文摘

高血压与慢性炎症有关,和toll样受体4 (TLR4)已被证明是与高血压的开发和维护。本研究旨在探讨黄岑素的影响(由连续两周每天口服填喂法)对大脑TLR4 /核因子k B - (NF -κB -)介导的炎症和血压在肾血管性高血压老鼠(使用2-kidney, 2-clip方法)。免疫荧光和免疫印迹分析西部发现高血压导致TLR4的激活和NF -κB,伴随着显著增强的促炎介质的表达,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β),interleukin-18(地震)。此外,抗凋亡蛋白的表达,骨髓细胞leukemia-1 (Mcl1),是减少,pro-apoptotic蛋白质、伯灵顿cleavedcaspase-3 p17增加在脑皮层和纹状体可溶性溶解产物相结合。黄岑素显著降低血压和减毒的活化的小胶质细胞和巨噬细胞数量的高血压大鼠的大脑。此外,黄岑素显著降低TLR4的表达,NF -κB p65, TNF -α,il - 1β、地震、伯灵顿和cleaved-caspase-3 p17, Mcl1的表达增加。整体而言,这些结果表明,黄岑素展品抗炎和抗凋亡的属性和高血压大鼠的血压降低。因此,黄岑素hypertension-associated疾病可能是一个潜在的治疗代理。

1。介绍

高血压是心血管疾病的主要危险因素事故(1),也可能加速缺血中风的发病和进展和脑出血2]。高血压与慢性炎症有关,这可能与hypertension-mediated靶器官损害(3]。脑实质炎症可能发生局部流程,可以触发和持续激活的胶质细胞,这被认为是导致一些疾病的发病机理(3]。先天免疫反应,主要由toll样受体(通常),已被证明会导致这种情况的发展4]。

通常是一线分子对初始的先天免疫反应,因此其信号参与激活小胶质细胞的病原体和宿主细胞受损。活化的小胶质细胞通常被认为是“古典”的激活(5]。活化的小胶质细胞随后秘密促炎细胞因子和表达costimulatory分子所需的保护性免疫反应的病原体和高效清除受损组织(6]。TLR4是一个重要的贡献者小胶质激活和已知启动炎症级联反应各种脑损伤(7]。TLR4已被证明是与高血压的开发和维护8]。此外,TLR4参与脑血管疾病,包括中风(9和神经退化10]。TLR4-mediated信号激活核转录因子(NF -κBκB)信号通路中起关键作用的免疫和炎症反应,细胞死亡和生存5,9]。因此,增强大脑TLR4的表达/ NF -κB可能发挥重要作用在脑病理引起高血压。

5、6、4-Trihydroxyflavone-7-O-glucoronide(黄岑素)是一种黄酮的主要活性成分飞蓬属植物breviscapus (Vant)。的草药使用Hand-Mazz东方治疗脑血管疾病(11- - - - - -13]。近年来,许多研究在不同的动物和细胞模型提供了证据的黄岑素的保护作用,因为抗氧化剂(12,14,15],凋亡[14,16- - - - - -18,抗炎19,20.)和钙通道拮抗剂属性(21]。因此,本研究的目的是调查是否黄岑素治疗减少大脑TLR4的表达/ NF -κB、炎症状态和肾血管性高血压大鼠的血压。

2。材料和方法

2.1。动物

实验过程都是批准的机构中山大学动物伦理委员会和根据指导进行的实验动物保健和使用国家健康研究所(没有出版。80 - 23,1996年修订)。共有24个男性Sprague-Dawley老鼠(60 - 80 g)购买从中山大学实验动物中心。老鼠被随机分为四组(每组6大鼠):(1)sham-operated集团(血压正常的控制),(2)用生理盐水(NS)治疗高血压,高血压(3)与低剂量黄岑素(5毫克/公斤/天),和(4)高血压与高剂量(每天20毫克/公斤)黄岑素。黄岑素黄岑素(云南生物谷制药有限公司、云南、中国)溶解在无菌NS,和不同剂量的黄岑素由填喂法持续2周。

2.2。高血压模型和药物管理局

高血压是诱发使用2-kidney 2-clip方法(2 k2c),如曾庆红et al。所述22]。短暂,与10%水合氯醛麻醉(3毫升/公斤体重,腹腔内[i.p。]),平均纵向切口的腹部皮肤了,然后根的左、右肾动脉被放置环形收缩的银剪辑的内径0.30毫米诱发高血压。大约8周后,这些老鼠与收缩压高于140毫米汞柱,没有中风症状被选作实验。不同剂量的黄岑素由填喂法每日2周。NS组高血压大鼠给予生理盐水的体积与黄岑素相同。肾动脉sham-operated老鼠也做过手术,但是没有剪辑的位置。收缩压(SBP)是衡量一个间接tail-cuff血压计(MRB-IIIA、上海高血压研究所、上海、中国)在有意识的老鼠热(热灯在37°C, 5分钟)前后肾动脉收缩(每隔一周)10周(23]。

2.3。组织样本的准备

组织样本进行的准备工作如前所述[24,25]。简而言之,黄岑素治疗2周后,大鼠深麻醉下牺牲10%水合氯醛(5毫升/公斤体重,i.p)。然后transcardially灌注0.9%氯化钠(在4°C)。大脑被移除,左前额大脑皮层和纹状体快速切割,用于西方免疫印迹分析。免疫荧光标记,右额叶脑切片成水平部分(10μ米厚)使用CM1900低温恒温器(徕卡、海德堡、德国),这些部分,然后用4%多聚甲醛固定(在0.01 m磷酸盐(PBS), pH值7.4)。

2.4。免疫荧光标记

免疫荧光法进行了如前所述[7]。短暂,部分preincubated Triton x - 100 0.3% 0.01 PBS(10分钟),阻止了10%正常山羊血清(美国CA KPL)在室温下(1 h RT),然后孵化(隔夜在4°C)与主抗体(主要抗体稀释剂(Dako、丹麦)):兔子anti-TLR4(1: 100)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),鼠标anti-Neuronal核(NeuN)(1: 400)(美国Chemicon),鼠标anti-rat胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(1: 800)(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),或鼠标anticluster分化11 b (CD11b或OX-42)(1: 300)(美国微孔)。部分被孵化Alexa萤石555共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L), F (ab′) 2片段(1:1000),Alexa萤石555共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L), F (ab′) 2片段(1:1000)(从细胞信号技术),或荧光素isothiocyanate-goat anti-mouse免疫球蛋白抗体(1:200)(美国病菌)0.01 PBS (1 H RT)。部分复染色细胞核被暴露于4′,6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐(1:1000)(罗氏,曼海姆,德国),然后安装在延长黄金不变色试剂前(美国表达载体P36930)成像。免疫反应性是可视化使用BX51显微镜(奥林巴斯)。负控制部分与PBS孵化,没有显示出积极的染色(数据未显示)。

2.5。西方免疫印迹分析

如前所述(执行西方免疫印迹26]。短暂,左前额大脑皮层和纹状体均质裂解缓冲(pH值7.6)为0.01μg / mL phenylmethanesulfonyl氟化物离心机(30分钟16400 rpm),然后使用bicinchoninic蛋白质浓度测定酸(BCA)蛋白质分析工具包(美国皮尔斯)根据制造商的指示。可溶性蛋白(50μg)是由4 - 20%梯度SDS /页面(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)(Bio-Rad),然后转移到聚偏二氟乙烯膜(美国微孔)。膜被封锁在Tris-buffered盐水与5%脱脂牛奶含有0.1% Tween-20然后孵化与主抗体:兔子anti-TLR4(1: 1000),鼠anti-interleukinβ1 (il - 1β)(1:1000),兔子anti-myeloid细胞leukemia-1 (mcl1)(1: 1000)(美国从Abcam),鼠标anti-NF -κB p65(1: 1000)(细胞信号技术,美国),山羊抗肿瘤坏死因子-α(TNF -α)(1:5000)(美国罗福斯生物制品),兔子anti-IL-18(1: 300),兔子anti-Bax(1: 300),或鼠标anti-caspase-3 p17(1: 300)(美国从圣克鲁斯生物技术)。膜暴露在二级抗体稀释在室温下阻断缓冲区1 h:辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-mouse(1: 6000)(美国EarthOx) HRP-conjugated山羊anti-rabbit(1: 3000)(细胞信号技术),或HRP-conjugated兔抗体免疫球蛋白抗体(1:3000)(美国表达载体)。鼠单克隆抗β肌动蛋白(1:3000)(Proteintech Group Inc .)、美国)担任管家蛋白。免疫反应性的乐队使用化学发光检测合衬底(美国微孔)和可视化在柯达X-OMAT电影。归一化的光学密度β肌动蛋白和计算作为目标蛋白表达/β肌动蛋白表达率(使用图像J 1.42 q)。

2.6。图像分析和量化

所有与Image-Pro组织学图像分析+图像分析软件(美国马里兰州银泉的媒体控制论)盲法评估员。积极染色细胞的数量是计算使用Image-Pro +图像分析软件在9个可比性,不重叠的领域(425μm×320μm;每节×3字段3节/鼠)和提出了每个领域的平均细胞数在每个部分27,28]。

2.7。统计分析

所有数据都表示为±标准差和均值分析单向方差分析(ANVOA)其次是至少显著差异(LSD)事后考验。意义的值了和。进行统计分析和统计产品与服务解决方案(SPSS) 13.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。黄岑素治疗对SBP的影响

四组之间的基线SBP相似。SBP仅略降老鼠,但增加逐步增加到174.7±13.9,180.9±6.2,178.8±6.7,126.4±9.8 mmHg NS,低剂量,大剂量,分别和sham-operated组(图1)。SBP在NS,低剂量和高剂量组明显高于与sham-operated集团()。没有中风或死亡的发生率在四组(表中1)。没有发现显著差异在SBP在NS治疗之前,低剂量和高剂量组。与NS组(196.5±9.8毫米汞柱),黄岑素治疗显著降低SBP剂量依赖性的方式()。低剂量组、SBP是下降了大约11.5±6.5毫米汞柱,从180.9±6.2毫米汞柱169.1±7.1毫米汞柱。高剂量组、SBP降低了大约17.2±7.4毫米汞柱,从178.8±6.7毫米汞柱161.2±9.9毫米汞柱。此外,SBP显著不同低剂量和高剂量组(),明显高于与sham-operated组(137.2±8.3 mmHg) ()。

3.2。黄岑素减少活化的小胶质细胞/巨噬细胞在高血压大鼠的数量

OX-42标签小胶质细胞和巨噬细胞。慢性高血压诱导小胶质细胞/巨噬细胞激活(图2)。与假组相比,细胞的数量积极沾OX-42 NS组显著增加(178.7±18.5 /毫米²和86.2±16.8 /毫米²)()。相反,细胞的数量肯定沾OX-42显著降低低剂量和高剂量黄岑素,143.1±21.9毫米²和117.4±17.8 /毫米²分别为()。此外,计数高剂量组与低组相比显著降低()。

3.3。黄岑素抑制降大脑TLR4的表达

TLR4免疫反应性在大脑皮层和纹状体稀疏sham-operated老鼠(图3(一);虚假的)。相反,慢性高血压引起更高的TLR4表达在这些区域(图3(一);高血压)。TLR4是进一步追究其细胞分布(NeuN)使用标记神经元,星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞(OX-42)。大多数的TLR4(红色)与OX-42-positive colabeled细胞(绿色)(图3(b);(A))。相比之下,一些TLR4-positive细胞co-labeled GFAP-positive(绿色)(图3(b);(B))或NeuN-positive(绿色)(图3(b);(C))细胞。免疫印迹分析表明,西部与sham-operated组相比,TLR4的蛋白质含量明显增加(大约6倍)NS组(图3(c)) ()。然而,黄岑素治疗显著降低剂量依赖性的方式,这个水平约39.9%和72.1%的低剂量和高剂量组,分别为(图3(c)) ()。

3.4。NF -黄岑素减降表达式κB,肿瘤坏死因子-α,il - 1β,地震

TLR4介导转录因子的激活,如NF -κB,随后引发炎性细胞因子的生产。在目前的研究中,西方免疫印迹分析表明,与虚假的集团相比,蛋白质含量的NF -κB p65, TNF -α,il - 1β,地震- NS老鼠明显增加了约7 - 6.5 - 3.7 - 4倍,分别(数字4(一)- - - - - -4 (d))()。这些蛋白质被黄岑素显著降低,与高剂量组诱导衰减显著高于低剂量组(数据4(一)- - - - - -4 (d))()。水平的NF -κB p65, TNF -α,il - 1β,地震被减少到51.1%,61.2%,82.9%,和83.3%,分别在低剂量组与31.4%,41.9%,57.8%,和53.4%,分别在高剂量组。因此,这些结果表明,黄岑素减少hypertension-mediated诱导的炎症反应。

3.5。黄岑素治疗调节Mcl1的表达,抑制巴克斯和Caspase-3 p17

探讨黄岑素的潜在影响神经细胞生存,我们评估apoptosis-related蛋白的表达,Mcl1,伯灵顿,cleavedcaspase-3 p17高血压和sham-operated老鼠的大脑。免疫印迹分析表明,西部与虚假的集团相比,Mcl1水平,伯灵顿,cleavedcaspase-3 p17在高血压大鼠显著增加(数据5(一个)- - - - - -5 (c))()。与虚假的老鼠相比,Mcl1,伯灵顿,cleavedcaspase-3 p17明显()在NS组升高约2 - 3.8,和8.9倍,分别。与NS组相比,治疗黄岑素显著调节Mcl1水平,特别是在高剂量组(约2.1倍与NS组)(图5(一个))()。然而,黄岑素显著下调伯灵顿的水平和cleavedcaspase-3 p17蛋白剂量依赖性的方式,为71.4%和73.9%(伯灵顿和cleavedcaspase-3 p17,职责),低剂量组和56.3%和27.1%(伯灵顿和cleavedcaspase-3 p17, resp)。高剂量组(数据5(一个)和5 (c))()。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,黄岑素是预防慢性降激活大脑TLR4和随后的NF -κB-mediated炎症反应。我们表明,黄岑素具有抗炎和抗凋亡特性和降低血压,从而表明其作为潜在的治疗代理hypertension-associated疾病。

在中枢神经系统,TLR4表达报道小胶质细胞和星形胶质细胞,以及神经元(7]。在这项研究中,慢性高血压增强TLR4的表达主要在小胶质细胞/巨噬细胞细胞,表明其参与慢性炎症降。然而,TLR4的表达在星形胶质细胞和神经元还建议他们潜在的参与,因此进一步的研究可以探索这个可能的关系。

先天和适应性免疫系统已被证明有助于hypertension-associated终末器官损伤,虽然这发生的机制尚不清楚29日]。先前的研究表明,增强TLR4的表达可能与高血压和慢性炎症的开发和维护,增强血管收缩性高血压大鼠(8,29日]。高血压引起心脏肥大,特点是慢性炎症和伴随着增加TLR4的表达和活性,和TNF -基因表达升高α和il - 6在心脏组织8]。anti-TLR4治疗是降低平均动脉压,在肠系膜动脉阻力TLR4蛋白,血清il - 6水平在自发性高血压大鼠(29日]。此外,TLR4信号也参与脑损伤和神经炎症过程与缺血性中风和神经退行性疾病,如阿尔茨海默病(10,30.- - - - - -32]。中和TLR4在脑出血(7和缺血性中风31日提供神经保护。这种效应可能导致从TLR4-mediated激活NF -κB信号通路与许多促炎的转录基因编码细胞因子,趋化因子,补充系统的蛋白质和细胞粘附分子。发现我们的研究显示,长期的高血压大鼠除了降低血压,黄岑素预防炎症介导神经元损伤通过抑制小胶质激活和NF -表达式的上升κB,肿瘤坏死因子-α,il - 1β和地震。底层机制涉及,至少在一定程度上抑制TLR4 / NF -κB-dependent信号通路。有趣的是,尽管治疗黄岑素SBP下降,抗高血压效应是温和的,没有剂量反应关系,表明黄岑素的低剂量可能就已经达到了最大的抗高血压作用。因此,降压作用可能扮演一个次要角色的保护活动对降黄岑素大脑炎症。因此,这些结果表明TLR4是一种很有前途的hypertension-associated疾病的预防和治疗的目标。

研究大鼠初级小胶质细胞和BV2鼠小胶质细胞细胞系表明黄岑素抑制LPS-induced核易位和NF - DNA结合活性κB,伴随着减少促炎介质的生产,如肿瘤坏死因子-α和il - 1β(11]。此外,最近的报告显示黄岑素的保护作用在脑缺血大鼠的大脑和心脏16,33]。符合这些结果,本研究发现,黄岑素hypertension-mediated减少神经元凋亡,可能导致减少TLR4和NF -κB-mediated促炎细胞因子的生产。

黄岑素是一种小分子,其神经保护作用已被记录在不同的脑疾病模型(13,33]。本研究进一步证明其抗炎和抗凋亡作用在大脑高血压。然而,黄岑素的精确分子机制防止降脑损伤仍然是难以捉摸的。保护分子机制,进一步研究药物动力学和大脑黄岑素的渗透将有助于解释其对血压的影响有限,为今后临床应用提供相关证据。

5。结论

总之,慢性高血压显著增强TLR4的表达,NF -κB,促炎细胞因子的生产,TNF -α,il - 1β,地震在高血压大鼠的大脑。黄岑素降血压的作用,通过抑制TLR4 / NF -提供神经保护作用κB-mediated炎症。因此,黄岑素可能对抗hypertension-associated疾病有疗效。

利益冲突

作者没有利益冲突披露。

作者的贡献

Xingyong陈和Xiaogeng史导致体内实验,RHR模型,黄岑素政府immunofluorescent标签、组织准备、免疫印迹分析,统计分析,论文的初稿。四美长导致免疫印迹分析。Xiaogeng史和钟山裴导致了设计研究中,概念的研究,修改论文,最终批准纸。Ruxun黄:设计研究中,金融支持,修改论文,最终批准纸。徐张回心Lei, Huanxing苏导致修正纸。所有作者阅读和批准了期末论文。Xingyong陈和Xiaogeng施正荣同样贡献了这项工作。

确认

本研究支持的资助来自中国的国家基础研究计划(30471917),中国高等教育的博士项目(20110171110058),广东科技拨款(2011 b050400031),和广东省自然科学基金(博士启动项目,9451040701003684)。