文摘

研究旨在探讨七氟醚预处理是否能防止小肠缺血再灌注(IIR)损伤和探讨肥大细胞(MC)是否参与七氟醚预处理所提供的保护。Sprague-Dawley老鼠暴露在七氟醚或处理MC稳定器色甘酸钠(CS)受到75分钟的肠系膜上动脉闭塞紧随其后两个小时再灌注的存在与否MC degranulator化合物48/80 (CP)。小肠缺血再灌注导致严重的肠道损伤,表现出显著海拔肠道损伤分数和p47^phox和gp91^phox,ICAM-1蛋白质表达和丙二醛和il - 6的内容,和MPO活动以及SOD显著减少活动,伴随着伴随增加的肥大细胞脱粒MC数显著增加,类胰蛋白酶的表情β己糖胺酶浓度,这些改变在CP的存在进一步调节。七氟醚预处理急剧衰减前IIR-induced改变除了MC,类胰蛋白酶,β己糖胺酶显著降低的CS治疗。此外,CP加剧了IIR废除了CS受伤但不是七氟醚预处理。七氟醚预处理数据都表明,授予保护对IIR受伤,和MC是没有参与保护的过程。

1。介绍

小肠缺血再灌注(IIR)损伤经常发生在许多临床条件,包括肠移植(1),肝移植,以及各种各样的冲击(2]。尽管先进的治疗方法已经应用于临床,与信息检索相关的死亡率仍然很高(3]。肥大细胞广泛存在在胃肠道;以前的研究表明,肥大细胞包括我们的IIR损伤的发病机制中发挥重要作用[4,5),肥大细胞抑制对IIR损伤提供了一种有前途的治疗方法。

小说七氟烷吸入麻醉,已广泛应用于手术的病人。除了其麻醉效果,目前一些研究已经表明,七氟醚预处理对缺氧的保护及缺血性脑和脊髓损伤6,7七氟醚预处理),此外,还提供了有前途的好处对心脏和肾脏的缺血/再灌注损伤(8,9]。相关的保护机制是减少白细胞浸润[10的差别,对这些基因的细胞凋亡(6,增强抗氧化酶(11]。然而,据我们所知,没有证据支持IIR受伤,七氟醚预处理的作用,这种现象的潜在机制仍不完全清楚。

几项研究到目前为止已经证明,七氟醚可以安全地用于病人诊断有肥大细胞增多症(一组罕见疾病造成太多的肥大细胞)的存在而不会引发肥大细胞脱颗粒,释放组胺,前列腺素、类胰蛋白酶和肝素(12]。相比之下,Annecke报道,七氟醚预处理可以减弱心脏缺血再灌注损伤没有抑制肥大细胞释放组胺(13]。然而,直接七氟醚预处理和肥大细胞脱颗粒之间的关系仍有待阐明。

在其中,我们旨在调查七氟醚预处理是否可以提供保护对IIR损伤;特别是,我们研究是否肥大细胞参与了七氟醚预处理所提供的保护,使用特定的肥大细胞degranulator(化合物48/80)和特定的稳定剂(色甘酸钠)的一种啮齿动物模型。

2。材料和方法

2.1。动物实验

女性Sprague-Dawley (SD)大鼠体重180 - 200克,从广东省动物中心购买(广州),分别被安置在wire-bottomed的笼子里,被放置在无菌条件下使用前一个星期。实验协议和设计批准的中山大学动物实验委员会和执行根据中山大学动物实验指南。所有的动物都被允许免费使用水和食物随意除了手术前16 h。老鼠被随机分为7组:(1)Sham-operated (SH),(2)独家信息检索(IIR), (3) IIR +复合48/80 (IIR + CP), (4) IIR +色甘酸钠(IIR + CS), (5) IIR +色甘酸钠+复合48/80 (IIR + CS + CP),(6)七氟醚+ IIR(塞+信息检索),和七氟醚+ IIR +化合物(7)48/80 (+ IIR + CP)签订。七氟醚预处理组的老鼠被暴露于大鼠2.3%七氟醚在气密麻醉室1小时为随后3天(根据先前的研究7];其他的老鼠被暴露于氧气。在第四天,老鼠被腹腔内注射10%的水合氯醛麻醉(3.5毫升/公斤)禁食16小时后,和腹部开了中线切口仰卧位;肠系膜上动脉(SMA)被孤立和阻挡75分钟用一个小夹子,然后夹释放维持大鼠再灌注期间为2 h IIR组。然而,Sham-operated组,SMA只是孤立的但不是夹和维护期间同期手术。色甘酸钠(肥大细胞稳定剂,50毫克/公斤)在缺血后15分钟,静脉注射和化合物48/80(肥大细胞degranulator, 0.75毫克/公斤)静脉注射通过尾静脉注射在5分钟之前释放夹的化合物48/80组。与此同时,相同体积的生理盐水对照组管理。代理的剂量调整符合我们之前的研究(5]。在手术期间,所有的小鼠的体温保持在38°C使用加热垫。和10毫升/公斤37°C生理盐水注射皮下注射,以避免脱水后腹部已经关闭。

2.2。组肠粘膜

在实验的最后,整个小肠被仔细,一段1.0厘米肠被切断从10厘米到回肠末端和固定在10%甲醛,然后嵌入石蜡部分。剩下的小肠是用0°C生理盐水彻底清洗,然后打开纵向公开肠道上皮细胞,冲洗后完全0°C生理盐水和用吸水纸擦干。粘膜层被温柔的刮收获一个板载玻片的上皮在冰上,然后存储在−进一步测量的70°C。

2.3。肠道组织学

五年μ米厚的部分准备从石蜡包埋肠组织,沾染了hematoxylin-eosin段小肠。和肠粘膜的损害评估由两个组织学家起初盲实验根据赵的标准(14]。赵的标准评分系统包括从5细分根据绒毛的变化和肠道粘膜腺:年级0,正常粘膜;牙龈Gruenhagen 1级,发展的空间的绒毛;二年级、扩展与温和的上皮提升的空间;三年级,大量上皮解除一些裸露的绒毛;4级,裸露的绒毛毛细血管暴露;五年级,固有层的瓦解,溃疡和出血。

2.4。检测内容的丙二醛(MDA)在小肠粘膜

小肠粘膜均质生理盐水。组织MDA含量、氧化应激介导的索引组织脂质过氧化反应,是由稍后通知方法(南京建成生物工程有限公司,中国)中描述(15]。组织匀浆中MDA的值表示为nmol /毫升。的内容最终MDA在小肠粘膜规范化组织重量。

2.5。检测超氧化物歧化酶(SOD)活性在小肠粘膜

小肠粘膜与生理盐水制成匀浆,冻结在−20°C 5分钟和离心机15分钟在4000 r / min。上层清液转移到新的管SOD活性的评价。SOD活性评估SOD按照制造商的指示检测试剂盒(南京建成生物工程有限公司,中国)。提出了组织重量的数据规范化。

2.6。测量β己糖胺酶水平血清

在实验的最后,2毫升的血液从下腔静脉,离心机15分钟在4000 r / min。上层清液、血清是储存在−20°C的决心β己糖胺酶水平使用先前描述的修改方法(16]。简单地说,50μL血清与50孵化μ1毫米p-nitrophenyl-N-acetyl - Lβ-D-glucosaminide溶解在0.1 M柠檬酸缓冲在96孔板(pH值5)37°C 1 h。反应是与200年终止了μL / 0.1的碳酸盐缓冲(pH值10.5)。405纳米的吸光度测量使用标。

2.7。西方墨点法

肠道粘膜样本均质与裂解缓冲30秒与液氮研钵和研杵。匀浆在13000转离心10分钟4°C和上层清液收集样本的蛋白质的来源。蛋白质免疫印迹分析处理标准方法中描述(17]。鼠单克隆antitryptase抗体,鼠单克隆anti-gp91^phox和anti-p47^phox抗体,鼠单克隆anti-ICAM-1和α微管蛋白的抗体得到从圣克鲁斯(圣克鲁斯、钙、美国)。二次抗体结合辣根过氧化物酶在稀释1:2000(圣克鲁斯、钙、美国)。免疫印迹孵化了一个增强化学发光检测系统(凯基生物生物技术,中国)和微分析使用一个软件数量。

2.8。测定il - 6在小肠粘膜的生产酶免疫分析法

简而言之,肠道蛋白质是由BCA测量试验设备由吉生物科技公司提供,南京,中国;结果表示为g / L。和il - 6的水平是衡量商业ELISA试剂盒制造商的指令(研发系统公司、美国)。吸光度是阅读450海里的生物运动学标模型EL340(美国Biotek工具);结果表示为pg / L;然后在小肠的il - 6水平计算pg /毫克的蛋白质。

2.9。测定髓过氧化酶(MPO)活动在小肠粘膜

髓过氧化酶(MPO)活动决心O-dianisidine方法(18),使用MPO检测设备(南京建成生物工程研究所),我们描述19]。MPO活性被定义为酶降解的数量1μ过氧化氢的摩尔每分钟在37°C和表达单位每克的重量湿组织。

2.10。评估在小肠肥大细胞计数

五μ米厚的部分是准备从石蜡包埋肠组织;deparaffinization之后,内源性过氧化物酶就熄了3%的H₂O₂在去离子水为10分钟。非特异性结合位点被孵化部分10%的正常兔血清1 h。部分被孵化与多克隆鼠antimast细胞类胰蛋白酶(稀释1:2000年,圣克鲁斯、钙、美国)为20分钟37°C,其次是孵化与生物素化的鼠标anti-rat免疫球蛋白在室温下10 - 15分钟。3×5分钟PBS漂洗后,horseradish-peroxidase-conjugated链霉亲和素的解决方案是添加和孵化在室温下10 - 15分钟。抗体结合位点被孵化与diaminobenzidine-H可视化₂O₂解决方案。孵化的部分用PBS代替主要的抗体作为消极的控制。褐黄色颗粒在细胞质被公认为阳性染色类胰蛋白酶。我们计算了在五个随机选择的领域积极肥大细胞类胰蛋白酶×200放大Image-Pro + 5.0(美国)。

2.11。统计分析

(除了生存曲线)的数据被表示为±SEM。方差分析是使用Graphpad棱镜执行软件。单向方差分析是用于多个比较,其次是Bonferroni和学生以及对未配对的价值观。存活率是表示为活体动物的比例,和曼特尔考克斯日志等级测试是用来确定生存曲线之间的差别。一个值小于0.05被认为是显著性差异。

3所示。结果

3.1。七氟醚预处理对小鼠存活率的影响存在与否的挑战IIR肥大细胞激活剂

最初,我们试图探索在IIR受伤七氟醚预处理的作用;与七氟烷预处理大鼠显示与IIR组相比无显著差异。我们也试图探讨肥大细胞抑制是否参与七氟醚预处理诱导的好处;柱状细胞特殊的稳定剂和活化剂被处理为积极的和消极的对照组。如图1,激活肥大细胞的化合物48/80导致显著降低2 h后存活率夹释放与唯一的IIR组相比,显著和稳定肥大细胞废除了减少2 h生存化合物引起的48/80;相比之下,七氟醚不减弱复合48/80的预处理介导缺血后存活率的恶化老鼠进行信息检索。这些数据进一步表明,肥大细胞脱粒加剧IIR受伤,和七氟醚预处理结果给我们的第一印象,可能不会对肥大细胞稳定作出贡献。

3.2。七氟醚预处理对大鼠小肠结构的影响进行信息检索存在与否的肥大细胞激活剂

因为没有差异2 h生存IIR群,IIR + CS组,和塞+ IIR集团,我们接下来,试图定义的进一步影响七氟醚预处理对IIR损伤及其与肥大细胞的关系。获得的部分小肠损伤严重程度的评价他染色实验结束时,75分钟缺血再灌注2小时时,导致严重损害小肠;如图2中,观察到了多个侵蚀和出血IIR集团,而化合物48/80进一步加重IIR受伤证明更多的多个糜烂和出血和炎性细胞次削减的IIR + CP组,而绒毛和腺是正常的,没有炎症细胞浸润在粘膜上皮细胞层观察到Sham-operated组。肥大细胞稳定剂和七氟醚同样显著减毒伤害在小肠粘膜绒毛,只有轻微的水肿和发现了一些坏死的上皮炎症细胞的浸润在粘膜上皮细胞层显微镜评估在CS或七氟醚治疗组。然而,色甘酸钠,但七氟烷屏蔽复合48/80-induced恶化在再灌注后2小时时小肠形态学变化。与形态学变化一致,赵的分数明显增加信息检索与Sham-operated组相比,治疗组肥大细胞degranulator化合物48/80后缺血导致进一步增加在赵的分数。色甘酸钠和七氟醚同样降低了赵的分数;值得注意的是,色甘酸钠,但七氟烷化合物48/80(所带来的极大地限制了变更,IIR + CS + CP和IIR + CP组)。

3.3。七氟醚预处理对肥大细胞脱颗粒的影响在大鼠小肠的存在与否进行IIR肥大细胞激活剂。

类胰蛋白酶和β己糖胺酶是肥大细胞释放独特的标记和海拔高度可以认为是肥大细胞脱粒。如图3,再灌注2 h后,我们发现类胰蛋白酶蛋白质表达和β己糖胺酶水平,以及肥大细胞计数,在集团IIR大大增加与Sham-operated组相比,复合48/80导致进一步的肥大细胞脱粒作为类胰蛋白酶蛋白表达显著增加,β己糖胺酶水平,肥大细胞计数观察IIR + CP组比IIR组;正如所料,肥大细胞稳定剂CS不仅减毒引起的upregulations IIR,还废除了加重由化合物48/80。有趣的是,与七氟烷预处理大鼠表现出没有减少类胰蛋白酶蛋白表达,β己糖胺酶水平,引起肥大细胞计数IIR挑战;此外,改变进一步加重的化合物48/80尽管七氟醚预处理,与丁基橡胶+ CP组。总的来说,从目前的研究结果表明,肥大细胞脱粒加剧IIR损伤和肥大细胞稳定是没有参与七氟醚预处理所提供的保护。

3.4。七氟醚预处理对中性粒细胞轧制的影响在大鼠小肠的存在与否进行IIR肥大细胞激活剂

IIR损伤的特点是中性粒细胞浸润到炎症组织(20.),如图4;与之前的结果相一致(20.),我们还发现,IIR导致显著增加MPO活性和ICAM-1蛋白质表达与Sham-operated组;此外,化合物48/80导致MPO进一步增加活动和ICAM-1蛋白表达在IIR + CP组比组信息检索。政府与色甘酸钠和七氟醚同样显著地抑制中性粒细胞浸润MPO活动和ICAM-1差别/激活了对这些基因的蛋白表达诱导信息检索。值得注意的是,肥大细胞稳定剂,但七氟烷阻止化合物48/80介导恶化的IIR减少中性粒细胞浸润。

3.5。七氟醚预处理对炎症的影响在大鼠小肠的存在与否进行IIR肥大细胞激活剂

炎性细胞因子、白介素6 (il - 6),已被证明是涉及信息检索损伤的发病机理(21]。如图5在当前的研究中,老鼠接受75分钟缺血和再灌注2小时时增加il - 6水平在小肠粘膜组IIR而Sham-operated组;此外,政府与化合物48/80进一步导致显著增强il - 6水平IIR + CP(组与集团信息检索。肥大细胞稳定剂色甘酸钠和七氟醚同样极大地废除了增加il - 6水平;然而,色甘酸钠,但七氟烷阻止il - 6水平的增强使得信息检索存在的MC激活化合物48/80。

3.6。七氟醚预处理对氧化应激的影响在大鼠小肠的存在与否进行IIR肥大细胞激活剂

由于肥大细胞抑制是没有参与保护由七氟醚预处理诱导,我们寻求其他的潜在机制,七氟醚预处理对信息检索提供了好处。缺血再灌注损伤也表现为上调自由基物种(17]。与以前的结果一致(22),如图6,75分钟缺血再灌注2小时时导致大幅降低MDA含量和SOD活动与Sham-operated组。与此同时,信息检索在gp91也造成了极大的增加^phox和p47^phox蛋白表达与Sham-operated相比。此外,化合物48/80进一步加重氧化应激诱导的变化信息检索(IIR + CP和IIR);相比之下,色甘酸钠和七氟醚类似的减毒IIR介导的氧化应激通过MDA含量和gp91表达下调^phox和p47^phox蛋白质表达和调控的SOD活动色甘酸钠和七氟醚治疗组与组相比信息检索。此外,色甘酸钠有限氧化应激诱导的进一步增加化合物48/80。正如所料,七氟醚预处理展出并没有对化合物48/80加剧了氧化应激保护作用。

4所示。讨论

我们展示了在目前的研究中,据我们所知,第一次,七氟醚预处理减毒小肠缺血再灌注损伤;抑制中性粒细胞封存可能代表七氟醚预处理减轻IIR损伤的主要机制。进一步,我们表明,随后的肥大细胞激活的恶化导致显著增加肠道损伤IIR受伤证明了分数和海拔在缺血后氧化应激和嗜中性粒细胞次削减,导致显著降低缺血后生存;稳定肥大细胞,色甘酸钠不仅大大减毒IIR受伤,但也完全阻塞加剧损伤诱导的肥大细胞激活。相比之下,我们发现七氟醚预处理在肥大细胞介导IIR损伤提供任何保护。

肥大细胞,包含很大范围的介质,在胃肠道。尽管肥大细胞可能函数作为宿主防御,防止细菌入侵(23),长期MC激活已被证实能导致多种疾病的发展和发挥重要作用的发病机理的IIR伤释放组胺,类胰蛋白酶,TNF -α(24]。拉莫斯等人报道,肥大细胞脱粒脓毒症的发展中起着重要作用通过调节细胞死亡,导致multiorgan功能障碍(25]。符合先前的调查结果,稳定MC从脱粒的一个潜在的战略打击IIR损伤(26),我们目前的研究进一步表明,从激活/抑制肥大细胞脱颗粒,色甘酸钠显著限制了IIR受伤证明增加缺血后生存和蛋白质表达和减少类胰蛋白酶β己糖胺酶的水平,导致或加剧IIR受伤;这个概念进一步支持的事实,肥大细胞稳定剂色甘酸钠废除了加剧损伤引起化合物48/80。数据从当前的研究进一步证实,肥大细胞激活中起着重要的作用加剧了IIR受伤,尽管执政肥大细胞活化机制在信息检索还有待探索。

无法控制炎症和中性粒细胞封存在发炎组织也有助于IIR受伤,和selectins激活内皮细胞间粘附分子(icam)的诱导中性粒细胞迁移到有害的网站(27]。康普顿等人报道,类胰蛋白酶释放肥大细胞脱粒过程中扮演着重要的角色在吸引白细胞渗透和迁移到缺血组织(28]。与肥大细胞稳定剂色甘酸钠和治疗可以减少肺部ICAM-1的表情pancreatitis-associated肺损伤的大鼠模型和表达下调il - 6水平(29日]。这些发现指出,肥大细胞脱颗粒的重要性,通过增加释放促炎介质,在诱导中性粒细胞迁移到炎症组织。在目前的研究中,我们发现,在信息检索中,肥大细胞脱粒导致更多的中性粒细胞浸润到小肠证明MPO活性显著海拔,ICAM-1蛋白表达,和il - 6的浓度;最重要的是,色甘酸钠废除了IIR和阻止化合物引起的改变48/80-mediated IIR伤害的恶化。

之前的研究报道,七氟醚预处理可以防止从主动脉局部缺血和再灌注引起的急性肺损伤肺中性粒细胞减少积累(10]。我们还发现,七氟醚预处理明显下调MPO活动,ICAM-1蛋白表达,和il - 6浓度,表明抑制中性粒细胞封存和随后的系统性炎症可能衰减IIR损伤的潜在机制。众所周知,延误诊断和治疗IIR损伤导致的持续高住院死亡率(30.];从目前的研究结果表明,预防管理七氟醚可能是一种很有前途的方法在减轻术后肠道缺血和死亡率。

七氟醚是一种更可取的选择临床确诊的病人有肥大细胞增多症,一群罕见疾病的存在造成太多的肥大细胞和CD34 +肥大细胞前体,没有诱导肥大细胞脱粒[12]。众所周知,七氟醚可以模仿短暂缺血性事件的影响和保护缺血/再灌注损伤;Annecke和七氟醚预处理组表明,显著减轻缺血再灌注损伤的体外模型组胺的心没有改变,和七氟醚预处理研究结果建议提供的好处是没有参与肥大细胞(13]。在当前的研究中,我们调整暴露大鼠1 MAC七氟醚1 h在三天的肥大细胞活化剂的存在与否。从目前的研究结果显示,七氟醚预处理大大减毒IIR受伤证明中性粒细胞减少损伤分数和下调的入渗和炎症;然而,这些保护措施由肥大细胞激活化合物48/80逆转,而肥大细胞稳定剂色甘酸钠仍授予保护受到化合物48/80。本研究的数据表明,七氟醚预处理的保护作用是抑制肥大细胞的独立。

生产过剩NADPH氧化酶的活性氧化物种(ROS)通常被认为是发挥重要作用在缺血再灌注损伤的病理机制,并有许多NADPH同系物,如Nox1 Nox2(也称为gp91^phox),Nox3-4 [31日]。应该指出的是,Nox2是主要表达在上皮细胞内。关等人证明了细胞内NADPH浓度,迅速在肠道绒毛顶端细胞明显增加即使短期缺血(32]。七氟醚预处理Bedirli等人最近报道,大大减弱了氧化应激在脓毒症的老鼠模型33];此外,杨等人已经证明,通过提高抗氧化酶(七氟醚预处理赋予神经保护11]。与前面的结果一致,我们还发现,75分钟小肠缺血再灌注和2小时时导致MDA水平显著增加,gp91^phox和p47^phox蛋白质表达,导致显著降低SOD活动,此外,预处理的IIR-rats七氟醚显著减少了IIR介导的改变,表明七氟醚预处理授予对IIR受伤可能通过减少氧化应激的保护。

除了IgE / Fcε,经典信号通路的肥大细胞激活和几个不同的nonimmunological也刺激肥大细胞激活(34),包括创伤和身体压力。Yoshimaru等人证明了体外,调节活性氧激活肥大细胞NADPH氧化酶(35],Collaco等人已经表明,抑制活性氧可以显著稳定肥大细胞在体外(36];我们之前发现显著增加的肥大细胞激活和伴随的海拔在氧化应激在啮齿动物受到信息检索(22]。结果表明,肥大细胞激活和过氧化物生产之间存在联系。我们当前的研究扩展先前的研究的结果(22)通过显示在信息检索中NADPH氧化酶是过表达的增加了氧化应激和MC激活,导致恶化的IIR受伤,与肥大细胞稳定剂和预处理大鼠色甘酸钠不仅减少了MC激活,还减毒NADPH氧化酶超表达,减少活性氧的生产,因此减毒IIR损伤和提高生存率。与七氟烷预处理大鼠显示明显的海拔在氧化应激IIR的肥大细胞激活剂化合物48/80;结果符合凯达等人的研究结果报道,肥大细胞脱粒本身有助于增加氧化应激(37]。

当前研究的局限性是,我们并没有显示直接七氟醚预处理和嗜中性粒细胞迁移之间的关系发展的IIR受伤;到目前为止,一些研究证实,七氟醚预处理可以抑制中性粒细胞浸润到缺血区域(10];其中,本研究没有关注底层机制七氟醚预处理影响中性粒细胞封存。

在总结中,我们已经表明,肥大细胞激活,通过增加释放介质,导致有害的损伤引起的IIR和肥大细胞稳定剂抑制肥大细胞激活,变弱IIR伤害,并提高缺血后死亡率;七氟醚预处理变弱IIR受伤可能通过阻止中性粒细胞封存,降低氧化应激,但不是通过抑制肥大细胞,而底层机制值得进一步研究。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

苏Xiaoliang Gan和光洁了同样的工作。

承认

这项研究得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金委),批准号30901408。