文摘

几项研究已经提供了证据关于神经保护的好处高压氧(HBO)治疗中风的情况下,和HBO也促进骨髓干细胞(bmsc)增殖和动员。本研究主要探讨HBO治疗的影响迁移的bmsc,卒中后神经发生、胶质增生,炎症。老鼠持续短暂性大脑中动脉闭塞(MCAO)用HBO治疗三周或者两天。结果检查使用行为的测试(修改神经严重程度得分,mns)和免疫染色评估bmsc的HBO治疗对迁移的影响,神经发生,和神经胶质过多症,神经营养因子的表达也被评估。有一个较低的mns得分在三周HBO组相比,为期两天的HBO组。动员的bmsc缺血区域更漫长HBO治疗改善,建议治疗的持续时间是至关重要的促进bmsc缺血性脑的归航HBO治疗。HBO也可以刺激的营养因素和改善神经发生和神经胶质过多症。这些影响可能有助于在缺血性中风后神经修复,和增加的HBO治疗可能提高治疗对缺血性中风的影响。

1。介绍

缺血性中风的特点是血流量和氧的干扰大脑组织(1]。局灶性缺血期间,周围组织缺血性核心被称为半影,仍然是可行的和可能的目标是拯救2]。目前批准的唯一有效的治疗方法在临床实践中是早期溶栓治疗和再灌注。然而,大多数缺血性中风患者未能及时得到正确的管理。中风仍然是人类死亡和残疾的一个重要原因和中风的治疗仍然是一个重要的健康问题。

高压氧(HBO)已经被用来作为主要或辅助中风治疗多年。HBO治疗的神经保护机制后缺血被认为是由改善氧气供应(3]。好身体的证据显示,神经HBO治疗。HBO治疗可以减少梗死体积MRI检查,提高神经系统的结果(4]。高压氧还发现减少缺血再灌注损伤引起的中性粒细胞(5]。研究也表明,暴露在HBO将导致快速动员骨髓干细胞在人类,和骨髓干细胞(bmsc)的数量仍然升高外周血HBO治疗过程中(6]。

bmsc移植大鼠有增强机体各种神经疾病的结果,如缺血性中风(7),脊髓损伤(8),和创伤性脑损伤9]。然而,“归巢”bmsc再生治疗非常重要。在这项研究中,我们测试了HBO的假设可以促进bmsc的动员和迁移缺血性脑,衰减缺血性损伤,提高功能恢复。我们评估的HBO治疗效果短暂性大脑中动脉闭塞(MCAO)。进一步我们测试假设bmsc将改善神经发生,神经胶质过多症,神经营养因子(BDNF脑源性神经营养因子;神经生长因子、神经生长因子;和glial-derived神经营养因子,GDNF)水平,MPO的表达(呈现中性粒细胞活性)。

2。材料和方法

2.1。动物

成年男性Sprague-Dawley老鼠重270 g - 320 g被用于这些实验。他们在12小时光/暗周期,允许自由获取食物和水。所有实验程序指令的台湾国家科学委员会和批准的国立成功大学动物保健和使用委员会正在尽一切努力减少不适手术和恢复期间。MCAO侮辱或虚假的过程后,老鼠接受高压氧(HBO)治疗或正常氧条件根据组织目标。老鼠被随机分配到四组之一:(1)虚假的组:大鼠接受外科手术但没有MCAO;(2):组:大鼠MCAO持续但没有HBO治疗;(3)HBO2ds:大鼠MCAO和接受了两天HBO治疗,牺牲在21天;(4)HBO3wks:持续MCAO大鼠,HBO获得15天(5天/周)课程,牺牲了21天。流程图如图1。食物和水是免费随意在整个实验过程。

2.2。大脑中动脉闭塞

老鼠与腹腔麻醉(ip)注射氯胺酮(2毫克/ 100克)。短暂性大脑中动脉闭塞(10- - - - - -12使用的方法)是诱导管腔内的血管闭塞。温度是不断监测直肠探头和维持在37.0°C,恒温控制的加热垫。简单地说,正确的颈总动脉,颈外动脉(ECA),颈内动脉(ICA)暴露。4:0单丝尼龙缝线,提示集中加热附近的火焰,是先进的ECA ICA的腔,直到它阻止了MCA的起源。MCAO后一个小时,再灌注是通过撤军的缝合,直到提示了ECA的腔。

2.3。HBO治疗

HBO会话进行了如下程序。每个老鼠放入HBO室再灌注后,然后用100%的氧气治疗253 kPa (2.5 atm)为90分钟。室充满了纯氧(100%)加压到253 kPa 51 kPa /分钟的速度为90分钟,并终止减压20 kPa /分钟。

2.4。评估脑梗死和功能的结果

使用修改功能结果评估神经严重程度评分(mns) [13]。老鼠被几个测试评估,比如提高老鼠的尾巴,把老鼠放在地板上,和梁平衡行走,那么所有考试成绩被添加到mns分数(如表所示1)。mns评估之前进行MCAO 1, MCAO后7、14、21天。此外,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色14)是用来检查大脑梗塞大小。无色TTC减少到一个红甲瓒脱氢酶产品,最丰富的线粒体(15]。老鼠在第三天牺牲了,21天。由于TTC染色是脱氢酶酶活性的功能测试,通常用于早期组织化学诊断的违规16]。因此,老鼠牺牲在第三天检查违规改变通过TTC。后记录mns得分直到21天,老鼠都牺牲了21天,然后做免疫化学染色。深麻醉下(戊巴比妥钠,100毫克/公斤,ip)灌注老鼠intracardially盐水。大脑组织被移除,在冷盐水浸泡5分钟,切成2.0毫米部分。大脑切片孵化在TTC溶解在2%磷酸缓冲盐(PBS) 30分钟在37°C,然后转移到5%甲醛溶液固定。

2.5。BrdU标记

BrdU(罗氏),一个胸苷类似物纳入的DNA在S期细胞分裂,是用于有丝分裂标签。标签协议遵循那些先前描述(17]。累计标记方法用于检查的人口增殖的细胞,与老鼠接受每日腹腔内注射50毫克/公斤BrdU连续15天,在HBO的第一天开始。的BrdU⁺海马和皮层的细胞在两个半球数字计算使用20 x与激光扫描共焦显微镜物镜(LSM510;卡尔蔡司缩微成像,Inc .)通过计算机成像分析系统(成像研究)。对于每一个动物,40日冕部分(每12μ在海马和皮层厚)进行了分析。图像分析也用于检查BrdU的分布⁺细胞Neu-N和GFAP。

2.6。免疫组织化学

动物可以生存MCAO后21天,当时动物牺牲与聚氨酯(1.5 g / kg, IP)。老鼠的大脑被transcardial固定与生理盐水灌注,其次是灌注和沉浸在4%多聚甲醛。大脑被移除,然后沉浸在PBS 15%和30%蔗糖过夜。间接损伤区(同侧半球的完整区域)减去从侧半球的面积计算。病灶体积提出了病变的体积百分率较对侧半球。

单引号或双免疫荧光染色法是用于识别细胞来自bmsc。染色,相邻12μ米厚的部分(1)连续2摩尔/ L HCl-incubated 30分钟,(2)冲洗0.1 mol / L硼酸(pH值8.5)在室温下10分钟,(3)孵化一夜之间主要抗体在PBS含有0.5%正常驴血清在4°C,和(4)孵化与二次抗体室温1小时。顺序,抗体是鼠单克隆anti-BrdU (abcam, 1: 200),鼠单克隆anti-CD34 (Biolegend, 1: 200),鼠标单克隆anti-NeuN(微孔,1:200),兔多克隆anti-GFAP(微孔,1:1000),兔多克隆anti-Myeloperoxidase (abcam, 1: 100), DAPI(σ1:1000),Alexa面粉488 -共轭山羊anti-mouse抗体,Alexa面粉488 -共轭驴anti-rabbit抗体,Alexa面粉488 -共轭驴anti-mouse抗体,抗体和Alexa面粉594 -共轭驴anti-rat(表达载体)。部分没有BrdU然后孵化与DAPI和盖玻片安装介质(荧光安装介质;Dako)。

2.7。激光扫描共焦显微镜和血细胞计数

Colocalization与神经元BrdU标记是由激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)使用Bio-Rad MRC 1024(氩和氪)激光扫描共焦成像系统安装到蔡司显微镜(Bio-Rad)。对免疫荧光double-labeled日冕部分,绿色(FITC NeuN和GFAP)和红色花青- 5.18 (BrdU Cy5)荧光染料的部分很兴奋的在488 nm和647 nm激光;顺序排放获得2单独的光电倍增管通过522 nm和680 nm排放过滤器,分别。感兴趣的细胞和组织使用TissueQuest软件血细胞计数统计。

2.8。逆转录聚合酶链反应

从虚假的海马,MCAO、HBO2ds HBO3wks解剖。总rna分离使用试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的指示。逆转录等量的总RNA进行了使用上标二世第一链合成装备(英杰公司)根据制造商的指示。获得cDNA放大使用以下引物:BDNF, 5′-CAGTGGACATGTCCGGTGGGACGGTC-3′, 3′-TTCTTGGCAACGGCAACAAACCACAAC-5′;GDNF, 5′-AGGGGCAAAAATCGGGGGTG-3′, 3′-GCATGCATCCACGACTCGGA-5′;GAPDH, 5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3′, 3′-TCTTACTCCTTGGAGGCCATG-5′。

2.9。统计分析

结果表示为均值±SE为三个或更多独立的实验。比较数据,我们使用方差分析测试。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。HBO改善功能结果和减少梗死大小

HBO治疗结果在老鼠评估使用修改后的神经严重程度评分(mns)。少一个较低的分数表示老鼠从MCAO神经缺陷,提出了改进结果在HBO治疗。行为测试显示大鼠有显著改善功能结果当收到再重复HBO治疗()。尽管只有两天的HBO治疗HBO2ds组大鼠仍然显示功能改进在接下来的几天,mns表达曲线下降,直到第14天()。和下降曲线的mns HBO3wks集团在14天之后变得更加明显)(图2(一个))。TTC染色显示缺血区在老鼠的脑组织。更白的颜色变化在MCAO组的脑组织被发现,与更多的缺血性损伤,与其他群体相比(图2 (b))。行为测试评估mns: MCAO3wks,持续MCAO大鼠,但是没有HBO治疗;HBO2ds持续MCAO大鼠,但两天HBO治疗;HBO3wks,持续MCAO大鼠,但重复的HBO治疗三周。梗塞的区域显示TTC染色(白色)是著名的MCAO组,但在HBO治疗组降低。这表明,HBO可能减弱脑缺血性损伤大鼠(图2)。

3.2。HBO改善bmsc移植到大脑

CD34-DAPI双染色显示脑组织bmsc的演讲。CD34-DAPI双重染色细胞的数量是高于HBO3wks集团与耻辱集团MCAO3wks组和HBO2ds组(图3(一个))。这表明,老鼠招募bmsc急性中风后大脑损伤,而HBO治疗。然而,bmsc的招募数量是不够的。HBO治疗促进迁移的bmsc局部缺血性损伤后大脑。长期和反复HBO将增强增加bmsc迁移(数据3 (b)和3 (c))。迁移BMSC,呈现双CD34和DAPI染色,发现MCAO3wks集团HBO2ds集团和HBO3wks组。有增加数量的紫色细胞(双与CD34染色,红色,和DAPI,蓝色)HBO3wks组。代表图像的组织使用TissueQuest软件如图血细胞计数3 (b)。CD-34阳性细胞和DAPI阳性细胞数和信号强度量化。双染色细胞的数量与CD34和DAPI骗局组14.16%,17.09% MCAO3wks集团HBO2ds组21.99%,分别HBO3wks组和39.4%。双阳性细胞的数量与CD34和DAPI在缺血性边界被记录在所有细胞CD34阳性细胞的百分比。数据提出了平均值±标准平均误差(SEM)。这种差别十分明显而MCAO3wks组和HBO3wks组()。是更重要的区别与虚假的集团和HBO3wks集团()。

3.3。HBO MCAO-Induced增加神经发生

BrdU Neu-N双重染色细胞显示数量的新神经细胞的增殖perilesioned皮层和海马(数字4(一)和4 (b))。BrdU阳性细胞出现一个红色和Neu-N阳性细胞呈现绿色。的双重染色BrdU和NeuN细胞呈现黄色。有更多的黄色的细胞(表示新的扩散神经细胞)中发现HBO2ds组和HBO3wks组。然而,双重染色细胞的数量(黄色)HBO3wks组高。此功能显示HBO改善神经发生,但时间和重复HBO课程将引发更大程度的神经发生。

BrdU-NeuN双染色显示,有更多新形成的神经元细胞(黄色)缺血性边界地区的海马体(图4(一))和perilesioned皮层(图4 (b))。有更多BrdU和HBO3wk NeuN双重染色细胞组。图4 (c)显示使用TissueQuest软件组织血细胞计数的代表形象。BrdU阳性细胞和Neu-N阳性细胞数和信号强度量化。双染色细胞的数量与BrdU Neu-N骗局组10.43%,15.63% MCAO3wks集团22.81% HBO2ds集团HBO3wks组和34.95%,分别。双染色阳性细胞的数量与BrdU Neu-N缺血性边界被记录为BrdU阳性细胞在所有细胞的百分比。数据提出了平均值±标准平均误差(SEM)。这种差别十分明显,而MCAO3wks组和HBO3wks集团()。还是有区别的HBO2ds组和HBO3wks集团()。不同的是更重要的,因为相比之下,虚假的组和HBO3wks集团()。

3.4。HBO MCAO-Induced增加神经胶质过多症

BrdU和GFAP双染色细胞的数量显示新的齿状回神经胶质细胞,那时perilesioned皮层(数字5(一个)和5 (b))。BrdU阳性细胞出现红色和GFAP阳性细胞呈现绿色。BrdU和GFAP的双重染色细胞呈现黄色。有黄色的细胞(指示新的扩散胶质细胞)发现MCAO3wks组(24.61%),HBO2ds组(22%)和HBO3wks组(30.93%)。然而,双重染色细胞的数量(黄色)似乎HBO3wks组高。这表明时间和重复性HBO课程会诱发更大程度的神经胶质过多症。证明BrdU-GFAP双重染色细胞的数据显示,有更多的新成形或反应性神经胶质缺血性边界地区(齿状回(图5(一个))和皮层(图5 (b)))。还有更多的双重染色细胞HBO3wks集团(黄颜色的细胞)。BrdU和GFAP双染色阳性细胞缺血性边界被记录为BrdU阳性细胞在所有细胞的百分比。数据提出了平均值±标准平均误差(SEM)。尽管存在双重染色细胞发现HBO3wks组无统计学差异,HBO3wks集团,与其他群体相比。

3.5。HBO MCAO-Induced减少炎症急性期

急性炎症的急性期脑梗塞会招募中性粒细胞,沉积在血管缺血性边界区域的大脑,并进一步引起脑组织损伤。MPO表达评估程度的急性炎症和MPO染色显示在半影MPO纹状体(图的表示6(一))。有发现与降低MPO表达式HBO2ds组(8.24%)和HBO3wks组(2.15%),而MCAO3wks组(27.2%)(数据6 (b)和6 (c))。表明,HBO治疗可以降低MPO表达,代表与减轻急性炎症。长和重复的HBO治疗在衰减炎症似乎更有效果。

3.6。HBO MCAO-Induced神经营养因子水平增加

神经营养因子的表达,包括脑源性神经营养因子和GDNF,评估采用逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)。附近的神经营养因子可能提供细胞旁分泌作用,促进细胞增殖。的mRNA表达BDNF和GDNF显示有BDNF和GDNF生产在MCAO大鼠MCAO大鼠用HBO治疗。然而,更高的BDNF的表达和GDNF HBO3wks组中被发现(图7(一))。有更多BDNF和GDNF生产HBO3wks组(分别增长3.32,比虚假的2.02倍),相比之下,HBO2ds组(分别增长1.43,比虚假的1.43倍)和MCAO3wks组(分别增加0.94——1.02倍比虚假的)(数据7 (b)和7 (c))。结果表明,时间和重复的HBO治疗促进神经营养因子的生产,包括脑源性神经营养因子和GDNF。

4所示。讨论

中风治疗中风是一个重要的话题,因为可能会导致死亡或残疾,改变患者的日常生活质量,显著提高社会经济成本。缺血性中风的特点是脑动脉阻塞,导致区域脑流量减少或中断。先前的研究表明,高压氧治疗可能减弱缺血性损伤在成年大鼠(18]。

HBO治疗增强脑组织氧合治疗期间。不过,HBO治疗和恢复正常终止后的氧化,身体被暂时在相对缺氧状态。这个氧过多,然后把相对缺氧,命名氧循环,将导致缺氧诱导因子- 1α(HIF-1α)生产19,20.]。preconditional缺氧会减少缺血性中风相关的损伤(21]。最近的研究也表明氧气循环有助于在创伤性脑损伤19和干细胞治疗心肌梗死22]。上述研究表明,氧气循环可能减弱缺血性损伤。

在我们的研究中,3周的氧气循环疗程对MCAO大鼠最好功能结果相比,老鼠接受为期两天的高压氧疗程。它提出了较低的mns,减少梗塞大小对大脑切片,和与TTC染色面积有所下降。有几个好处在HBO治疗中风,包括降低血脑屏障通透性,脑水肿(22),和衰减的炎症23]。HBO也可能减弱氢氧自由基生产和谷氨酸释放,因此减少脑损伤(24]。

尽管高压氧可能导致氧化应激,激活活性氧(ROS)(即生产活性氧自由基),被认为对大脑有害。Oxygen-activated活性氧(ROS)可以激活一氧化氮合酶(NOS) [25),促进代。没有是众所周知的一个强有力的血管舒张和衰减是至关重要的血小板聚集,过氧化物生产,调节微血管通透性(22,26- - - - - -28]。先前的研究发现HBO增加一氧化氮水平通过刺激血管周围组织一氧化氮合酶(NOS) [29日]。此外,HBO也刺激骨髓NOS。骨髓干细胞将会更加激增,更容易从骨髓动员,和自导缺血性病变(迁移)HBO治疗后6]。

HBO能刺激vasculogenic骨髓干细胞动员的糖尿病患者和更多的细胞是招募skinwounds帮助愈合30.,31日]。在创伤性脑损伤,HBO可能刺激神经发生。骨髓干细胞可能被大脑受伤后(19]。尽管先前的研究对HBO治疗脑梗塞大鼠显示骨髓干细胞被招募了缺血性脑,大多数这些研究使用短HBO自行车课程。在我们的研究中,三个星期的氧气循环疗程诱导bmsc动员到大脑超过两天课程。CD34 +细胞在缺血边界地区被发现。这是与迁移的bmsc缺血性脑组织(32,33]。这个数据表明HBO治疗的剂量依赖效应归航的BMSC缺血性脑组织。在HBO治疗,伴着更加突出的集团3周之久,组2 ds。这些数据表明,重复HBO治疗激活更多的bmsc从骨髓动员,然后迁移到大脑。

在这项研究中,重复和更长的HBO治疗增加更多的bmsc动员缺血性脑。是知道bmsc交通缺血性组织与stromal-cell-derived因子- 1被rela交互α(SDF-1α)和趋化因子受体4 (CXCR4) [34,35]。在大鼠缺血性中风,SDF-1水平显著增加受伤的半球的半球[相比36]。在缺血性中风患者中,也发现了SDF-1增加α(37]。的分泌SDF-1α可以作为化学引诱物促进循环的归航趋化因子受体CXCR4阳性细胞(如bmsc) (38然后帮助受伤的组织与细胞维修。因此,进一步研究HBO, SDF-1α和趋化因子受体CXCR4仍然是需要的。

归航的bmsc再生治疗是非常重要的,不仅在中风治疗,而且在其他中枢神经系统疾病。bmsc移植的老鼠被发现在缺血性中风减弱神经损伤(7),脊髓损伤(8),和创伤性脑损伤9]。中枢神经系统退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)、皮下注射g - csf将增加对大脑bmsc动员救援病变(39]。在这项研究中,我们提供了另一个方面为HBO治疗中风的角度bmsc救援。bmsc的归航的缺血性边界老鼠大脑,刺激由HBO,会促进神经可塑性,刺激生长因子和细胞因子的生产,和减弱炎症40]。

BrdU-labeled细胞表达Neu-N(独特的神经元和轴突)出现在HBO MCAO大鼠治疗。表达水平的群HBO3wks更加突出,而HBO2ds集团。这表明,长氧循环最好保护脑缺血大鼠,远离神经损失,增加神经细胞的数量。此外,这些迁移的bmsc,更促进了HBO,可能细胞分化转移(41]或帮助轴突重建42];他们也可能刺激mRNA转录生长因子和细胞因子,从而激活神经干细胞(已经在齿状回住房和subventricular区)(43,44增殖和迁移。

在这项研究中,BrdU-labeled细胞与GFAP表达(相当胶质血统)出现在HBO治疗MCAO大鼠。表达水平的群HBO3wks更加突出,而HBO2ds集团。这表明有更多群HBO3wks胶质增生的程度。最近的研究强调的双重影响神经胶质过多症(包括有害和有益的神经保护和功能恢复)(45]。时间和信号分子神经胶质过多症是指它的最终命运46]。相应的最终功能改善大鼠,我们假定,氧气循环时间过长可能会帮助克服不利影响胶质增生和捐赠其有益效果,通过调节炎症和营养因素影响生产。

在这项研究中,神经营养因子如脑源性神经营养因子、神经生长因子、GDNF进行评估。在氧循环,BDNF水平,神经生长因子,GDNF与对照组相比增加。有更多的脑源性神经营养因子和神经生长因子生产集团HBO3wks相比HBO2ds组。“整个神经与血管的保护单位”的概念在脑梗死治疗提出了建议的保护神经元本身可能不工作,强调了神经元之间的相互作用,神经胶质,大脑内皮(47]。脑内皮细胞BDNF的主要来源。脑源性内皮药用旁分泌和自分泌通过脑源性神经营养因子和神经生长因子(48]。更多的BDNF生产表明,脑内皮是用更少的损害,恢复(12),可能导致增加细胞分化转化的数字迁移bmsc或营养因子的分泌嫁接bmsc [49]。

炎症是一个防御反应对侮辱限制损伤和去除有毒物质50]。缺血性中风是相关的急性和长期的炎症过程,其特征是居民神经胶质细胞的激活,炎性细胞因子的生产,和大脑中的白细胞和单核细胞浸润51]。中性粒细胞招募可能导致微血管闭塞,释放促炎细胞因子,然后进一步造成损害。在这个角度看,MPO活性,呈现中性白细胞活动,在本研究评估。结果表明,在降低MPO HBO3wks活动组。它表示不再氧气循环会减弱炎症。与先前的研究结果也是记者,这表明,HBO治疗可能减少当地MPO活性,中性粒细胞浸润,梗死体积,从而增强功能结果与局灶性缺血大鼠(19,51]。

5。结论

HBO治疗可能减弱炎症大鼠缺血性中风。它可能促进更多的企业综合生产、动员和迁移到缺血性脑。那些bmsc刺激神经发生和神经胶质过多症。这个长氧循环(HBO治疗中风的重复安排3周)治疗策划胶质增生和营养因子生产(脑源性神经营养因子、神经生长因子、和GDNF)和中性粒细胞减少有害影响的早期阶段。

作者的贡献

C.-P。Chang和L.-C。王同样导致了工作。

利益冲突

作者报告没有利益冲突或与此相关的研究发现在本文中指定。

确认

作者感谢苏Chao-Ping技术支持。作者也感激Ya-Chun萧服务对于FACS-like组织血细胞计数的图像采集和分析临床医学中心,国立成功大学医院。本研究从高雄市政Ta-Tung医院由格兰特,高雄医科大学(格兰特kmtth - 101 - 004)。