IRAK1/4-Targeted咖啡酸的抗炎作用

文摘

咖啡酸(CA)是一种酚类化合物,经常出现在水果、谷物和膳食补充剂。虽然CA已经报道显示各种生物活性如抗炎、抗癌、抗病毒、和氧化,CA的作用机理尚未完全阐明。在这项研究中,CA的抗炎作用机理研究在脂多糖(LPS)对巨噬细胞(RAW264.7细胞)和盐酸/ EtOH-induced胃炎。CA发现减少一氧化氮(NO)和前列腺素E₂(铂族元素₂)生产LPS-stimulated RAW264.7细胞。此外,信使rna的肿瘤坏死因子(TNF)水平α、环氧合酶(COX) 2、诱导没有合酶(间接宾语)下调了CA。CA还强烈抑制核易位AP-1家族的蛋白质和相关的上游信号级联组成的interleukin-1 receptor-associated激酶1 (IRAK1), IRAK4 TGF -β活化激酶1 (TAK1),增殖蛋白激酶激酶4/7 (MKK4/7)和c-Jun n端激酶(物)。直接激酶试验,揭示了直接抑制IRAK1, IRAK4。CA还改善盐酸/ EtOH-induced胃症状通过抑制物,IRAK1, IRAK4。因此,我们的数据表明,CA作为抗炎药通过直接抑制IRAK1, IRAK4。

1。介绍

在外国病原体感染,先天免疫细胞,包括巨噬细胞、角质细胞、朗格汉斯细胞,通过模式识别受体被激活,如toll样受体(通常)。一旦激活,这些细胞可以吞噬材料从病原体感染细胞,随后产生各种炎症介质如白介素(IL) 1、白介素、肿瘤坏死因子(TNF)α,介质一氧化氮(NO)和前列腺素E₂(铂族元素₂),可以刺激其他免疫细胞(1,2]。许多细胞内的信号级联,包括non-receptor蛋白质酪氨酸激酶、磷酸肌醇3-kinase (PI3K) phosphoinositide-dependent激酶1(基因),增殖所需的蛋白激酶(MAPK)易位等转录因子核因子(NF)κB和激活蛋白(美联社)1,参与这些过程(3,4]。因此,炎症细胞可以表达许多炎性基因编码促炎细胞因子,诱导没有合酶(间接宾语)没有释放,并为前列腺素E环氧合酶(COX) 2₂(铂族元素₂)生产5- - - - - -8]。已知的过度激活炎症细胞产生的免疫病理过程环境组织或器官的破坏,从而导致各种炎症性疾病,如关节炎、癌症和动脉粥样硬化(9- - - - - -11]。因此,目前的研究都集中在治疗药物的发展,可以调节细胞和分子炎症反应。

咖啡酸(CA)是一个代表性的酚类化合物,存在于许多不同的自然资源,如水果,蔬菜和草本植物(12]。CA已经具有许多生物活性如氧化、抗癌,抗病毒,抗炎,抗糖尿病作用[12- - - - - -14]。尚不完全了解这种化合物如何显示这样一个广泛的生物活性。然而,一些报道表明这种化合物可以同时抑制NFAT等各种转录因子的激活,NF -κB, AP-1 [15,16]。尽管一些报道指出菲英岛、5-lipoxygenase基质金属蛋白酶,和ectonucleotidase药理CA的目标及其化学衍生物,包括CA苯乙基酯(17- - - - - -20.),很少有报道了CA的直接目标转录因子激活的调节。因此,在这项研究中,我们旨在探索潜在的抗炎CA和目标酶(s)导致CA-associated LPS-activated巨噬细胞抗炎活动和盐酸/ EtOH-treated胃炎模型。

2。材料和方法

2.1。材料

CA(纯度:95%),3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT),佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)和脂多糖(LPS);大肠杆菌0111:B4)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。从Calbiochem SP600125得到(La Jolla、钙、美国)。甲醇提取物的准备紫锥菊紫竹(Ep-ME: fbm094 - 078),Nyctanthes arbortristis(Na-ME: fbm015 - 052)Vernonia灰质(Vc-ME: fbm028 - 094),所有这些都被包含CA (21- - - - - -23),从植物中提取银行购买植物多样性研究中心(http://extract.pdrc.re.kr/extract/f.htm韩国大田市)。NF -荧光素酶结构包含启动子敏感κB、分子和AP-1教授的礼物。有年轻的钟(釜山国立大学、釜山、韩国)和人庆熙Rhee(庆北国立大学、大邱、韩国)。酶免疫测定(EIA)工具来决定铂族元素₂浓度从Amersham购买(小都,白金汉郡,英国)。胎牛血清,RPMI 1640人获得Gibco(美国纽约大岛)。RAW264.7小鼠巨噬细胞细胞系和HEK293人类胚胎肾细胞系从写明ATCC购买(罗克维尔市,医学博士,美国)。所有其他化学试剂均为分析纯,从σ。Phosphospecific或总抗体p65、c-Jun c-Fos, FRA-1,物,MKK4/7, TAK1, IRAK1, IRAK4,核纤层蛋白A / Cβ肌动蛋白从细胞信号(美国贝弗利,MA)。

2.2。动物和伦理语句

雄性ICR小鼠(g) 17 - 21 6 - 8周大,区间获得Daehan Biolink(来自韩国忠北、韩国)。塑料笼子里的老鼠保持在一个温度控制(24±1°C)的房间在12 h光/暗周期并给予免费获取颗粒状食品(Samyang、大田、韩国)和水。每个老鼠实验中只使用一次。根据指导原则使用动物的动物保健和使用美国生理协会和机构批准的动物保健和使用委员会韩国成均馆大学(批准ID: 201202018)。是尽一切努力来减少实验用动物的数量和他们的痛苦。牺牲的老鼠异氟烷麻醉下进行。

2.3。细胞培养

RAW264.7 HEK293细胞在DMEM培养或RPMI 1640媒介heat-inactivated补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco,宏伟的岛,纽约,美国),谷氨酰胺,抗生素(青霉素和链霉素)(Gibco,大岛,纽约,美国)37°C和5%股份有限公司₂。对于每一个实验,细胞被分离细胞刮刀。死细胞的细胞密度的比例用于实验(2×10⁶细胞/毫升)小于1%,以台盼蓝染料排斥。

2.4。细胞生存能力测试

后18-h RAW264.7细胞(1×10的预孵化⁶细胞/毫升),CA(0到400μ米)添加到细胞,随后被孵化24 h。CA的细胞毒性效应是评价与传统的MTT试验报告之前(24,25]。在3 h文化终止之前,10μL (MTT的解决方案(10毫克/毫升磷酸buffered-saline, pH值7.4)被添加到每个好,细胞不断培养,直到终止实验。孵化被添加15%十二烷基硫酸钠(SDS)每个好溶解甲瓒(26]。吸光度在570 nm ()测量SpectraMax 250标(分子器件、桑尼维尔,美国)。

2.5。确定没有和铂族元素₂水平

后18-h RAW264.7细胞(1×10的预孵化⁶细胞/毫升),细胞使用CA(0到400μ米)30分钟和进一步孵化有限合伙人(1μg / mL) 24 h。CA的抑制作用没有和铂族元素₂生产测定分析没有和铂族元素₂水平与格里斯试剂和酶联免疫测定(EIA)包、分别,如前所述27,28]。

2.6。半定量逆转录酶(RT)和实时聚合酶链反应(PCR)分析mRNA水平

确定各种细胞因子基因的信使RNA表达水平,总RNA隔绝LPS-activated RAW264.7细胞与试剂盒试剂(美国纽约Gibco,大岛),根据制造商的指示。简而言之,RAW264.7细胞使用CA(100年至400年μ米)为一个额外的30分钟,其次是与有限合伙人(1 6小时的治疗μg / mL)。总RNA是储存在−70°C到使用。进行了半定量的RT反应如前所报道(29日,30.]。量化的信使rna是由实时rt - pcr SYBR预混料Taq交货,根据制造商的说明(豆类生物。Inc .志贺、日本)和反应进行实时热循环仪(美国BioRad大力神,CA)之前报道(31日,32]。结果表示为相对于GAPDH最优密度的比值。使用的引物(Bioneer、大田、韩国)表中列出1。

2.7。荧光素酶报告基因活性测定

HEK293细胞(1×10⁶细胞/毫升)12-well板转染有1μ克的质粒含有NF -κB-Luc、CREB-Luc或AP-1-Luc连同β牛乳糖通过磷酸氢钙的方法,根据制造商的协议(33]。用于实验的细胞转染后48 h。荧光素酶检测进行了荧光素酶检测系统(美国WI Promega,菲奇堡)之前报道(34]。

2.8。制备的细胞溶解产物和核分数,免疫印迹和免疫沉淀反应

小鼠胃组织或RAW264.7细胞(5×10⁶细胞/毫升)与1毫米洗了三次在寒冷的PBS原钒酸钠,细胞溶解的Tissuemizer(试剂盒,日耳曼敦,医学博士,美国)或超声发生器(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),分别在裂解缓冲(20毫米Tris-HCl, pH值7.4,2毫米EDTA, 2毫米ethyleneglycotetraacetic酸,50毫米β二硫苏糖醇甘油磷酸酯1毫米原钒酸钠1毫米,特里同x - 100 1%, 10%的甘油,10μ抑肽酶g / mL, 10μ抑肽素g / mL, benzimide 1毫米,2毫米PMSF)与旋转30分钟在4°C。的溶解产物被离心澄清在16000 g×10分钟4°C和储存在−20°C到被需要。

核溶解产物在三步准备过程(35]。治疗后,细胞收集用橡胶警察,500年用PBS,细胞溶解μL裂解缓冲的50 mM氯化钾,0.5%诺乃清洁剂p 40, 25毫米玫瑰(pH值7.8),1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,10μ亮抑酶肽的g / mL, 20μ抑肽酶的g / mL, 100μ米1,4-dithiothreitol(德勤)冰4分钟。接下来,细胞溶解产物离心机在微型离心机19326 g×1分钟。在第二步中,核分数颗粒是洗一次洗缓冲区(裂解缓冲没有诺乃清洁剂p 40)。在最后一步,细胞核被处理一个包含500毫米氯化钾提取缓冲和10%甘油除了其他试剂溶解缓冲区。核/提取缓冲混合物被冻结在−80°C,在冰解冻,在19326×g离心5分钟。收集上清液作为核提取。可溶性细胞溶解产物免疫印迹,蛋白质含量是可视化为之前报道(36]。免疫沉淀反应,细胞溶解产物等量的蛋白质(500μ从RAW264.7细胞(1×10 g)⁷细胞/毫升)被接受或没有有限合伙人(1μ为2.5 g / mL) 10分钟是事先批准μL的蛋白质耦合琼脂糖珠(50% v / v;Amersham,小都,英国白金汉郡)1 h在4°C。事先批准样本孵化与5μL (anti-IRAK4抗体在一夜之间在4°C。免疫复合物混合10μL的蛋白质耦合琼脂糖珠(50% v / v)和旋转3 h在4°C。

2.9。酶测定

激酶分析器服务从微孔(美国马Billerica)是用来评估IRAK1 IRAK4活动与纯化酶的抑制。纯化酶(1 - 5μ)孵化反应缓冲在最后反应体积的25μl . MgATP的反应是由添加。在室温下40分钟孵化后,反应是停在添加5毫升的3%磷酸。10毫升的反应混合物被发现到e filtermat和洗了三次5分钟每个75毫米磷酸和一次与甲醇在干燥和闪烁计数。

2.10。EtOH / HCl-Induced胃炎

胃炎症诱导了EtOH /盐酸根据先前发表的方法(37]。禁食ICR小鼠口服治疗CA(100和200毫克/公斤)或雷尼替丁(40毫克/公斤)连续三天每天两次。三十分钟最后注射后,400年μL 150毫米HCl的60%乙醇的口服药物。每只动物被麻醉了,注射了过量的聚氨酯在1 h后坏死的管理代理。胃切除,轻轻地运行自来水下冲洗。打开后每个胃和传播大弯板上,该地区(毫米²)粘膜腐蚀性损伤的测量由技术员pixel-counter盲治疗条件。

2.11。统计分析

数据(数据1,2 (b),3(一个),3 (b),3 (c),3 (d),4 (b),4 (d),5(一个))表示为平均值±标准偏差(SD)计算从一个()两个独立的实验。其他数据是代表三个不同的实验也得到了类似的结果。进行统计比较,方差分析的结果分析/菸害的因果测试和克鲁斯卡尔-沃利斯/ Mann-Whitney测试。所有值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有统计测试进行SPSS(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果与讨论

在这项研究中,我们发现CA(图1(一))可以作为一种有效的抗炎药。因此,这种化合物(100年至400年μ米)有效地抑制炎症介质的LPS-mediated生产如没有和铂族元素₂在macrophage-like RAW264.7细胞(数字1 (b)和1 (c))。然而,CA的细胞毒性活动边缘相比,其抑制活性(图1 (d)),这表明CA的作用是由于其特定的immunopharmacological活动。进一步分析炎症基因的mRNA水平强烈建议潜在的抑制作用CA LPS-treated炎症反应在转录水平。也就是说,肿瘤坏死因子的调节水平α、cox - 2和伊诺是剂量依赖性降低CA治疗(图2(一个));这种模式被实时PCR(图进一步证实了2 (b)),支持这个想法,控制炎症基因的mRNA水平可能CA-mediated抗炎活动的一个关键因素。的在体外在单核细胞的抗炎活性的CA之前报告THP-1细胞通过测量细胞因子的水平,包括interleukin-1β和粘附分子细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1) PMA,甲型流感,高密度脂蛋白,TNF -α治疗(38- - - - - -40]。因此,这些报告和我们的数据强烈支持,CA是一种黄酮类化合物,无刺激抗炎活性。

来确定CA调节炎症基因表达,我们首先采用与荧光素酶报告基因分析结构中含有NF -κB、AP-1或分子结合位点。因为PMA和forskolin良好的NF -诱导物κAP-1 - B -, CREB-mediated荧光素酶活动,这些诱导物用于治疗CA-pretreated HEK293细胞。有趣的是,PMA-induced NF -κB激活和forskolin-induced活化分子只有抑制,享年400岁μCA(数据3(一个)和3 (c)),而AP-1激活由CA强烈抑制,即使是在100年μM(图3 (b))。为了证实这种效果,methanolic提取已知包含CA还测试了AP-1-mediated荧光素酶活性的抑制。正如所料,所有的提取物(Na-ME Vc-ME, Ep-ME)显著地抑制AP-1激活(图3 (d)在不改变细胞的生存能力(图左面板)3 (d)右面板)。因为荧光素酶试验表明可能的转录因子抑制,我们确定了核易位转录因子的水平。如图3 (e)(左)所示,核p65、NF -亚基κB, 30分钟CA治疗后减少,而核水平AP-1家庭成员(c-Jun / c-fos和p-FRA-1)被抑制(100年至400年μ在60米),下半场CA治疗,分别(图3 (e)左和右面板)。因此,这些结果表明,AP-1可能是一个强大的目标转录因子CA的监管。

进一步了解的确切机制CA-induced AP-1抑制,AP-1易位的上游信号事件充分的探讨。我们评估AP-1上游信号酶的磷酸化或总水平,包括MAPK和相关上游激酶(41),通过免疫印迹分析。如图4(一)所示,CA没有抑制ERK的磷酸化和p38但抑制物在60分钟的磷酸化在不改变总物水平。同意此模式中,上游激酶的phospholevels,包括MKK4/7和TAK1,也明显减少30岁和15分钟,分别(图4(一))。更有趣的是,这也阻止了退化IRAK1, IRAK4评估总水平的这些蛋白质,从5到15分钟(图4(一))。同样,CA抑制的酶活动IRAK1, IRAK4高达60%,根据直接激酶试验(图4 (b))。IRAK4的CA-mediated抑制激酶活性也观察到在一个免疫沉淀反应分析与anti-TAK1 anti-IRAK4抗体和随后的免疫印迹分析(图4 (c)),表明CA-mediated直接抑制激酶活性影响信号复杂的伊拉克共和国和TAK1之间形成。此外,物是证明中发挥关键作用的规定没有和铂族元素的生产₂,如图4 (d);SP600125 (SP)减少没有和铂族元素₂生产了40%和85%,分别(图4 (d))。的功能作用物在炎症反应通路之前已经报道过了。例如,大麻素受体2-mediated炎症信号显示是由物在人类骨髓细胞(42]。的氧化phosphatidylcholine-induced规定TLR4-mediated炎症信号也报道称JNK-dependent [43]。此外,细胞外HSP60-induced炎性物活化控制的事件被披露在心肌细胞(44]。最后,大量的抗炎药物的抗炎作用和提取等inflexanin B, sargachromanol G,青蒿素被证实是由直接或间接抑制物(45- - - - - -47]。因此,我们的研究结果有力地表明,信号级联由IRAK1/4 TAK1, MKK4/7,物,参与TLR4-induced炎症反应,可能是主要的目标。此外,一些酶如菲英岛,5-lipoxygenase,基质金属蛋白酶,和ectonucleotidase已知药理CA的目标及其衍生物,CA苯乙基酯(17- - - - - -20.];这些研究表明这种化合物可能有共同的结构单元,允许同时交互的各种酶。这种化合物的作用机理与广泛的药理药效基因目标将进一步探索研究。

最终,CA的应用作为口服治疗管理在活的有机体内炎症的症状进行了测试。为此,我们采用一种急性炎症症状盐酸/ EtOH-treated小鼠模型。以前,我们发现炎症在这个模型中被塞来昔布减毒,选择性cox - 2抑制剂(数据未显示),这表明cox - 2参与了特定的炎症过程。除了铂族元素的抑制₂生产和cox - 2的表达,也大力改善胃炎症状水平类似的控制药物(图雷尼替丁5(一个))。有趣的是,分析物,IRAK1, IRAK4暗示这些在体外CA的目标也可以抑制在活的有机体内炎症反应。因此,物磷酸化和IRAK1/4退化被CA(图镇压5 (b))。另一方面,其他一些团体已经证明了在活的有机体内活动的CA。阴组提供CA在膳食丸和发现1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine注射(MPTP药物)诱导炎症小鼠的脑损伤保护CA通过抑制和铂族元素₂生产(48]。也证实,铁nitrilotriacetate (Fe-NTA)全身的肾脏炎症是强烈的口头管理CA(20和40毫克/公斤)49]。CA的口服(5 - 100毫克/公斤)显示抑制醋酸段地扭动着晚期formalin-induced在小鼠疼痛₅₀值分别为22.38和10.92毫克/公斤(50]。因此,之前的报告和我们的研究结果有力地表明,CA是一个很好的候选化合物的口头管理在活的有机体内炎症性疾病的治疗。

总之,我们已经证实CA变弱TLR4-mediated炎症反应如没有和铂族元素₂生产LPS-treated RAW264.7细胞和改善盐酸/ EtOH-induced急性胃炎症状。通过分析抗炎机制,我们发现CA强烈抑制AP-1通过抑制相关的上游信号级联激活酶,包括IRAK1, IRAK4, TAK1, MKK4/7,物,总结在图6。特别是,直接激酶试验强烈表明,CA抑制IRAK1, IRAK4。因为这些酶是最近透露各种炎症反应,发挥了关键作用的能力CA抑制其他IRAK1/4-mediated炎症症状将进一步评估。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。作者仅负责内容和论文的写作。

作者的贡献

吴Seok杨Deok宋,Young-Su易建联同样导致了这项工作。

确认

这项研究受到了生物产业技术发展项目(PJ 111060 - 02 - 1 - sb010)外交部对食物、农业、林业和渔业和土地、交通和海事。

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