行情)、芝加哥、IL)与统计显著性水平的设置。比较两组间被学生的表现测试。

3所示。结果

3.1。食物摄入量和身体脂肪过多对植物疗法治疗

积累的食物摄入量在第一次见图13天的植物疗法治疗1(一)。有趣的是要注意,O + g组比O + V少摄入6.3%组()。与能量摄入,可以观察到图1 (b)O + g也呈现显著减少6.3%相比,O + V ()。

对的影响GbE对体重增加呈现在图1 (c)。可以看出,O + g组有显著减少62% ()相比,O + V组。

3.2。细胞因子和基因表达水平

表2介绍了腹膜后脂肪得宝细胞因子水平的结果。减少36% ()对肿瘤坏死因子-α在O + g O + V组相比。il - 6和il - 10的水平在两组相似。

图2描述了对影响GbE Adipo R1腹膜后脂肪得宝基因表达,Adipo R2, il - 10。它可以观察到数据2(一个)和2 (c)对,GbE治疗促进基因表达的显著增加Adipo R1 (33%;)和il - 10 (70%;相比),O + V组。然而,没有观察到基因表达差异对应对GbE Adipo R2的治疗(图2 (b))。

3.3。空腹血清脂联素水平

与血清脂联素水平,没有观察到的差异在O + V组(14.74±0.92µg / mL)和O + g组(12.96±1.16µg / mL)。

3.4。红外光谱和一种蛋白激酶磷酸化水平

在图3(一个)它可以观察到,insulin-induced红外磷酸化(O + V +)是受高脂肪食物的摄入,因为没有差异观察与基底(O + V−)水平。但是,它可以看到图3 (b)这对长期管理GbE提升显著增加(2.81倍)insulin-induced红外磷酸化(O + g +)与基底(O + Gb−)水平。

图4说明了一种蛋白激酶磷酸化也对刺激的GbE治疗。对的GbE治疗提升显著增加(0.67倍)一种蛋白激酶磷酸化水平相比基底(O + g +和O + g−)(图4 (b))而不影响被观察到在参与肥胖大鼠胰岛素输注(O + V +与O + V−)(图4(一))。

3.5。炎症信号通路

图中可以看到5对,GbE治疗没有修改TLR4的总蛋白质含量,MyD88, NF -κB p65 (;;、职责)腹膜后脂肪仓库。对,GbE治疗显著降低了磷酸化的NF -κB p65 60%相比,参与肥胖大鼠()。

4所示。讨论

它被认为长期脂肪摄入量是主要的诱发危险因素肥胖的发展(21,22]。高脂肪的摄入也会损害胰岛素行动减少葡萄糖吸收和红外和一种蛋白激酶磷酸化棕色和白色脂肪组织(5,6,23]。由于肥胖和胰岛素抵抗的风险,强烈希望开发新的策略来治疗肥胖及其相关疾病。

在我们之前的研究表明,长期对治疗GbE提拔一个重要内脏脂肪过多损失,改善胰岛素敏感性,降低血脂异常,刺激胰岛素信号级联的腓肠肌肌肉(6]。考虑的有前途的结果在我们之前的研究中,目前的一个目的是进一步对评价的有利影响GbE肥胖相关胰岛素抵抗,现在关注胰岛素和炎症级联的腹膜后脂肪得宝,一个胰岛素依赖型组织。

类似于我们的先前的研究(6),对目前的数据表明,GbE治疗显著减少食物/能量摄入,此外,它还减少了食源性肥胖大鼠的体重增加。文献数据稀缺演示这样的效果。然而,对一些研究展示了一种强有力的抗炎效应GbE(26)特别是通过减少LPS-induced炎性细胞因子或抑制的toll样受体通路(观众)。因为肥胖与下丘脑炎症(31-35),可能对治疗GbE可能促进积极的抗炎作用下丘脑,使食欲减退的肽含量增加和/或减少orexigenic的导致抑制食欲和体重。更多的研究是必要的,以便更好地理解的机制参与GbE-induced抑制食欲的肥胖老鼠。

参与肥胖组胰岛素未能刺激IR和一种蛋白激酶的磷酸化腹膜后脂肪得宝表明高脂肪摄入会损害胰岛素信号。有趣的是,对肥胖组接受GbE,红外和Akt的磷酸化是显著增加281%和67%,分别。值得注意的是对的有利影响GbE观察老鼠仍然喂高脂肪饮食,这表明它可能是有效的治疗与肥胖相关胰岛素抵抗的发展。

对我们实验室之前的研究表明,GbE改善胰岛素敏感性评价胰岛素耐量试验而显著改善insulin-induced那样一种蛋白激酶磷酸化和IRS-1水平,相应在腓肠肌肌肉PTP-1B水平(6]。此外,对其他研究已经表明,GbE减少glycaemia和改善葡萄糖耐受不良16,24]。对此外,GbE刺激胰岛细胞功能在健康受试者正常糖耐量和胰岛素生产,虽然显著降低T2D患者的糖化血红蛋白水平在三个月时间的治疗(14,15]。

能够很好的描述,adiponectin-an adipokyne表示反向身体adiposity-improves胰岛素信号,减少炎症特别是通过Adipo R1受体(25,26]。对我们没能证明一个影响GbE对血清脂联素水平。然而,目前的研究表明显著增加脂联素受体,Adipo R1,基因表达在腹膜后脂肪仓库没有Adipo R2上观察到的效应,对表明GbE可能提高脂联素的信号。与我们的数据协议,刘等人。27对]表明GbE分数isoginkgetin提高脂联素的分泌在体外对,表明积极影响的GbE的脂联素抗糖尿病的作用。此外,拉斯穆森et al。25)描述,减肥肥胖受试者中观察到提交hypocaloric饮食与增加Adipo R1 mRNA水平。山口et al。26]表明绑定Adipo R1的脂联素受体,而不是Adipo R2,抑制巨噬细胞负责的TLR信号通路介导的抑制NF -κb .鉴于上述考虑,可能表达的增加Adipo R1本证明对刺激效应的可能贡献GbE对胰岛素信号。

另一个重要因素参与胰岛素抵抗的发病机制是低级炎症在肥胖受试者(28]。它已经表明,在这种情况下,促炎adipokine TNF -α增加而减少可以观察到在抗炎il - 10的水平,导致胰岛素敏感性和葡萄糖吸收的障碍29日]。

尽管这一事实,在对当前研究GbE未能改变TLR4, MyD88, NF -κB p65蛋白表达,它大大降低了NF的磷酸化κB p65腹膜后脂肪得宝,表明这个炎症通路的抑制作用。事实上,Yoshikawa et al。30.]对描述GbE作为一种有效的抗炎剂。对大多数GbE抗炎作用对LPS诱导而影响观察的GbE的与肥胖相关的炎症仍然不清楚。因此,本研究是第一次对演示的有益作用GbE等条件。

对目前的数据还表明,GbE降低TNF -α水平虽然il - 10、il - 6水平没有修改在腹膜后脂肪组织。此外,我们的研究结果也证明了增加抗炎细胞因子il - 10基因表达在腹膜后脂肪仓库。对有可能GbE治疗持续时间并不足以影响其他细胞因子水平而不是TNF -α。此外,众所周知,白色脂肪组织提出了depot-specific应对不同的刺激31日,32]。它允许推测其他脂肪仓库而非腹膜后一个可能改变水平的il - 6和il - 10对响应GbE治疗。

众所周知,增加血浆il - 10水平与内脏有关减少(33]。此外,il - 10改善胰岛素敏感性和葡萄糖运输,从而有针对obesity-induced胰岛素抵抗的保护作用[29日,34]。此外,产能低的il - 10在病理条件下,如肥胖与代谢综合征的发展和T2D [35]。在这种情况下,它是可能的,在一个更长期治疗期间,对的刺激效果GbE对il - 10基因表达在此证明增加也可能导致组织il - 10的水平,对造成的有利影响GbE对胰岛素信号级联已经14天的治疗后观察。

对抑制作用的GbE TNF -α水平在其他组织,如大脑和肺部,被描述(36,37]。我们认为对的抗炎效果GbE通过降低TNF -α腹膜后脂肪仓库含量可能会软化的有害影响,长期食用高脂肪饮食,导致胰岛素信号通路的刺激。

5。结论

对以上提供的数据显示,GbE明显刺激胰岛素信号级联,因为它促进了红外和Akt的insulin-induced磷酸化腹膜后脂肪仓库。然而,我们的研究结果表明,对抑制作用的GbE对NF -κB p65磷酸化和TNF -α水平的刺激可能会导致胰岛素信号。总结,结果在此提出对建议的潜在使用GbE治疗肥胖相关胰岛素抵抗。这些结果是特别有趣的考虑大量的抗肥胖的人执行饮食疗法。然而,进一步的研究是必要的,以便更好地理解对的影响GbE与肥胖相关的疾病。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者欣然承认的宝贵支持Janilda de冰镇佩雷拉,毛罗·卡多佐佩雷拉,瓦尔特Tadeu Boldarine,和Viviane达席尔瓦胡里奥。这项研究是由巴西支持机构:FAPESP (Fundacao德帕罗尽管Estado de Sao Paulo)和斗篷(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比)。